Metil-binding cattura sequenziamento del DNA per tessuti del paziente

Riepilogo

Qui vi presentiamo un protocollo per indagare genoma metilazione del DNA in studi clinici di screening dei pazienti su larga scala utilizzando il metil-Binding sequenziamento del DNA di cattura (MBDCap-ss o MBD-ss), la tecnologia e la successiva analisi bioinformatica pipeline.

Abstract

La metilazione è una delle modificazioni epigenetiche essenziali al DNA, che è responsabile per la precisa regolazione dei geni necessari per lo sviluppo stabile e differenziazione dei diversi tipi di tessuto. Disregolazione di questo processo è spesso il segno distintivo di varie malattie come il cancro. Qui, si delineano uno dei recenti tecniche di sequenziamento, Metil-Binding DNA Capture sequenziamento (MBDCap-ss), utilizzato per quantificare la metilazione in vari tessuti normali e di malattia per i grandi coorti di pazienti. Descriviamo un protocollo dettagliato di questo approccio arricchimento affinità con un oleodotto bioinformatica per raggiungere quantificazione ottimale. Questa tecnica è stata utilizzata per sequenziare centinaia di pazienti in vari tipi di cancro come parte del progetto 1.000 methylome (Cancer Methylome System).

Introduzione

Regolazione epigenetica di geni attraverso metilazione del DNA è uno dei meccanismi essenziali necessari per determinare il destino della cellula dalla differenziazione stabile di diversi tipi di tessuto nel corpo ^1. Disregolazione di questo processo è stato conosciuto per causare varie malattie tra cui il cancro ^2.

Questo processo comporta principalmente l'aggiunta di gruppi metilici sul residuo citosina in dinucleotidi CpG del DNA ^3. Esistono alcune tecniche diverse attualmente utilizzate per indagare questo meccanismo, ciascuno con i propri vantaggi come indicato in molti studi ^2-8. Qui discuteremo una di queste tecniche chiamati Metil-Binding DNA Capture sequenziamento (MBDCap-ss), dove utilizziamo una tecnica di affinità arricchimento per identificare le regioni metilato del DNA. Questa tecnica si basa sulla capacità metil-legame della proteina MBD2 per arricchire i frammenti di DNA genomico contenenti denaturato siti CpG. Utilizziamo un kit di arricchimento DNA metilato commercialeper l'isolamento di tali regioni metilati. Il nostro laboratorio ha proiettato in centinaia di campioni di pazienti con questa tecnica e qui mettiamo a disposizione un protocollo ottimizzato completo, che può essere utilizzato per studiare grandi coorti di pazienti.

Come evidente con qualsiasi tecnologia di sequenziamento di prossima generazione, MBDCap-ss richiede anche un approccio bioinformatico specifiche al fine di quantificare con precisione i livelli di metilazione attraverso i campioni. Ci sono stati molti studi recenti, nel tentativo di ottimizzare il processo di normalizzazione e l'analisi dei dati di sequenziamento ^{9, 10.} In questo protocollo, dimostriamo uno di questi metodi di attuazione di un approccio unico di recupero lettura - LONUT - seguita dalla normalizzazione lineare di ogni campione, al fine di consentire il confronto imparziali attraverso gran numero di campioni di pazienti.

Protocollo

Tutti i tessuti sono ottenuti a seguito approvazione del comitato Institutional Review Board e quando tutti i partecipanti acconsentito ad entrambe le analisi molecolari e studi di follow-up. I protocolli sono approvati dal Comitato studi sugli esseri umani presso l'Università del Texas Health Science Center a San Antonio.

1. Metil-legame al DNA di cattura (MBDCap)

1. Raccolta dei campioni e l'isolamento del DNA
   1. Raccogliere tumore alla rinfusa o normali campioni di tessuto da campioni di tessuto inclusi in paraffina paziente.
   2. Utilizzare un mini DNA kit commerciale per isolare DNA genomico da campioni di tessuto inclusi in paraffina secondo il protocollo del produttore.
   3. Utilizzare un kit di arricchimento DNA metilato con la procedura qui descritta secondo il protocollo del produttore.
2. Lavaggio tallone iniziale
   Nota: Le perle sono impiegati per accoppiare con MBD-biotina proteine, che rileva la metilazione del DNA sul genoma. Perle di solito sono sospesiin una soluzione madre. Utilizzare questa procedura per lavare questo liquido.
   1. Risospendere il magazzino di perline streptavidina (vedi Materiali Tavolo) pipettando gentilmente su e giù per ottenere una sospensione omogenea. Non mescolare le perline nel vortex.
   2. Per uno mg di DNA di ingresso, Add10 ml di perline per un tubo con 90 ml di 1x Bind / tampone di lavaggio. Ruotare per 1 min. Non mescolare nel vortex.
   3. Posizionare il tubo (s) su un sostegno magnetico per 1 min.
   4. Rimuovere il liquido con una pipetta e scartare il liquido.
   5. Aggiungere 250 ml di 1x Bind / tampone di lavaggio ai talloni e ruotare per 1 min.
   6. Ripetere i punti 1.2.3 - 1.2.5 due volte.
3. Accoppiamento la proteina MBD-biotina alle perline
   1. Per 1.2 mg di DNA di input, aggiungere 7 ml (3,5 mg) di proteine ​​MBD-biotina ad ogni provetta.
   2. Aggiungere 93 ml di 1x Bind / tampone di lavaggio alla proteina di fare un volume finale di 100 ml.
   3. Mescolare il perline-proteinacomposto su un agitatore rotante a temperatura ambiente per 1 h.
4. Frammentato DNA (ingresso)
   1. DNA Sonicare con l'aggiunta di 1,2 mg di DNA genomico totale in 96 ml di tampone TE e 24 ml di tampone di 5x / lavaggio Bind per ottenere una soluzione di 120 ml. Utilizzare 30 s ON potenza e 30 s OFF alimentazione durante sonicazione, 20 - 25 volte.
   2. Eseguire 1 ml di soluzione di DNA sonicato utilizzando un sistema bioanalyzer con un kit commerciale DNA alta sensibilità per controllare la dimensione dei frammenti per essere nell'intervallo di: 150 - 350 bp secondo il protocollo del produttore.
5. Lavare le MBD-perline
   1. Posizionare il tubo contenente MBD-perline su un sostegno magnetico per 1 minuto.
   2. Rimuovere e gettare il liquido con una pipetta senza toccare le perline.
   3. Risospendere le sfere con 250 ml di 1x Bind / tampone di lavaggio.
   4. Mescolare le perline su un agitatore rotante a temperatura ambiente per 5 min.
   5. Ripetere i punti 1.5.1 - 1.5.4 due volte.
6. Reazione di cattura del DNA frammentato (1 mg DNA di ingresso)
   1. Trasferire la miscela di DNA / Buffer alla provetta contenente le MBD-perline.
   2. Mescolare le MBD-perline con il DNA su un agitatore rotante per 1 ora a RT. In alternativa, mescolare O / N a 4 ^° C.
7. Rimozione di DNA non catturato dalle perline
   1. Dopo la miscelazione il DNA e MBD-perline, posizionare il tubo sul sostegno magnetico per 1 min di concentrare tutte le perline sulla parete interna del tubo.
   2. Rimuovere il surnatante con una pipetta e salvarlo in un free-DNasi provetta pulita microcentrifuga come DNA nonmethylated. Conservare questo campione sul ghiaccio.
   3. Aggiungere 200 ml di 1x Bind / tampone di lavaggio per le perline per lavare le perline.
   4. Mescolare le perline su un agitatore rotante per 3 min.
   5. Posizionare il tubo sul sostegno magnetico per 1 min.
   6. Rimuovere il liquido con una pipetta e salvarlo in una provetta.
   7. per capture reazioni di ≤1 mg di DNA di ingresso, ripetere i punti 1.7.3 - 1.7.6 per altre 2 frazioni di lavaggio in totale.
8. Eluizione frazione singolo
   1. Mescolare buffer di basso contenuto di sale con tampone alto contenuto di sale (1: 1) per ottenere tampone di eluizione (1.000 mm NaCl).
   2. Risospendere le sfere in 200 microlitri di tampone di eluizione (1.000 mm NaCl).
   3. Incubare le perline su un miscelatore rotante per 3 min.
   4. Posizionare il tubo sul sostegno magnetico per 1 min.
   5. Con il tubo in posizione sulla griglia magnetica, rimuovere il liquido con una pipetta senza toccare le perle con la punta della pipetta, e salvarla in un 1,5 ml provetta senza DNasi pulito. Conservare questo campione sul ghiaccio.
   6. Ripetere i punti 1.8.1 - 1.8.4 volta, raccogliendo il secondo campione nella stessa provetta (volume totale sarà di 400 microlitri). Conservare il campione in pool sul ghiaccio.
9. Etanolo precipitazioni (cleanup DNA)
   1. Per ogni noncaptured, lavaggio, e eluizione frazione from i passaggi precedenti, aggiungere 1 ml di glicogeno (20 mg / mL, incluso nel kit), il volume 1/10 campione di sodio acetato 3M, pH 5.2 (ad esempio, 40 ml per 400 ml di campione) e 2 volumi di campione di 100% etanolo (ad esempio, 800 microlitri per 400 microlitri di campione). Il volume totale è di 1.241 ml.
   2. Mescolare bene e incubare a -80 ^° C per almeno 2 ore.
   3. Centrifugare la provetta per 15 min a 11.363 xg a 4 ^° C.
   4. Eliminare attentamente il surnatante senza disturbare il pellet.
   5. Aggiungere 500 ml di freddo il 70% di etanolo.
   6. Centrifugare la provetta per 5 minuti a 11.363 xg a 4 ^° C.
   7. Eliminare attentamente il surnatante senza disturbare il pellet.
   8. Ripetere i punti 1.9.6 - 1.9.7 volta e rimuovere ogni residuo di surnatante rimanente.
   9. Far asciugare il pellet per ~ 5 min. Non asciugare completamente il pellet.
   10. Risospendere il pellet di DNA in 37,5 ml di acqua priva di DNasi o altroadeguato volume di tampone.
   11. Posizionare il DNA su ghiaccio o conservare il DNA a -20 ^° C o al di sotto fino a nuovo uso.
   12. Verificare che la quantità totale di DNA è superiore a 20 ng, (ad esempio, usare il sistema di quantificazione fluorimetrica, vedi Materiali Tavolo).

2. Sequencing

1. Utilizzare i frammenti di DNA recuperati dalla procedura MBDCap per il sequenziamento. Per ogni campione da sequenziato, un importo totale di 20 - 40 ng DNA è necessario per la preparazione biblioteca.
2. Per la preparazione biblioteca DNA-Seq usare un sistema di costruzione di biblioteche completamente automatizzato (vedi Materiali Tavolo) e seguire il protocollo standard fornito dal produttore. Selezionare i frammenti di DNA di dimensioni 200-400 bp per la preparazione biblioteca. Il sistema di preparazione biblioteca di automazione permette di standardizzare la procedura di preparazione biblioteca e riducendo al minimo la variazione tra i campioni a causa di preparazione manuale.
3. Utilizzare l'adattatore Primers e portare a concentrazione 100x. Di questo, utilizzare 10 microlitri per ogni campione.
4. Seguendo passo 2.2, prendere la reazione, e quantificare la libreria di DNA-ss utilizzando un sistema di quantificazione fluorimetrico (vedi Materiali Tavolo).
   1. Impostare procedura di amplificazione PCR. La scelta di PCR master mix è di migliorare l'efficienza della PCR di GC arricchito regione del genoma. In un tubo di PCR, aggiungere biblioteca 15 microlitri di DNA-ss, 25 microlitri PCR Master Mix (vedi Materiali Tavolo), 2 microlitri PCR Primer Mix (vedi Materiali Tavolo), e 8 ml H ₂ O.
5. Seguire raccomandazione PCR dal produttore del master mix PCR, alterando i tempi di ciclismo e le temperature per diversi materiali di partenza: 98 ^° C per 45 s, X cicli di 98 ^° C per 15 s, 65 ^° C per 30 s, 72 ^° C per 30 s, quindi 72 ^° C per 1 min. Tenere a 4 ^° C.
   1. Perform abbastanza cicli di finire con 2-10 nM di DNA biblioteca (8 - 10 cicli).
6. Pulire reazione PCR con rapporto 1: 1 di PCR perline purificazione secondo il protocollo del produttore (vedi Materiali Tavolo).
7. Eluire con 20 - 30 microlitri di tampone di eluizione.
8. Codice a barre ogni campione e piscina 4 campioni insieme in una corsia di una cella di flusso. Utilizzare il 50 bp unico protocollo lettura standard per il sequenziamento (vedi Materiali Tavolo).

3. Analisi Bioinformatica

Nota: ulteriore processo i file FASTQ grezzi ottenuti dal sequenziamento per eseguire il controllo qualità e la mappatura delle brevi sequenze di DNA (legge) al genoma.

1. Usa Bowtie breve lettura di allineamento, strumento di mappatura del genoma su ciascun file di esempio FASTQ per mappare la legge per il genoma di riferimento. Molti strumenti di mappatura di lettura sono a disposizione per eseguire questo passaggio e può essere utilizzato in base alle preferenze individuali.
   1. Attendere fino a 2 disallineamenti nel da te legge mentre la mappatura del genoma di riferimento. Segnala fino a 20 migliori allineamenti per ogni lettura. Ad esempio, utilizzare papillon -v 2 --migliore -k 20 --chunkmbs 200 .
2. Utilizzare LONUT ⁹ di recuperare il moltiplicano mappato legge per migliorare l'individuazione delle regioni arricchite. Per ogni lettura, al più un allineamento potrebbe essere recuperato quando è abbastanza vicino a qualsiasi delle sopra dette picchi. Ad esempio, utilizzare: perl lonut.pl -g hg19 -w 250 -p 99 . LONUT eseguirà le seguenti operazioni.
   1. allineamenti diviso in mappati in modo univoco legge e si moltiplicano mappati legge. Picco di chiamate sulla mappata univocamente legge utilizzando picco chiamante nastro ^11. L'opzione -w 250 e -p 99 nel comando esempio sono per la cintura.
   2. Combina in modo univoco mappato legge con il recuperato letture ottenuto da LONUT, e il combinato legge, in formato LETTO, verranno utilizzati in ulteriori analisi. Calcolare il numero di CombinEd legge per il futuro la normalizzazione.
3. Bin la legge. Estratto di legge nella regione di interesse utilizzando script perl: perl methyPipeline.pl up -dn . Per ogni file letto elencato nel sampleInfoFile, lo script perl esegue i compiti di seguito.
   Nota: Vedere file di codifica supplementare per lo script Perl.
   1. Bin la legge in formato bin fisso, ad esempio, 100 bp, per 24 cromosomi.
   2. Per ogni gene specificato nel refGeneFile, estrarre i cassonetti intorno sito di inizio della trascrizione (TSS), fino alla lunghezza estensione specificata da un'opzione up e -dn. Ad esempio, estrarre i dati nella regione che è a monte ea valle 4 kb di TSS. A bin dimensioni 100 bp, questo estratto i dati hanno 81 bidoni, e il bidone centrale corrisponde al TSS.
   3. Per il gene sul filamento antisenso, capovolgere la regione estratta da sinistra a destra in modo che bidoni monte sono sempre placed sulla sinistra con lo script Perl.
   4. Ulteriori dividere il TSS ± ​​regione 4 kb in tre regioni sub: a sinistra, a monte 4 kb a monte 2 kb; Medio, a monte ea valle 2 kb; A destra, a valle 2 kb a 4 KB.
   5. Per ogni campione, dividere il conteggio di legge in ogni bin per il numero totale di combinati mappato letture calcolato 3.3.3. La normalizzazione eliminerà la specifica del campione leggere differenze e permette di confrontare la legge attraverso diversi campioni.
4. Eseguire lo script bash (come indicato nel file script) per eseguire test statistico sul normalizzato letture ottenuti nella regione sinistra, per individuare metilazione differenziale tra normale e cassa gruppo nelle regioni descritti come nella regione del fianco.
   Nota: Vedere il file di codifica supplementare per lo script bash. Sulla base delle regioni che sono differenzialmente metilati, vi sono sette combinazioni:
   Tutta la regione: metilazione differenziale in tutta la TSS ± ​​regione 4 kb
   middleLeft: differenziale metilazione sia in regione centrale e di sinistra
   MiddleRight: differenziale metilazione nella regione sia centro e destra
   Fianco: differenziale metilazione sia in regione a destra ea sinistra
   A sinistra: metilazione differenziale nella regione solo a sinistra
   A destra: differenziale metilazione nella regione solo a destra
   Medio: differenziale metilazione nella regione centrale solo
5. Utilizzare lo stesso script bash per visualizzare la metilazione differenziale in una trama tornado. Tracciare le iper e ipo geni metilati su un pannello separato, e ordinare nell'ordine della combinazione regione come descritto in 3.4, rispettivamente.

Risultati

Abbiamo usato MBDCap-seq per studiare alterazioni di metilazione del DNA in un gran numero di pazienti da diversi tipi di cancro compresi seno ^12, dell'endometrio ^13, prostata ^14, e tumori del fegato, tra gli altri. Qui mostriamo alcune informazioni dallo studio del cancro al seno pubblicato di recente ^12. In questo caso, abbiamo utilizzato l'intero approccio di sequenziamento del genoma per identificare isole CpG che sono differenziale metilato nei tumori rispetto al normale nelle diverse...

Discussione

La tecnica MBDCap-seq è un approccio arricchimento affinità ^3, considerata un'alternativa economica nell'ambito delle indagini coorti con un grande numero di pazienti ^15. Il gasdotto presentato qui descrive un approccio globale da approvvigionamento di esempio per l'analisi e l'interpretazione dei dati. Uno dei passi più importanti è la creazione di una procedura di amplificazione PCR per migliorare l'efficienza della PCR delle regioni GC arricchito nel genoma come questo è dove si verifica la ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylminer DNA enrichment Kit	Invitrogen	ME10025
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen	112-05D
Bioruptor Plus Sonication Device	diagenode	B01020001
3 M sodium acetate, pH 5.2	Sigma	S7899	100 mL
SPRIworks Fragment Library System I	Beckman Coulter	A50100	Fully automated library construction system
Adapter Primers	Bioo Scientific	514104	PCR primer mix
Qubit	Invitrogen	Q32854	Fluorometric Quantitation System
PCR master mix	KAPA scientific	KK2621	PCR master mix
AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	PCR Purification beads
EB Buffer	Qiagen	19086
HiSeq 2000 Sequencing System	Illumina