Trasduzione retrovirale di cellule progenitrici del midollo osseo per generare cellule T del recettore Retrogenic Mice

Riepilogo

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Abstract

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCRα and TCRβ chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

Introduzione

Recettore delle cellule T (TCR) repertorio di esseri umani e topi è stato stimato a 1 x 10 ⁸ e 2 x 10 ⁶ TCR unici rispettivamente ^1,2. Questa grande diversità permette cellule T di riconoscere una vasta gamma di epitopi antigenici derivati ​​da auto-peptidi e da agenti patogeni presentati dal complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) sulle cellule presentanti l'antigene (APC). Le sottili differenze nelle interazioni dei TCR con unici complessi peptide-MHC determinano se una cellula T subirà apoptosi, anergia, l'attivazione, la differenziazione, la produzione di citochine e citotossicità. Tuttavia, a causa della grande repertorio TCR, analisi di come una determinata TCR risponderà a un particolare antigene richiede l'utilizzo di sistemi singoli TCR.

Vari topi transgenici TCR sono state generate per studiare la funzione di un singolo TCR in un modello in vivo ^3-9. Tuttavia, ci sono avvertimenti di TCR topi transgenici compresa lacosto, la lunghezza di tempo per generare un singolo topo transgenico e il cosiddetto effetto fondatore di inserimento transgene casuale nel DNA germinale ^10. Pertanto, relativamente pochi topi transgenici TCR sono stati generati per un dato antigene e le implicazioni funzionali di alta e bassa affinità TCR per lo stesso epitopo sono raramente affrontati. Per affrontare la necessità di un avvicinamento rapido alla schermata e studiare più TCR singolarmente o in combinazione, topi retrogenic ( 'retro' da retrovirus e 'geniche' dal transgenici) sono stati utilizzati come alternativa al TCR topi transgenici ^11-13.

Il motivo di consenso 2A peptide trovato all'interno di diversi virus sono costituiti da un 2A-Asp-Val / Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro, in cui scissione avviene tra la glicina del 2A e prolina del 2B da cis -acting attività idrolasi, con conseguente salto ribosomiale durante la traduzione ^10,14-16. Per uno schema dettagliato raffigurante la cleavage dei vari peptidi 2A (F2A, E2A, T2A e P2A) consultare i riferimenti 10 - 12. In questo modo, 2 cistroni (TCR alfa e beta TCR) possono essere collegati con conseguente traduzione stechiometrica in un singolo vettore. Utilizzando questo approccio, siamo in grado di esprimere e confrontare direttamente più TCR specifici antigeni in vivo.

Protocollo

Etica Dichiarazione: Ogni sforzo è fatto per mantenere il disagio degli animali o di stress al minimo durante l'irradiazione e la coda vena iniezioni. I topi sono utilizzati come fonte di cellule in questi esperimenti; in quanto tale, non ci sono procedure o manipolazioni a parte l'eutanasia. I topi saranno sacrificati da CO ₂ inalazione seguita da dislocazione cervicale per confermare la morte. Questa procedura è coerente con le raccomandazioni del gruppo sull'eutanasia della American Veterinary Medical Association.

1. Preparare retrovirale Construct

1. Sotto-clone catene del recettore delle cellule T (TCR) alfa e beta, separati da un linker 2A, in un MSCV basata retrovirale ¹¹ vettore (ad esempio, pMIAII o pMIGII) ^11.
   NOTA: Il linker 2A permette di espressione stechiometrica e concorde delle catene alfa e beta TCR da un singolo fotogramma open reading. Il vettore comprende una cassetta IRES fluorescent proteina (ametrine o GFP) che viene utilizzato permonitorare le cellule trasdotte e efficienza di trasduzione. Per un protocollo dettagliato si rimanda Holst et al. ¹¹
2. Isolare plasmidi DNA utilizzando commercialmente ottenuto kit di preparazione al plasma o un prodotto simile. Utilizzare una concentrazione di lavoro di 1 - 2 mg ml ^-1.

2. Generazione di retrovirali produttrice di celle Lines

1. Utilizzare un processo in due fasi per produrre linee cellulari produttore retrovirali.
   NOTA: Per un protocollo dettagliato, si prega di consultare Holst et al ^11..
   1. Genera retrovirus per trasfezione transiente di cellule 293T con tre plasmidi (pVSVG, PEQ-Pam3 (-E) e vettore di interessi ¹¹⁾ e prendere il surnatante retrovirale dalle cellule 293T di trasdurre la ecotropic linea cellulare produttore retrovirale GP + E86.
   2. Isolare i primi 40% delle cellule che esprimono produttori fluorescenti GP + E86 da FACS e propagare le cellule produttrici + E86-GP transdcuced come fonte di virus.
      NOTA: La generazionedi produttori di alto titolo è fondamentale per un efficiente trasduzione di cellule del midollo osseo. Per un protocollo completo si prega di consultare Holst et al. ¹¹

3. Retrovirus-mediata Stem Cell Gene Transfer (Giorno -5)

1. Scongelare e cultura 0.5 -1.0 x 10 ⁶ di ciascuna linea cellulare produttore GP + E86 in completo DMEM 10% (vol / vol) FBS per consentire una crescita sufficiente per due confluenti piastre da 150 mm per giorno 0 di questo protocollo.
   NOTA: Scongelamento 0,5-1,0 x 10 ⁶ di ciascuna linea cellulare produttore GP + E86 in un piatto 10 centimetri consentirà di 30 - 50% di confluenza in occasione della Giornata 5. Ciò consente anche di 5 giorni di coltura al fine di espandere il GP + E86 linee cellulari di produttori alle due piastre confluenti 150 mm per giorno 0.
   1. Cultura linea cellulare produttore retrovirale nei media completa coltura tissutale contenente il 5% di siero di vitello feta, e la ciprofloxacina (10 mg / ml) per evitare la contaminazione da micoplasma.
      NOTA: Interrompere l'uso della ciprofloxacina quando generating il surnatante virale per la trasduzione del midollo osseo. Evitare un eccesso di crescita della linea cellulare produttore, in quanto questo avrà un impatto negativo del midollo osseo efficienza di trasduzione.

4. I topi donatori Iniettare con 5-fluorouracile (5-FU) (Giorno -3)

1. Pesare il topo donatore (5 - 12 settimane) per determinare la quantità di 5-FU richiesto. Utilizzando topi di età inferiore a 5 settimane di risultati d'età in bassa resa del midollo osseo. Per garantire l'espressione di un singolo TCR, utilizzare un ceppo di topi carenti di cellule T, come SCID, straccio o TCR alfa topi deficienti come donatori di midollo osseo.
2. Lavorando in cappa coltura tissutale, diluire il magazzino 5-FU con PBS sterile per fare una sufficiente quantità di 10 mg ml ^-1 soluzione di lavoro di 5-FU per fornire 0,15 mg 5-FU per grammo di peso corporeo.
3. Usando una siringa da 1 ml con un ago 37 G, intraperitoneale iniettare 0,15 mg 5-FU per grammo di peso corporeo per topo donatore.
   NOTA: Usa il mouse 1 donatore per un destinatario per avviare e regolareil numero di topi donatori secondo il rendimento cella. Un metodo alternativo per il trattamento 5-FU per l'arricchimento e l'isolamento di progenitori midollari è selezione negativa di cellule positive lineage come descritto in Viret et al.

5. Bone Marrow Procedura di estrazione (giorno 0)

1. Ottenere forbici dissezione e pinze per l'isolamento delle ossa. Preparare supporti (HBSS integrata con 5% FCS (vol / vol)) per raccogliere le ossa in un tubo conico da 50 ml. Mantenere 50 ml conica contenente media su ghiaccio. Euthanize topi da CO ₂ inalazione seguita da dislocazione cervicale per confermare la morte. Pinch zampa al fine di garantire non vengono rilevati riflessi.
2. Sterilizzare il sito chirurgico e strumenti chirurgici con etanolo o metanolo. Rimuovere il femore, tibia, omero, e cingolo pelvico con cura dal primo taglio e sotto la cintura pelvica. Tagliare lungo il femore alla tibia. Rimuovere tutti i tessuti circostanti con le forbici e pinze per ottenere ossa pulite. Tenereossa idratata in HBSS + 5% (vol / vol) FBS.
3. Separare le ossa tagliando a livello delle articolazioni, avendo cura di tagliare entrambe le estremità fuori di ogni osso. Inserire un ago 25-gauge collegato a una siringa da 10 ml contenente HBSS + 5% (vol / vol) FBS. Applicare una pressione e lavare tutto il midollo osseo attraverso un 70-micron filtro di riposo in una conica da 50 ml.
4. Periodicamente, spingere il midollo osseo attraverso il filtro 70 micron utilizzando lo stantuffo di una siringa da 1 ml e 3 ml. Risciacquare il filtro con HBSS + 5% (vol / vol) FBS. Ciò garantirà una sospensione singola cella che è libero di frammenti ossei e dei tessuti. Mantenere le cellule sterili eseguendo la procedura in una cappa sterile.
5. cellule del midollo osseo centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C.

6. midollo osseo Cultura (Giorno 0)

1. supporti Decantare o aspirare e pellet cellulare risospendere in 1 ml di ammonio tampone a base di cloruro di lisi dei globuli rossi (RBC o tampone di lisi equivalente) per tubo da 50 ml. Dopo 1 min di incubazione a cameratemperatura, spegnere il tampone di lisi dei globuli rossi aggiungendo 10 ml di DMEM completo 20% (vol / vol) FBS.
2. cellule centrifugare a 300 xg per 10 minuti a 4 ° C.
3. Decantare o aspirare il surnatante e risospendere midollo osseo in 5 ml completo DMEM 20% (vol / vol) FBS. Contare le cellule con una camera di conta Neubauer.
   NOTA: la resa generale dovrebbe essere di circa 5 - 10 x 10 ⁶ cellule per il mouse; Tuttavia, la resa può variare tra i diversi ceppi di topi.
4. Piatto cellule del midollo osseo con una densità di 4 x 10 ⁷ cellule per piastra da 150 mm in 30 ml di DMEM completo 20% (vol / vol) supplementato con FBS IL-3 (20 g ml ^-1), IL-6 (50 g ml ^-1) e SCF (50 g ml ^-1).
   NOTA: utilizzare citochine appena scongelati-aliquotati. Non utilizzare citochine che sono stati congelati e scongelati più di una o conservati a 4 ° C per più di 2 settimane.
5. Incubare midollo osseo durante la notte (circa 24 ore) a 37 ° C con 5% di CO _2.

7. Cultura Produttore retrovirale cellulare (giorno 0)

1. Piastra 3 x 10 cellule produttrici ⁶ retrovirali per piastra da 150 mm in 18 ml completo DMEM 20% (vol / vol) FBS.
2. Incubare cellule produttrici retrovirali a 37 ° C durante la notte. Anticipare una piastra da 150 mm per 15 milioni di cellule del midollo osseo (circa 2 - 3 topi donatore).

8. Retroviral Surnatante (1 ° giorno)

1. Il giorno successivo (circa 24 ore più tardi), raccogliere il surnatante retrovirale dalle piastre di produttori (istituito nel passo 7) elaborando il surnatante retrovirale direttamente fuori della piastra di 150 mm con una siringa da 10 ml e filtro con un 0,45 Filtro siringa -μm.
2. Ricollocare accuratamente il surnatante retrovirale rimosso con 18 ml di DMEM fresco completa al 20% (vol / vol) FBS.
3. Supplemento il surnatante retrovirale filtrata con IL-3 (20 g ml ^-1), IL-6 (50 g ml ^-1), MSCF (50 g ml ^-1) e Hexadimethrine bromuro (Polybrene) (6 &# 956; g ml ^-1).
   NOTA: Hexadimethrine bromuro deve essere fatta fresca ogni 2 mesi per evitare un calo di efficacia di trasduzione retrovirale.

9. midollo osseo Harvest (1 ° giorno)

1. Dopo aver completato la fase 8.3, raccogliere le cellule del midollo osseo a partire dal punto 6.4 e trasferire i supporti contenenti le cellule non aderenti in sterili tubi da 50 ml.
2. Lavare le piastre vigorosamente con 10 ml di PBS e raccogliere nel conica da 50 ml a partire dal punto 9.1. Se necessario, ripetere la fase di lavaggio.
3. Centrifugare le cellule a 300 xg per 10 minuti a 4 ° C, decantare il surnatante, risospendere le cellule in un piccolo volume (1 - 3 ml) completo DMEM 20% (vol / vol) FBS, e contano. Prevedere 50 - recupero 75% dal giorno 0. Risospendere midollo osseo a 1 x 10 ⁶ cellule per 1 ml di surnatante retrovirale contenente citochine e Hexadimethrine bromuro.

10. midollo osseo trasduzione (1 ° giorno)

1. Piatto il retrovirale surnatante ma / ossomiscela rrow ad un volume di 3 ml per pozzetto in una piastra di coltura tissutale sei pozzetti. Avvolgere le piastre in involucro di plastica per ridurre al minimo lo scambio di gas durante la centrifugazione al punto 10.2.
2. Spin le piastre a sei pozzetti avvolti a 1000 xg per 60 min a 37 ° C.
3. Dopo lo spin, rimuovere la pellicola trasparente e mettere le piastre in un incubatore a 37 ° C di CO ₂ per 24 ore.

11. retrovirale surnatante e trasduzione (2 ° giorno)

1. Dopo 24 ore, raccogliere il surnatante virale fresco dalla linea cellulare produttore virale. Filtrare il surnatante retrovirale utilizzando una siringa da 10 ml e un filtro a siringa da 0,45 micron. Supplemento surnatante filtrato retrovirale con IL-3 (20 g ml ^-1), IL-6 (50 g ml ^-1) e SCF (50 g ml ^-1) e Hexadimethrine bromuro (6 g ml ^-1).
2. Quindi, rimuovere delicatamente con pipetta o aspirare i primi 2 ml di media da ciascun pozzetto della piastra di sei pozzetti contenenti le cellule del midollo osseo.
   NOTA: Work attenzione a non aspirare il midollo osseo, che di solito è concentrata nel centro del pozzo. In alternativa, il surnatante eliminato può essere centrifugata per recuperare eventuali cellule del midollo osseo persi.
3. Per ogni bene nel midollo osseo 6 pozzetti aggiungere 3 ml di surnatante contenente citochine virali freschi e Hexadimethrine bromuro. Avvolgere le piastre in plastica, e ripetere la trasduzione centrifugare a 1000 xg per 60 min a 37 ° C. Scartare le piastre e incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO ₂ durante la notte (circa 24 ore).

12. L'aggiunta di fresco Integrata DMEM (3 ° giorno)

1. Dopo 24 ore, rimuovere la parte superiore 2 ml di media da ciascun pozzetto della piastra di sei pozzetti contenenti le cellule del midollo osseo, come al punto 11.2. Sostituire il supporto rimosso con DMEM fresco 20% (vol / vol) FBS supplementato con concentrazioni finali di IL-3 (20 g ml ^-1), IL-6 (50 g ml ^-1) e SCF (50 g ml ^-1) .
2. Incubare midollo osseopiastre a 37 ° C CO ₂ incubatore per un altro 24 ore.

13. Harvest trasduzione del midollo osseo (4 ° giorno)

1. Dopo 24 ore, raccogliere le cellule del midollo osseo dalle piastre a sei pozzetti. Lavare le piastre energicamente con PBS per rimuovere tutte le cellule non aderenti.
   1. Centrifugare le cellule a 300 xg per 10 min a 4 ° C e decantare il surnatante.
   2. Risospendere il midollo osseo in un piccolo volume (1 ml) di PBS + 0,5% (vol / vol) inattivato al calore FBS. Mantenere le cellule in ghiaccio.
2. Prelevare un campione di 10 ml di ogni condizione di midollo osseo e contare le cellule utilizzando una camera di conta Neubauer. Supponendo 1 - 2 donatore al ricevente, il rendimento sarà sufficiente a trasferire almeno 4 x 10 ⁶ cellule per topo ricevente. Risospendere il midollo osseo in un sufficiente volume di PBS + 0,5% (vol / vol) inattivato al calore FBS per iniettare 200 - 300 ml per topo.
   1. Iniettare almeno 2 x 10 ⁶ cellule con una efficienza di trasduzionedel 25% (può iniettare fino a 8 x10 ⁶ celle) per topo per via endovenosa.
      NOTA: Noi abitualmente iniettare cinque topi riceventi per due 6 pozzetti di cellule del midollo osseo. Se la resa è notevolmente inferiore, più topi donatori devono essere utilizzati fino a quando è possibile ottenere il numero di midollo osseo sufficiente. Al fine di raggiungere ricostituzione ottimale, almeno 5 x 10 ⁵ trasdotte (fluorescente positiva) deve essere iniettato in ciascun destinatario.
3. Con una micro pipetta, prelevare un campione di 10 ml di ogni condizione di midollo osseo e di analizzare l'efficienza di trasduzione mediante citometria a flusso basato sulla espressione del marcatore fluorescente (Figura 1A) ^11.
   NOTA: in generale, la percentuale di cellule positive fluorescenti è tra il 25% e il 70%, a seconda del costrutto e titolo retrovirale. Il numero di cellule del midollo osseo trasdotte necessario ricostituire un mouse sub-letale irradiate può variare a seconda della efficienza di trasduzione. Più basso è il tranefficienza sduction, le cellule del midollo più ossee richiesto e viceversa, maggiore è l'efficienza di trasduzione midollo osseo, il minor numero di cellule nella ricostituzione. efficienza di trasduzione di sotto del 25% è ottimale e può provocare la ricostituzione e la sopravvivenza insufficiente. Al fine di garantire il recupero del midollo osseo ottimale e l'efficienza di trasduzione, utilizzare i media e citochine coltura di tessuti preparati al momento. Quando esprimere una nuova TCR utilizzando il sistema retrogenic, la selezione di tale TCR in vivo è sconosciuta. A seconda ogni singolo affinità TCR, selezione TCR nel timo e di espressione di cellule T periferico varierà ^17.

14. mouse irradiazione, midollo osseo iniezione e cura

1. Irradiare topi il giorno prima dell'iniezione di midollo osseo (stesso giorno Fase 13). Utilizzare i seguenti dosaggi: C57BL / 6 topi (e altri ceppi wild type), 900 rad; RAG1 ^{- / -} mice, 500 RADS; topi SCID, 300 RADS).
   1. topi Luogo destinatario sul amoxicillina (50 mg / kg / giorno) o un altro trattamento dell'acqua antibiotico prima dell'irraggiamento, e mantenere antibiotici per le prime due settimane dopo l'iniezione di midollo osseo.
      NOTA: la dose di irradiazione ottimale può essere determinato empiricamente.
2. Per l'iniezione, caricare le cellule a partire dal punto 13.1 in una siringa da 1 ml con aghi smussati immediatamente prima dell'iniezione, quindi cambiare l'ago 27-gauge per l'iniezione, espellere l'aria per evitare embolia gassosa. topi calore sotto una lampada riscaldante e iniettano 0,2 ml di midollo osseo per topo per via endovenosa.
   NOTA: Non lasciate che le cellule si siedono nella siringa per un certo periodo di tempo o le cellule si accontentano.
3. Monitorare i topi settimanale per assicurarsi che rimangano in buona salute.
4. Dopo 5 - 6 settimane sfiatare i topi per verificare ricostituzione sulla base di GFP + / + ametrine e co-espressione TCR (Figura 1B) ^11.

Risultati

Bone efficienza osseo trasduzione viene controllato nel passo 13.3 del protocollo prima del midollo osseo viene iniettato in vena della coda iv In rappresentante midollo osseo trasduzione figura (Figura 1A), circa 10 ml di midollo osseo raccolto è stato aggiunto a 100 ml di PBS e analizzate per l'espressione ametrino. Generalmente la percentuale di cellule positive fluorescenti è tra il 25% e il 70%, a seconda del costrutto e titolo retrovirale. Dopo 6 settimane in...

Discussione

Nel protocollo, abbiamo dettaglio diversi passaggi critici per garantire la salute del midollo osseo ottimale, l'efficienza di trasduzione e la ricostituzione. Il primo passo fondamentale è la generazione e la corretta manutenzione delle cellule produttrici virale GP + E86. Utilizzare linee cellulari produttori di passaggio precoce e mantenere a 80% di confluenza o inferiore prima dell'uso. Quando si effettuano fresche cellule produttrici virale GP + E86, garantire le cellule 293T sono di passaggio precoce e in...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, high glucose + glutamine	Corning Cellgro	10-013-CV	Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate
FBS	Atlanta Biological	S11550
Trypsin-Versene	Lonza	17-161F
0.45 µm syringe filter	Thermo Scientific	194-2545
polybrene	Sigma	H9268-10G	Sterile Filtered in dH2O
Ciprofloxacin	VWR	AAJ61970-06
5-fluorouracil (5-FU)	VWR	AAA13456-06
Sodium Pyruvate	Corning Cellgro	25-000-CI
MEM nonessential Amino Acids	Corning Cellgro	25-025-CI
HEPES 1 M solution	Corning Cellgro	25-060-CI
2-Mercaptoethanol	Gibco by Life Technologies	21985-023
Pen/Strept	Corning Cellgro	30-002-CI
L-glutamine	Corning Cellgro	25-005-CI
150 mm tissue culture dishes	Greiner Bio-one	639160
Tisue culture-treated 6-well flat plate	Greiner Bio-one	657160
70 µm nylon cell strainers	Falcon	352350
Mouse IL-3	Invitrogen	PMC0033
Human IL-6	Invitrogen	PHC0063
Mouse Stem Cell Factor	Invitrogen	PMC2113L
10x PBS	Corning Cellgro	46-D13-CM
HANKS Buffer	Corning Cellgro	21020147
BD 10 ml Syringe	BD	300912
BD 1 ml Syringe	BD	309659
27 G x 1/2 BD Precision Glide Needle	BD	305109
30 G x 1/2 BD Precision Glide Needle	BD	305106