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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
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  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Non restrittivo EEG radiotelemetria è un approccio metodologico valido per registrare in vivo elettroencefalogrammi a lungo termine dai roditori liberi di muoversi. Questo protocollo dettagliato descrive epidurale stereotassica e profondo posizionamento degli elettrodi intracerebrale in diverse regioni del cervello per ottenere registrazioni affidabili di CNS ritmicità e fasi comportamentali correlati CNS.

Abstract

Impiantabile EEG radiotelemetria è rilevante centrale nella caratterizzazione neurologica di modelli transgenici murini di malattie neuropsichiatriche e neurodegenerative, nonché epilessie. Questa potente tecnica non solo fornisce preziose informazioni sui meccanismi fisiopatologici alla base, vale a dire., L'eziopatogenesi delle malattie del sistema nervoso centrale connessi, facilita anche lo sviluppo di nuovi traslazionale, vale a dire., Approcci terapeutici. Mentre le tecniche di concorrenti che fanno uso di sistemi di registratore utilizzato in giacche o sistemi frenati soffrono di loro restrittivo non fisiologica a carattere semi-restrittivo, registrazioni EEG radiotelemetrico ovviare a questi inconvenienti. Tecnicamente, impiantabile EEG radiotelemetria consente la misurazione precisa e molto sensibile della EEG, intracerebrali epidurale e profonde in varie condizioni fisiologiche e fisiopatologiche. In primo luogo, vi presentiamo un protocollo dettagliato di un dritto in avanti, con successo,tecnica rapido ed efficiente per registrazioni epidurale (superficie) EEG conseguente electrocorticograms alta qualità. In secondo luogo, abbiamo dimostrato come impiantare profonde, elettrodi intracerebrali EEG, ad esempio, nell'ippocampo (electrohippocampogram). Per entrambi gli approcci, un sistema di elettrodi di impianto stereotassico 3D informatizzato. Il trasmettitore a radiofrequenza si è impiantato in una tasca sottocutanea in topi e ratti. Particolare attenzione deve anche essere pagato al pre-, peri- e post-operatorio trattamento degli animali da esperimento. Preparazione preoperatoria di topi e ratti, anestesia idonei nonché la gestione e il trattamento del dolore postoperatorio sono descritte in dettaglio.

Introduzione

Radiotelemetry è un approccio metodologico più prezioso per misurare vari parametri comportamentali e fisiologici in animali coscienti sfrenate di varie dimensioni, in particolare nel contesto di EEG, ECG, EMG, pressione sanguigna, temperatura corporea o misurazione dell'attività 1-7. Teoricamente, qualsiasi specie possono essere analizzati utilizzando impiantabile radiotelemetria EEG da roditori da laboratorio, come topi e ratti ai gatti, cani, maiali e primati 3,8. Anche i pesci, rettili e anfibi sono oggetto di indagine radiotelemetrico 9. Negli ultimi due decenni, impiantabile radiotelemetria EEG ha dimostrato di essere prezioso per la caratterizzazione dei vari modelli animali transgenici di malattie umane, come epilessie, disturbi del sonno, neurodegenerative e disturbi neuropsichiatrici 7,10-12. In passato, numerosi approcci metodologici di raccolta dati fisiologici tra cui biopotenziali da topi e ratti sono stati discribed. Indossato in sistemi giacca registratore, i metodi di contenzione fisica, radiotrasmettitori non impiantati e dei sistemi frenati hanno ricevuto l'attenzione principale in passato 13,14. Oggi, vari sistemi di fissaggio radiotelemetrico sono disponibili in commercio. Tuttavia, uno schermo letteratura anche rivelato 29 pubblicazioni che descrivono lo sviluppo di sistemi radiotelemetrico self-made 15-40. Considerando che i sistemi in casa sono probabilmente meno costoso e più facile da adattare, commercialmente sistemi disponibili sono semplice, di relativamente facile da installare e può essere configurato rapidamente.

Impiantabile EEG radiotelemetria ha una serie di vantaggi rispetto alle tecniche concorrenti quali i metodi di contenzione fisica, indossati nei sistemi di giacca o approcci legato. Questi ultimi sono di ritenuta per definizione, vale a dire., L'animale non è in grado di muoversi o il suo comportamento normale è compromessa. Potrebbe anche essere necessario anestetizzare l'animale per l'acquisizione di riDati responsabile. I moderni sistemi frenati, tuttavia, sono probabilmente meno restrittivo, ma questo deve essere scientificamente validati. Radiotelemetry dall'altro permette animali per esporre la loro piena repertorio di comportamento senza limitazioni spazio-temporali e, quindi, è pensato per essere superiore a frenare approcci ed essere più predittiva dei risultati che potrebbero essere acquisiti nell'uomo 1,3. E 'noto per un bel po' che gli approcci di ritenuta possono drasticamente modificare i parametri fisiologici fondamentali, ad es., Assunzione di cibo, la temperatura corporea, la pressione sanguigna e della frequenza cardiaca e l'attività fisica, per esempio 3. Sistemi Tethered rappresentano approccio uno ancora ampiamente usato restrittivo classica 13,14. Gli elettrodi che sono elettrodi sia epidurale o profondi sono generalmente collegati ad una presa miniatura che è ancorato al cranio. La presa in sé è esposto per il fissaggio di un cavo che permette relativamente libera circolazione dell'animale. Although oggi sistemi frenati sono diventati estremamente filigrana e altamente flessibile, uno dei principali svantaggi è, che è ancora semi-restrittivo. Inoltre, ci potrebbe essere un rischio di infezione nel sito di impianto di elettrodi come gli animali tendono a manipolare le periferiche esterne provenienti dal loro corpo (testa). Anche se la tecnologia wireless radiotelemetria in varie specie è già stata descritta in fine degli anni '60 e ha così esiste da decenni, ma solo recentemente è divenuta accessibile, affidabile, e relativamente facile da usare 10,41,42, in particolare nei piccoli roditori di laboratorio tali come topi e ratti. Piccoli, miniatura trasmettitori EEG impiantabili sono ora disponibili in commercio e possono essere impiantati in topi maggiori di 20 g (~ 10 settimane). Così, la caratterizzazione elettrofisiologica di modelli di topi transgenici in particolare, è diventato un campo predominante di applicazione impiantabile radiotelemetria EEG questi giorni. dimensioni degli animali non è più una restrizione sperimentale assolutozione, mentre la durata della vita delle batterie dei trasmettitori in effetti è. Nonostante il suo limitato tempo di vita, i sistemi di trasmettitore impiantabili sono in grado di ridurre al minimo la maggior parte degli svantaggi legati alla potenziale di stress registrazione associata con sistemi di ritenuta. Roditori possono presentare il loro armamentario completo del comportamento fisiologico tra cui riposo, attività locomotoria (esplorazione) e dormire (REM, sonno a onde lente) 43,44. È importante sottolineare che, radiotelemetria impiantabile in grado di ridurre fortemente l'uso degli animali 3. Attualmente, vi è un intenso dibattito su come limitare il numero di animali da esperimento nel campo della scienza e ridurre la loro sofferenza. Chiaramente, la sperimentazione animale e modelli animali di malattie umane e animali sono essenziali per la nostra comprensione della linea di fondo fisiopatologia e successivi progressi nella terapia. Inoltre, gli esperimenti sugli animali sono fondamentali nella ricerca e sviluppo di farmaci. Essi sostanzialmente contribuiscono a preclinici / studi tossicologici in licenza di drogaimpegnandosi in tal modo sia la cura umana e animale. E 'degno di nota, che attualmente alternative sono ancora disponibili per la ricerca animale per comprendere i complessi meccanismi fisiopatologici che sarebbe altrimenti impossibile da suscitato. Allo stesso tempo, la 3R, vale a dire., La sostituzione, la riduzione e la strategia di perfezionamento in Europa e negli Stati Uniti incoraggia fortemente la ricerca di metodi complementari e alternative. Radiotelemetry è un esempio importante di una strategia 3R successo come si può ridurre il numero di animali sperimentali e loro sofferenza rispetto ad altre tecniche.

Qui forniamo un approccio dettagliato e contigua passo-passo per eseguire un sacchetto impianto sottocutaneo di un trasmettitore a radiofrequenza in entrambi i topi e ratti. Questa prima sequenza è seguita da una descrizione di epidurale stereotassica e profondo intracerebrale posizionamento degli elettrodi EEG. Particolare attenzione è rivolta alle condizioni di stabulazione, l'anestesia, peri- e dolore post-operatoriola gestione e l'eventuale trattamento anti-infettivi. L'attenzione si concentra su un approccio stereotassico 3D computerizzato di indirizzare in modo affidabile le strutture intracerebrali epidurale e profonde. Commentiamo anche frequenti insidie ​​sperimentali in EEG impianto di elettrodi e le strategie per la riduzione del trauma e l'ottimizzazione della gestione del dolore durante il recupero post-operatorio. Infine, esempi di superficie e registrazioni EEG profonde sono presentati.

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Protocollo

Etica Dichiarazione: Tutti sperimentazione animale è stata eseguita secondo le linee guida del Consiglio locale e istituzionale su Animal Care (Università di Bonn, BfArM, LANUV, Germania). Inoltre, tutti sperimentazione sugli animali è stata effettuata in conformità con la legislazione superiore, ad esempio., Della direttiva del Consiglio Comunità europee del 24 novembre 1986 (86/609 / CEE) o individuali legislazione regionale o nazionale. sforzo specifico è fatto per ridurre al minimo il numero di animali utilizzati e le loro sofferenze.

1. Gli animali sperimentali

  1. Selezione di animali da laboratorio e specie
    1. Effettuare studi radiotelemetrico nei roditori, vale a dire., Topi e ratti che soddisfano i requisiti di omologia, isomorfismo e prevedibilità relativi ad una specifica malattia umana 7,9,45,46.
      Nota: il mouse Varie e ratto ceppi disponibili possono gravemente differire in base fisiologico e fisiopatologico caratteristica atmosferaics 47-49.
    2. Considerare o valutare caratteristiche fisiologiche e fisiopatologiche di ceppi di topi / ratti prima di eseguire esperimenti successivi elettrofisiologici, ad esempio, la risposta ai dosaggi applicabili di anestetici, l'architettura del sonno e il sequestro di suscettibilità 50,51.
    3. Nota caratteristiche specifiche di genere nel disegno dello studio. Il ciclo estrale può influenzare fortemente ritmicità centrale, la sua attività di dipendenza circadiano, il sonno e il sequestro 52-54. Quindi, eseguire l'analisi specifica di genere.
      Nota: Se la capacità finanziaria e sperimentale è limitato, si consiglia di restrizione a topi maschi.
  2. custodia e la gestione degli animali
    1. topi e ratti Casa a filtro-top gabbie o meglio ancora in gabbie a ventilazione individuale.
    2. Trasferire i topi dalla struttura animale di armadi ventilati collocati in appositi locali di laboratorio dedicati esclusivamente agli animali impiantati e la loro successiva registrazione (Figura1).
    3. Per acclimatazione dopo il trasporto a terra, luogo gli animali per una settimana in un armadio ventilato in condizioni standard, vale a dire, 21 ± 2 ° C di temperatura ambiente, 50 -. 60% di umidità relativa, e un ciclo convenzionale 12 ore luce / buio.
    4. Prima di impianto chirurgico, i topi casa in gruppi di 3-4 in chiaro gabbie in policarbonato tipo II (26,7 cm x 20,7 cm x 14,0 cm, zona 410 cm 2) con accesso ad libitum all'acqua potabile e pellet cibo standard. Utilizzare chiaro gabbie in policarbonato tipo III (42,5 cm x 26,6 cm x 18,5 cm, zona 800 cm 2) per i ratti.
    5. Non separare / isolare gli animali in questa fase, l'isolamento può causare stress che influenza i risultati sperimentali in seguito. Tuttavia, a seguito di strumentazione chirurgica, gli animali di casa separatamente come gli animali tendono a manipolare stiches ferita / suture o clip metalliche (vedi sotto).
    6. Evitare le condizioni abitative aperte come sono giudicati inappropriati per una varietà di sdomande SCIENTIFICO, ad es., studi del sonno.
    7. Usare mouse e attrezzature specifiche ratto modo che né topi né ratti possono rilevare la presenza di ogni altro come questo pone ulteriore stress agli animali.

2. Sistema radiotelemetria EEG

Nota: Il protocollo descritto si basa su un sistema di telemetria disponibili in commercio utilizzati per superfici e registrazioni EEG intracerebrale profondi (Figura 2).

  1. Utilizzare un impianto di telemetria a radiofrequenza adatto per l'impianto in topi o ratti, ad es., Un trasmettitore di un canale o un trasmettitore a due canali.
    Nota:. Entrambi i trasmettitori sono in grado di misurare vari biopotenziali, cioè, elettroencefalogramma (EEG), elettrocardiogramma (ECG), elettromiogramma (EMG), ma anche l'attività fisica e la temperatura. Hanno un meccanismo azionato magneticamente on-off. I cavi di trasmissione e di rilevamento sono forniti sterili. Se il trasmettitore èper essere riutilizzato seguire le istruzioni del fabbricante per risterilizzazione.
  2. Per l'analisi di gamma alta frequenza (fino a 500 Hz) per esempio, scegliere trasmettitori con alto tasso nominale di campionamento (f, fino a 5.000 Hz) e larghezza di banda trasmettitore (B, fino a 500 Hz). In particolare, in considerazione del limite di campionamento di Nyquist-Shannon, vale a dire., I dati EEG possono essere analizzati fino a un massimo assoluto di f / 2, ma non oltre. Per l'analisi di frequenza affidabile, una larghezza di banda di frequenza (B) di f / 10 - si raccomanda f / 5.
    Nota: La domanda scientifica da esaminare devono essere conformi alle specifiche tecniche del trasmettitore.

3. Anestesia e terapia del dolore

  1. Utilizzare isoflurano narcosi per inalazione.
    1. Posto l'animale in una "camera di induzione" pieno di 4-5% isoflurano e 0,8-1% di ossigeno o CarboGen (5% di CO 2 e il 95% O 2) L / min. Mantenere la profondità desiderata di anestesia con una maschera di silicio fornire un flusso 1.5- 3.0% isoflurano e 0,8 - 1% ossigeno o carbogeno L / min (Figura 3A).
      Nota: la concentrazione di isoflurano appropriato varia a seconda del peso corporeo (volume di distribuzione), età, sesso e background genetico dell'animale. Se apparecchiature per l'anestesia del gas non è disponibile, vale a dire, "camera di induzione", CarboGen o somministrare ossigeno, flussometro, vaporizzatore isoflurano, sistema di evacuazione fumi, vedere paragrafo 3.2. Un ritirati dal sistema di aspirazione (scavenging sistema, Figura 3A), deve essere installato per evitare l'esposizione isoflurano dello sperimentatore (il tubo non viene mostrato nel documento video per la dimostrazione).
  2. Quando aneesthetics inalazione non sono un'opzione, eseguire l'anestesia per anestetici iniettabili. Preparare una combinazione di cloridrato esketamine (roditore dosaggio 100 mg / kg) e xilazina cloridrato (roditore dosaggio 10 mg / kg) in 0,9% NaCl e iniettare l'animale intraperitoneale base al suo peso corporeo.
  3. Osservare gli animali Carefully per profondità dell'anestesia con pizzico di coda, piedi pinch e monitorando la frequenza respiratoria (topi 150-220 respiri / min; ratti 70 - 115 respiri / min). Verificare la presenza di possibili ansimante.
    Nota: Diverse linee di topi e ratti possono presentare diverse sensibilità all'anestesia. Lo stesso vale per i modelli di topi transgenici.
    Nota: intubazione endotracheale non è un must nei roditori. Infatti, l'intubazione aumenta il rischio di danni alla trachea.

4. Strumentazione Chirurgica - Aspetti generali

  1. Applicare calore supplementare durante e post-operatorio con ricircolo di acqua calde coperte, piatti di riscaldamento elettrici, lampade di calore, unità aeree calda forzata o scalda tasca per mantenere la temperatura corporea. Mantenere il secondo a 36,5-38,0 ° C (98,6-100,4 ° F).
    Nota: I piccoli roditori sono predisposti per ipotermia a causa del loro elevato rapporto tra superficie corporea (mouse, 10.5 x (peso in g) 2/3; ratti, 10.5 x (peso in g) 2/3)al volume del corpo.
  2. Evitare l'essiccamento della cornea e coprire gli occhi con a base di petrolio unguento artificiale lacrima o Dexpantenolo (vedi documento video) durante l'intero processo di impianto e di recupero precoce fino a quando il riflesso lampeggiante è completamente ripristinato.
  3. Strumenti chirurgici autoclave (vedi Tabella dei Materiali) per la sterilizzazione o metterli in disinfettanti.
    Nota: Un modo elegante e veloce è l'utilizzo di uno sterilizzatore strumento chirurgico di calore a base di perle di vetro.
  4. Avere un microscopio binoculare ingrandimento chirurgica e una sorgente di luce fredda disponibili per l'illuminazione intenso via, guide di luce mobili flessibili o autoportanti.
  5. Indossare un camice da laboratorio pulito, una maschera, un coperchio della testa e guanti sterili.
    Nota: le forniture e gli strumenti ottimali possono variare da un laboratorio all'altro e devono soddisfare i requisiti specifici di laboratorio e istituzionali.

5. Chirurgia - Posizionamento del trasmettitore

  1. Rimuovere il corpo hair dal cuoio capelluto da completamente anestetizzati topi / ratti usando un rasoio. Pulire la zona rasata con un disinfettante, ad esempio, il 70% di etanolo e uno scrub a base di iodio. Evitare di irritazione della pelle o infiammazione a causa di un'eccessiva esposizione. Posto l'animale in posizione prona su una coperta di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea durante l'anestesia.
  2. Usando un bisturi, fare una incisione mediana sul cuoio capelluto dalla fronte (in modo che il punto di riferimento bregma craniometrico diventa visibile) al collo (in modo che il muscolo trapezio diventa visibile). A partire dal sito di incisione nucale e con una forbice chirurgica, aprire un sacchetto sottocutaneo lungo il fianco laterale del animale per via smussa.
  3. Iniettare 1 ml di NaCl allo 0,9% nel sacchetto sottocutaneo. Posizionare il trasmettitore con i conduttori di rilevamento orientato cranialmente all'interno della tasca sottocutanea al fianco vicino alla regione addominale ventrale. Se il trasmettitore ha una scheda di sutura, fissare il trasmettitore alla pelle dorsale / laterale utilizzando una o più STIches (over-e-over suture).
    Si noti che la fissazione del trasmettitore non è un must. Prestare particolare attenzione alla prevenzione di contaminazione del sito chirurgico e l'impianto trasmettitore. Tende dovrebbero essere usati per isolare adeguatamente sterile da aree non sterili.
  4. Per la cura post-operatorio e la gestione del dolore, vedere la sezione 8.

6. Stereotassica superficie dell'elettrodo impianto

  1. Posto l'animale sul telaio stereotassico sotto anestesia e posizionare accuratamente la testa con l'aiuto delle barre e il morsetto naso in modo che i punti di riferimento bregma e lambda craniometrics del cranio sono allo stesso livello (Figura 3B). Non danneggiare l'orecchio interno utilizzando barre orecchio. Coprire barre orecchio con batuffoli di cotone, se necessario. Questo permette di precauzioni stretto fissaggio della testa all'interno del telaio stereotassico.
  2. Pulire il periostio, con punte di cotone senza danneggiare i muscoli temporale e occipitale. Pre-trattare il sottile strato superficiale delcranio con 0,3% H 2 O 2 per il cranio mouse e 3% H 2 O 2 per il cranio ratto. Questa procedura espone chiaramente punti di riferimento di sutura e craniometrics cranici quali bregma e lambda (Figura 4B, C).
  3. Utilizzare una speciale configurazione stereotassica, completamente attrezzata per topi e ratti compresi telaio stereotassico con barre orecchio e le dimensioni adattati per topi e ratti, rispettivamente morsetto naso. Assicurarsi che il telaio stereotassico include una maschera anestetico gas con collegamenti con l'evaporatore isoflurano e il modulo scavenger isoflurano.
    Nota: Una configurazione 3D stereotassica computerizzato con un topo e nel ratto specifica del cervello coordinare software, tra cui un'interfaccia utente per la navigazione e Atlas 3D, permettendo una vista assiale, coronale e sagittale è raccomandato.
  4. Montare un trapano precisione sul braccio verticale del telaio stereotassico. Utilizzare una matita montato o penna sul braccio verticale lasciando un piccolo segno alle coordinate di scelta sulla parte superiore del cranio senessun sistema stereotassico computerizzato è disponibile.
  5. Praticare dei fori con attenzione tenendo conto che i topi e ratti gravemente differenziano per lo spessore delle ossa neurocranial. Inoltre, si noti che lo spessore delle ossa craniche murine dipende fortemente dalla localizzazione, ad esempio, nei topi, os frontale: sezione mediana: 320-390 micron, sezione laterale 300 - 430 micron; os parietale: sezione mediana: 210 - 250 micron, sezione laterale: 200-210 micron; os occipitale: sezione mediana: 600-730 micron, sezione laterale: 380-420 micron).
  6. Praticare dei fori pressione-libera alla massima velocità.
    Nota: Questo evita un applanazione tonica del cranio, che può provocare una svolta improvvisa della testa di perforazione e danni potenziali principalmente nel campo corticale. Per craniotomia, un sistema di trapano motore di precisione ad alta velocità neurochirurgico è altamente raccomandato.
  7. Praticare dei fori bava alle coordinate di scelta con diametro della testa tipico trapano0,3 - 0,5 mm.
    Nota: Il diametro dei fori potrebbe essere inferiore a seconda del diametro dell'elettrodo. Come regola generale, minore è il diametro, meno danni viene prodotto.
  8. Piegare la punta di piombo rilevamento dei trasmettitori che funge da elettrodo epidurale e posizionarlo direttamente sulla dura madre nel foro in corrispondenza delle coordinate di scelta. In alternativa, utilizzare viti corticali e meccanicamente collegarli ai cavi di rilevamento del trasmettitore (Figura 4A).
  9. . Per le registrazioni dalla superficie, ad esempio, la corteccia motoria murino M1 / M2, posizionare l'elettrodo, ad esempio, in: cranica 1 mm laterale 1,5 mm (emisfero sinistro). Posizionare l'elettrodo di riferimento epidurale sulla corteccia cerebellare: bregma -6 mm, laterale del bregma di 1 mm (emisfero sinistro) o bregma -6 mm, laterale del bregma di 1 mm (emisfero destro) (Figura 4D).
    Nota: Il cervelletto serve come riferimento in quanto è una regione electroencephalographically silenziosa. Stereotcoordinate axic possono essere derivate da atlanti stereotassica standard per topi e ratti.
  10. Fissare elettrodi con cemento vetroionomero dentale (a base d'acqua), che è estremamente difficile e dà forte adesione al neurocranio sottostante.
    Nota: Se si utilizza cemento dentale vetroionomero, senza viti di ancoraggio sono necessarie per garantire gli elettrodi.
  11. Lasciare il cemento asciugare per 5 min. Chiudere il cuoio capelluto con oltre-e-oltre suture con non assorbibile 5-0 / 6-0 materiale di sutura. In alternativa, colla pelle può essere utilizzato. Strettamente monitorare la qualità delle registrazioni EEG basate sul sito impianto di elettrodi. Nota: Ossification dai fori può verificarsi che ha la capacità di sollevare gli elettrodi con il tempo. Questo può portare ad una ridotta qualità EEG a causa di EMG ed ECG contaminazione e può quindi limitare la durata di registrazione ottimale.
  12. Per la cura post-operatorio e la gestione del dolore, vedere la sezione 8.
  13. Posizione degli elettrodi Convalida EEG post mortem.
    1. per l'eutanasia, Posto l'animale (s) in una camera di incubazione e introdurre 100% di anidride carbonica. Utilizzare un tasso di riempimento del 10% - 30% del volume della camera per minuto addizionata con anidride carbonica all'aria esistente nella camera di incubazione. Questo è appropriato per ottenere una rapida perdita di coscienza con il minimo disagio per gli animali.
      Nota: evitare l'esposizione improvvisa di animali coscienti a concentrazioni di anidride carbonica> 70% come è stato dimostrato di essere dolorosa.
    2. Osservare ogni mouse / topo per mancanza di respiro e colore degli occhi sbiaditi. Mantenere il flusso di CO 2 per un minimo di 1 minuto dopo l'arresto respiratorio. Tempo previsto di incoscienza è di solito entro 2 o 3 minuti.
    3. Se si osservano entrambi i segni, quindi rimuovere i roditori dalla gabbia; altrimenti continuare esponendo loro di CO 2. Se incoscienza non si è verificato entro 2 o 3 minuti, controllare la velocità di riempimento della camera.
    4. Per verificare il corretto posizionamento degli elettrodi, estirpare cervelli post mortem, ad es., A seguito di CO 2 eutanasia e fissarli in paraformaldeide al 4% in PBS (pH 7,4) durante la notte. In alternativa, eseguire perfusione cardiaca degli animali utilizzando PBS ghiacciato (PBS, pH 7,4) seguito da 4% paraformaldeide soluzione (PFA) disciolto in PBS.
    5. cervelli Postfix per 2 - 4 ore in 4% PFA a temperatura ambiente seguita da crioprotezione nel 30% di saccarosio in PBS e cervelli Conservare a 4 ° C fino a ulteriori elaborazioni.
    6. Utilizzando matrice esemplare per criostato sezionamento, congelare il cervello su un blocco stereotassica e tagliare 60 micron fette coronali utilizzando un criostato. fette di montaggio su vetrini, aria secca, e macchie con blu Nissl utilizzando tecniche standard di visualizzare il canale ramo e l'ex posizione degli elettrodi.
      Nota: Questo approccio rivela anche se gli elettrodi di superficie sono stati collocati profonda accidentalmente lasciando un urto minore sulla parte superiore della corteccia.

7. Stereotassica profonda intracerebrale EEG elettrodo Implantatione

  1. Pre-trattare il cuoio capelluto e del cranio dell'animale, come descritto nelle sezioni 6.1 - 6.2. Selezionare il tipo di elettrodi di profondità attentamente, prendendo in considerazione le caratteristiche del materiale, ad esempio., Diametro e impedenza e possibile connessione ai cavi di rilevamento del trasmettitore.
    Nota: Parylene acciaio rivestito e tungsteno elettrodi sono comunemente usati. Le caratteristiche degli elettrodi devono adattarsi alle singole esigenze sperimentali. Se gli elettrodi non sono forniti sterili, essi devono essere incubate in etanolo al 70% prima dell'uso. Poiché gli elettrodi sono rivestiti per questo scopo sperimentale, una sterilizzazione termica a base non è applicabile.
  2. Praticare fori alle coordinate di scelta, come descritto nel capitolo 6 utilizzando il sistema stereotassico. Per indirizzare la regione murino CA1 per esempio, che funge da zona del cervello intensamente studiato, collocare l'elettrodo differenziale alle seguenti coordinate riferiti a bregma: caudale 2 mm laterale 1,5 mm (emisfero destro)e dorsoventrale (profondità) di 2 mm. Inserire un elettrodo di riferimento epidurale sulla corteccia cerebellare, ad es., Bregma -6 mm, laterale bregma di 1 mm (emisfero sinistro o destro) (Figura 4D, E).
    Nota: L'elettrodo cerebellare serve un elettrodo di pseudo-riferimento sulla regione silenzioso del cervelletto. coordinate stereotassica possono essere derivate da atlanti stereotassica standard per topi e ratti.
  3. Accorciare gli elettrodi profondi alla lunghezza desiderata a seconda di quanto in profondità nel cervello verranno inseriti. Collegare la parte extracranial dell'elettrodo alla spirale in acciaio inox del piombo trasmettitore piegando entrambe le sezioni ad un angolo di 90 ° tra.
  4. Agganciare l'elettrodo profondo al sensing del trasmettitore meccanicamente. Non saldare, quando possibile in quanto questo può indurre rumore significativo nella registrazione EEG. Esporre la spirale in acciaio inox del piombo trasmettitore rimuovendo un breve tratto della isolamento esterna in silicone sulla puntal'iniziativa del trasmettitore usando una lama di bisturi sterile.
  5. Ricablare il cavo del trasmettitore per l'elettrodo cerebrale profonda. Garantire un collegamento adeguato e stabile di entrambi i componenti (Figura 4F). Attaccare l'elettrodo impiantato (che è collegato meccanicamente al piombo trasmettitore) al braccio verticale del dispositivo stereotassico.
  6. Fissare l'elettrodo con cemento vetroionomero dentale (a base acquosa), che è estremamente difficile e dà forte adesione al neurocranio sottostante. Lasciare il cemento asciugare per 5 min. Chiudere il cuoio capelluto con oltre-e-oltre suture con non assorbibile 5-0 / 6-0 materiale di sutura. In alternativa, colla pelle può essere utilizzato.
  7. Strettamente monitorare la qualità delle registrazioni EEG basato sul lato dell'elettrodo impianto.
    Nota: Ossification dai fori può verificarsi che ha la capacità di sollevare gli elettrodi con il tempo. Questo può portare ad una riduzione della qualità EEG a causa di EMG ed ECG contaminazione e può quindi limitare la rec ottimaleDurata Ording. Questo è di particolare importanza per il posizionamento degli elettrodi in profondità.
  8. Per la cura post-operatorio e la gestione del dolore, vedere la sezione 8.
  9. Convalida EEG dopo il posizionamento degli elettrodi mortem come descritto nella sezione 6.13.

Cura 8. post-operatoria e la gestione del dolore post-operatorio

  1. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale.
  2. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione.
  3. Per la gestione del dolore post-operatorio, scegliere un farmaco di uno dei seguenti gruppi: gli oppioidi narcotici, oppioidi agonisti / antagonisti, alfa 2-agonisti, anestesia locale e farmaci anti-infiammatori non steroidei (FANS) 55-60 prega di notare che a causa di. la gravità della chirurgia un trattamento analgesico 3 giorni è raccomandabile.
    1. Se si utilizza la buprenorfina, amministrare il seguente dosaggio: il mouse: 0.05- 0,1 mg / kg, ip, sc, ogni 6 - 12 ore; ratto: 0,01-0,05 mg / kg, ip, sc, ogni 8-12 ore.
    2. Se si utilizza butorfanolo, amministrare il seguente dosaggio: il mouse: 1.0 - 5.0 mg / kg, sc, ogni 4 ore; ratto: 2,0 - 2,5 mg / kg, sc, ogni 4 ore.
    3. Se si utilizza tramadolo, somministrare la dose seguente: topo, ratto: 10 - 30 mg / kg, ip
    4. Se si utilizza Flunixin, amministrare il seguente dosaggio: il mouse: 2,5 mg / kg, sc, ogni 12 ore; ratto: 1,1 mg / kg, sc, ogni 12 ore.
    5. Se si utilizza ketoprofene, amministrare il seguente dosaggio: il mouse: 5 mg / kg, sc, ogni 12 - 24 ore; ratto: 5 mg / kg, sc, ogni 12 - 24 ore.
    6. Se si utilizza metamizolo, somministrare la dose seguente: topo, ratto: 100 mg / kg, ip, ogni 8 ore.
    7. Se si utilizza meloxicam, somministrare la dose seguente: topo, ratto: 1 mg / kg sc ogni 24 ore.
    8. Se si utilizza carprofen, amministrare il seguente dosaggio: il mouse: 5-10 mg / kg, sc, ogni 12 - 24 ore; ratto: 2,5-5,0 mg / kg, sc, ogni 12 - 24 ore.
    9. Se si utilizza acetaminophen, amministrare il seguente dosaggio: topo: 300 mg / kg, PO, ogni 4 ore; ratto: 100 - 300 mg / kg ogni 4 ore.
    10. Se si utilizza lidocaina (come analgesico aggiunta), somministrare la dose seguente: topo, ratto: 1 - 4 mg / kg sc
  4. Quando si utilizza carprofen (dosaggio roditore 5 - 10 mg / kg sc, diluito in 0,9% NaCl) per durata lunga gestione del dolore post-operatorio, eseguire l'iniezione iniziale 10 - 15 minuti prima della fine della strumentazione chirurgica e ripetere per due successive giorni una volta al giorno.
  5. Dopo l'intervento, alimentare pellet inumidito per facilitare l'assorbimento del cibo. Osservare attentamente il cibo (~ 15 g / 100 g / d; ~ 5 g / 24 ore) e acqua (~ 15 ml / 100 g / d; ~ 5 ml / 24 ore) il consumo.
  6. Monitorare gli animali da vicino per il ritorno dei loro posizioni normali e comportamenti.
    Nota: la somministrazione sistemica di antibiotici come enrofloxacin o trimetoprim-sulfamidici è spesso consigliato, ma non è un must assoluto se non segni infiammatori di meningite o encefalite a Thvengono rilevati e siti di implantologia.
  7. Dare topi almeno 10 a 14 giorni aggiuntivi per recuperare completamente prima di iniziare le registrazioni EEG per ulteriori analisi.
    Nota: Le attività sperimentali specifici possono richiedere periodi di recupero più lunghi.
  8. Follow-up recupero post-operatorio dopo l'impianto, valutando lo sviluppo post-chirurgica del peso corporeo. Una riduzione massima del peso corporeo è normalmente osservato intorno al giorno 4 - la chirurgia 5 messaggio seguito da un leggero, ma costante aumento di peso nel corso di un 10 - periodo di recupero di 14 giorni.

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Risultati

Questa sezione illustra esempi ottenuti dalla superficie e, registrazioni EEG intracerebrali profonde. Inizialmente è opportuno precisare che le registrazioni di base in condizioni fisiologiche sono obbligatori prima di registrazioni successive seguenti ad esempio, il trattamento farmacologico. Tali registrazioni di base possono fornire preziose informazioni circa l'interdipendenza funzionale del cervello con ritmicità diversi stati comportamentali o sonno / ritmicità cir...

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Discussione

Impiantabile EEG radiotelemetria è di importanza centrale, in quanto è una tecnica non restrittivo consentendo animali da laboratorio di eseguire il loro repertorio di comportamento 1,3. Questo è di grande interesse in quanto l'approccio telemetrica permette non solo le registrazioni EEG spontaneo, ma anche registrazioni in compiti cognitivi e le impostazioni analitiche circadiani, come ad esempio T-labirinto, labirinto radiale, labirinto d'acqua, attività di privazione del sonno o quando una regi...

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Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Riconoscimenti

The authors would like to thank Dr. Christina Ginkel (German Center for Neurodegenerative Diseases, DZNE), Dr. Michaela Möhring (DZNE) and Dr. Robert Stark (DZNE) for assistance in animal breeding and animal health care. This work was financially supported by the Federal Institute for Drugs and Medical Devices (Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte, BfArM) Bonn, Germany.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Carprofen (Rimadyl VET - InjektionA2:D43slösung)PfizerPZN 011020820 ml
Binocular surgical magnification microscope Zeiss Stemi 20000000001003877, 4355400000000, 0000001063306, 4170530000000, 4170959255000, 4551820000000, 4170959040000, 4170959050000
Bulldog serrefineF.S.T.18051-2828 mm
Cages (Macrolon)Techniplast1264C, 1290D
Cold light sourceSchott KL2500 LCD9.705 202ordered at Th.Geyer
Cotton tip applicators (sterile)Carl Roth EH12.1
Dexpanthenole (Bepanthen Wund- und Heilsalbe)BayerPZN: 1578818
Drapes (sterile)HartmannPZN 0366787
70% ethanolCarl Roth 9065.5
0.3%/3% hydrogene peroxide solutionSigma9532130% stock solution 
Gloves (sterile)Unigloves1570
Dental glas ionomer cementKentDental /NORDENTA957 321
2% glutaraldehyde solutionSigmaG6257
Graefe Forceps-curved, serratedF.S.T.11052-10
Halsey Micro Needle Holder-Tungsten CarbideF.S.T.12500-1212.5 cm
Heat-based surgical instrument sterilizerF.S.T.18000-50
Heating padAEG HK5510520010ordered at myToolStore
High-speed dental drillAdeorSI-1708
Iris scissors extra thin F.S.T.14058-099 cm
Inhalation narcotic system (isoflurane)Harvard Apparatus GmbH34-1352, 10-1340, 34-0422, 34-1041, 34-0401, 34-1067, 72-3044, 34-0426, 34-0387, 34-0415, 69-0230
IsofluraneBaxter 250 mlPZN 6497131
KetaminePfizerPZN 07506004
Lactated Ringer’s solution (sterile)BraunL7502
Lexar-Baby Scissors-straight, 10 cmF.S.T.14078-1010 cm
Nissl staining solutionArmin BaackBAA31712159
Non-absorbable suture material 5-0/6-0 (sterile)SABANA (Sabafil)N-63123-45
Covidien (Sofsilk)S1172, S1173
Halsey Needle HolderF.S.T.12001-1313 cm
Pads (sterile)ReWa Krankenhausbedarf2003/01
0.9% saline (NaCl, sterile)BraunPZN:8609255
Scalpel blades with handle (sterile)propraxis2029/10
Standard Pattern ForcepsF.S.T.11000-12, 11000-1412 cm and 14.5 cm length
Steel and tungsten electrodes parylene coated FHC Inc., USA)UEWLGESEANND
Stereotaxic frameNeurostar51730Mordered at Stoelting
(Stereo Drive-New Motorized Stereotaxic)
Tapes (sterile)BSN medical GmbH & Co. KG626225
TA10ETA-F20 DSI270-0042-001XRadiofrequency transmitter 3.9 g, 
3.9 g, 1.9 ml, input voltage range ± 2.5 mV,
channel bandwidth (B) 1 - 200 Hz, 
nominal sampling rate (f) 1,000 Hz (f = 5B)
temperature operating range 34 - 41 °C
warranted battery life 4 months
TL11M2-F20EET DSI270-0124-001XRadiofrequency transmitter 
3.9 g, 1.9 ml, input voltage range ± 1.25 mV,
channel bandwidth (B) 1 - 50 Hz, 
nominal sampling rate (f) 250 Hz (f = 5B)
temperature operating range 34 - 41 °C
warranted battery life 1.5 months
Tissue Forceps- 1x2 Teeth 12 cmF.S.T.11021-1212 cm length
Tungsten carbide iris scissorsF.S.T.14558-1111.5 cm
Vibroslicer 5000 MZElectron Microscopy Sciences5000-005
Xylazine (Rompun)BayerPZN: 1320422

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