Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

Riepilogo

lesioni renali sostenuti da nefrotossine, che comprendono farmaci che vanno dagli antibiotici ai chemioterapici, può portare a disturbi complessi, la cui patogenesi rimane completamente sconosciuto. Questo protocollo dimostra come zebrafish può essere utilizzato per la malattia modellazione di queste condizioni, che possono essere applicati alla individuazione di misure renoprotettivi.

Abstract

I reni sono suscettibili di nuocere dall'esposizione a sostanze chimiche che filtrano dal flusso sanguigno. Questo può portare a lesioni d'organo associata ad un rapido declino della funzione renale e lo sviluppo della sindrome clinica nota come danno renale acuto (AKI). agenti farmacologici usati per trattare le circostanze mediche che vanno da un'infezione batterica al cancro, quando somministrato singolarmente o in combinazione con altri farmaci, possono avviare AKI. Zebrafish sono un modello animale utile per studiare gli effetti chimici sulla funzione renale in vivo, in quanto costituiscono un rene embrionale composto di unità funzionali nefrone che sono conservati con vertebrati superiori, compreso l'uomo. Inoltre, zebrafish può essere utilizzata per eseguire schermi genetici e chimici, che offrono opportunità per chiarire gli aspetti cellulari e molecolari di AKI e sviluppare strategie terapeutiche, come l'identificazione di molecole nefroprotettivo. Qui, dimostriamo come microiniezione nelzebrafish può essere utilizzato come un paradigma per gli studi nefrotossina.

Introduzione

Aki è una perdita improvvisa della funzione renale che può portare a conseguenze per la salute devastanti ^1. AKI è un problema sanitario rilevante in tutto il mondo a causa della sua elevata incidenza di circa il 20% tra i pazienti ospedalizzati, con tassi ancora più elevati di 30-50% nei casi di terapia intensiva e gli anziani, e il tasso di mortalità del 50-70% ^1-3. Purtroppo, la prevalenza di AKI è in aumento e si prevede a crescere ulteriormente nel prossimo decennio, in parte a causa della diversità dei fattori che possono indurre AKI, che includono stress post-operatorio, ischemia, e l'esposizione a nefrotossine come antibiotici e farmaci chemioterapici ^4.

AKI comporta danni cellulari improvvisa all'interno del rene, che si verificano comunemente in nefroni, che sono le unità funzionali essenziali, e sono composti da un filtro del sangue e un tubulo segmentato che drena l'urina in collettori centrali ^1. Quando un numero significativo di nefroni sonodanneggiato durante AKI, gli effetti immediati di una interruzione della clearance rifiuti dalla circolazione, e il flusso del fluido ridotta o abolita attraverso nefroni a causa di ostruzione da cellule morte e morenti ^1. Nel corso del tempo, l'ostruzione tubolare può portare alla degenerazione di intere nefroni, che riduce in modo permanente la funzione renale ^1. Alterazioni fisiologiche nel rene seguenti AKI coinvolgono anche eventi infiammatori complessi che possono portare a cicatrici cronica ^1.

Nonostante questi risultati, nefroni hanno una certa capacità di subire rigenerazione dopo AKI che ricostituisce il ^5,6 tubolare dell'epitelio. Mentre vi è stata una comprensione molecolare crescente di rigenerazione nefrone, i meccanismi rimangono sfuggente in molti aspetti e impongono prosecuzione degli accertamenti ^7. La misura in cui AKI si traduce in un danno renale permanente rimane sconosciuta. La ricerca attuale suggerisce il potenziale rigenerativo per il rene è lapiù alto dopo meno gravi casi di AKI, mentre gli episodi più pronunciati o ripetute portano alla malattia renale cronica (CKD) e culminano nella malattia renale allo stadio terminale (ESRD) che richiede il trapianto salva-vita o la dialisi ^8,9. Inoltre, gli individui già affetti da insufficienza renale cronica sono ad un ancora più elevato rischio di contrarre una grave episodio di AKI ^8,9. Nel loro insieme, è chiaro che ha continuato la ricerca di base e clinica è fondamentale per comprendere, trattare e prevenire AKI.

La ricerca con modelli animali è stato determinante per apprezzare la progressione delle alterazioni locali e ambientali che si verificano durante AKI ^10. Per espandere questa comprensione e sviluppare nuove terapie, il modello animale zebrafish è stato impiegato in una varietà di modi ^11,12. I nefroni del rene zebrafish, sia l'embrione e adulti, mostrano un alto grado di conservazione con i mammiferi ^13-16. Inoltre, lesioni epiteliali nefrone in zebrafish assomiglia al processo di vertebrati superiori, per cui la distruzione locale del cellule tubulari è seguita da proliferazione intratubulare e ristabilimento di architettura nefrone ^17-19. Nell'embrione, però, ingenti danni tubulo dalle nefrotossine come cisplatino è associata a letalità ^20,21. In confronto, gli adulti zebrafish sopravvivono AKI e mostrano capacità rigenerative sostanziali nel rene. Ad esempio, dopo l'esposizione al gentamicina antibiotici aminoglicosidi, zebrafish rigenerare tubulo danno epiteliale e far crescere nuove unità nefrone così ^22-24. Mentre questi studi AKI gentamicina indotta hanno fornito preziose informazioni, la comprensione danno renale da diversi nefrotossine rimane fondamentale per apprezzare gli effetti e la risposta a diversi tipi di danni ^25.

L'embrione zebrafish, a causa della sua dimensione, trasparenza, e trattabilità genetica, ha molti vantaggi per gli studi nefrotossina ^{25, in cui il metodo di microiniezione 20,21 viene utilizzato per gestire la molecola (s) per indagini. Nefroni sono formate da 24 ore dopo la fecondazione (HPF) e cominciano a filtrare il sangue di circa il 48 HPF 26,27. Così, la rapida formazione e la funzione del rene embrionale facilita analisi sperimentale. Tuttavia, il processo di microiniezione ha sfide tecniche e non ci può essere una ripida curva di apprendimento per padroneggiare la tecnica. In questo articolo il video, si descrive come eseguire microiniezioni e fornire suggerimenti sulla risoluzione dei problemi al fine di migliorare il tasso di iniezioni di successo.}

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Protocollo

Le procedure per lavorare con embrioni di zebrafish descritte in questo protocollo sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali presso l'Università di Notre Dame.

1. preparazione di soluzioni

1. Fare una soluzione 50x magazzino di E3 mezzi dell'embrione mescolando 73,0 g di NaCl, 3,15 g KCl, 9.15 g CaCl _2, e 9,95 g MgSO ₄ a 5 L di acqua distillata, e conservare a temperatura ambiente.
2. Per la coltura di embrioni di zebrafish, diluire la soluzione 50x magazzino di E3 mezzi embrione stock ad una soluzione di lavoro 1x con acqua distillata, quindi aggiungere 200 ml di 0,05% blu di metilene per ogni 1 L di 1x E3 di agire come fungicida, e conservare a RT.
3. Fare una soluzione pigmentazione blocco di E3 mezzi embrione con 0,003% 1-fenil-2-tiourea (PTU) mediante la combinazione di 40 ml di 50x E3 azione con 0,06 mg PTU. Quindi portare il volume a un totale di 2 L con acqua distillata.
4. Mescolare la O E3 / PTU / N a temperatura ambiente per ottenere la polvere PTU in soluzione. Poi memorizzare l'E3 / PTU aRT.
   Nota: L'E3 / PTU ha una durata di circa una settimana, e le soluzioni più anziani saranno meno efficace nel bloccare lo sviluppo pigmentazione nelle larve zebrafish.
5. Effettuare una soluzione anestetica del 0,2% Tricaine (MS-222) aggiungendo 1 g di Tricaine a 500 ml di acqua distillata e regolare il pH a 7,2 con 1 M Tris, pH 9,5.
6. Preparare per ottenere una soluzione di metilcellulosa 2% per l'imaging ponendo una soluzione di 1x E3 (senza blu di metilene), con ^1/10 volume di 0,2% Tricaine aggiunto a 4 ° C.
   Nota: La soluzione metilcellulosa è una soluzione di spessore, chiaro che viene utilizzato per stabilizzare delicatamente embrioni vivi per la microscopia. Dopo l'esecuzione manipolazioni gli embrioni possono essere lavati in 1x E3 di sciogliere la metilcellulosa senza ferire l'animale e consentendo la microscopia in fasi successive nello stesso campione.
7. Quando raffreddato a 4 ° C, mescolare la soluzione 1x E3 / Tricaine energicamente su un piatto mescolare e aggiungere gradualmente la giusta quantità di metilepolvere di cellulosa, pur continuando a mescolare energicamente. Aggiungere gradualmente la polvere alla soluzione per evitare la formazione di aggregati insolubili metilcellulosa.
8. Dopo tutta la polvere viene miscelato nella soluzione di metilcellulosa / E3 / tricaine 2%, mescolare la soluzione composita in C stanza fredda 4 ° O / N.
   Nota: La temperatura fredda è migliore per sciogliere completamente la polvere. Se la soluzione non è chiara dopo una notte, agitare per una giornata lavorativa supplementare e / o un secondo O / N.
9. Per rimuovere le bolle d'aria dalla soluzione / tricaine E3 2% metilcellulosa /, un'aliquota il composto in provette da 1,5 ml e girano ad alta velocità (12.000 xg) a 4 ° C per 30 minuti o fino a 2 ore.
10. Mettere la soluzione / E3 / Tricaine metilcellulosa 2% a 4 ° C per una conservazione a lungo termine.
    Nota: Prima di utilizzo, le aliquote devono essere pre-riscaldato a temperatura ambiente per lavorare con i campioni di zebrafish.

2. Preparazione di strumenti

1. Preparare uno strumento embrione manipolatore, utilizzato per Podi posizionamento a embrioni per la microiniezione, allegando una punta di caricamento del gel sulla punta di un ago da dissezione dritto 5 ", e fissare con nastro adesivo o colla.
2. Preparare aghi microiniezione con un estrattore ago, dalla prima immissione un fuoco lucido 10 centimetri in vetro borosilicato con filamento nello strumento e fissare il vetro borosilicato stringendo le maniglie.
3. Tirare il vetro borosilicato alla moda aghi fine-conici. Utilizzare le seguenti impostazioni: riscaldare 540, tirare 245, velocità 200, e il tempo 125.
4. Luogo aghi all'interno di una capsula di Petri, li sospensione su una striscia di plastilina per proteggere le punte degli aghi, e mantenere il piatto coperto per evitare l'accumulo di polvere.
5. Per finire di preparare l'ago per microiniezioni, utilizzare un bordo lama di rasoio o pinza sottile per tagliare l'estremità tirato dell'ago per creare una punta tagliente iniezione angolare con un diametro di circa 0,05-0,1 mm.
6. Per rendere il vassoio microiniezione, preparare un 1,5% di agarosio soluzione / E3 in un 100 ml beuta e sciogliere l'agarosio riscaldando il E3 a ebollizione in una microonda indi si lascia raffreddare a temperatura ambiente per circa 10 min.
7. Versare la soluzione di agarosio / E3 raffreddato in una capsula Petri di fare una fondazione con una profondità di circa 0,5 CM. Quando questo è solidificato versare un secondo strato con una profondità di circa 0,3 cm ed inserire lo stampo embrione ben prefabbricati e consentire l'agarosio solidificare a temperatura ambiente.
   Nota: Quando si inserisce lo stampo nello strato / E3 superiore agar, ponendo lo stampo in agar con un angolo di diminuire il numero di bolle d'aria.
8. Quando l'intero vassoio microiniezione ha fissato, sollevare l'embrione prefabbricata ben modellare lentamente e accuratamente con un scoopula, quindi riempire il piatto con la soluzione E3 e conservare a 4 ° C.

3. Preparazione Embrione

1. Impostare serbatoi accoppiamento zebrafish inserendo divisori nelle camere di accoppiamento e riempire con acqua del sistema.
2. Posizionare un pesce su ciascun lato del divisore such che ciascuna camera di accoppiamento contiene una femmina e uno di pesce di sesso maschile, e coprire ciascuna camera di accoppiamento.
3. La mattina seguente, togliere i divisori per consentire la deposizione delle uova.
4. Controllare il pesce dopo circa 30 minuti, e dopo il ritorno gli adulti per l'acquario, raccogliere i loro embrioni facendo passare l'acqua della vasca di accoppiamento attraverso una multa strumento colino rete metallica.
5. Invertire il filtro su una capsula di Petri e risciacquare con E3 per raccogliere gli embrioni.
6. Incubare gli embrioni a 28,5 ° CO / N.
7. Quando embrioni hanno raggiunto la fase 24-26 somite ^26, decantare maggior parte dei media E3 e poi dechorionate aggiungendo 100 ml di 50 mg / ml pronase per ogni piatto di embrioni e incubando il piatto a RT (23 ° C) per circa 15 min.
   Nota: Ci vorranno circa 24-25 ore dal momento della fecondazione per gli embrioni di raggiungere la fase 24-26 somite se sono raccolti nel modo descritto e incubata O / N a 28,5 ° C.
8. Riempire il piatto conE3 e poi miscelare delicatamente per rimuovere i chorions dagli embrioni.
9. Decantare il E3 / pronasi e sciacquare il piatto con 25 ml di E3 fresco. passo risciacquo Ripetere per rimuovere tutti Pronasi.
10. Per bloccare lo sviluppo di pigmentazione, decantare il E3 e sostituire con 25 ml di fresco E3 / PTU quando gli embrioni hanno raggiunto 24 ore dopo la fecondazione.
    Nota: Per gli esperimenti che abbracciano diversi giorni, sostituire la soluzione E3 / PTU con mezzi freschi una volta al giorno per mantenere il piatto pulito.

4. la microiniezione di soluzione nefrotossina

1. Il giorno dell'iniezione, preparare la soluzione nefrotossina desiderata con il controllo del veicolo appropriato.
2. Vortex o mescolare gentilmente per garantire il farmaco (s) è / sono in soluzione, controllando i lati del tubo e superiore della colonna d'acqua.
   Nota: Le soluzioni nefrotossina possono essere preparati per contenere tracce di fluorescente destrano coniugato a monitorare l'efficienza microiniezione e anche valutare la clearance renale a Collpunti di tempo confluente ^20,28.
3. Caricare un ago microiniezione rifinito con ~ 2-3 ml di nefrotossina infilando una punta fine caricamento del gel nella parte posteriore dell'ago e di sospendere l'ago verticalmente con un pezzo di nastro per consentire la soluzione per riempire la punta dell'ago rifilato dalla forza di gravità.
4. Una volta che la punta dell'ago è pieno, garantire l'ago caricato nel micromanipolatore.
5. Testare il volume microiniezione mettendo una goccia di olio minerale su un vetrino micrometrico e iniettare nell'olio per valutare la dimensione delle gocce. Un volume di iniezione di 500 pl ha un diametro di 0,1 mm.
6. Rimuovere il piatto di embrioni dal termostato, e anestetizzare con l'aggiunta di circa 5 ml di 0,2% Tricaine al piatto dell'embrione.
7. Per garantire la completa anestesia, toccare delicatamente embrione con la punta dello strumento dell'embrione manipolatore. La mancanza di movimento indica anestesia sufficiente.
8. Dopo anestesia successo, il trasferimento di embrioni allo stampo di iniezione con un trasfER pipetta.
9. Manovri ogni embrione in una diversa e dello stampo mettendo la testa nella zona più profonda del pozzo in modo che il tronco appoggia lungo la depressione e la coda sporge dalla depressione.
10. Inserire l'ago riempito in micromanipolatore e posizionare la punta dell'ago accanto ad un embrione.
11. inserire delicatamente l'ago nel vaso coda spostando il joystick in avanti e premere il pedale del piede per fornire la microiniezione.
    Nota: iniezione di successo può essere desunta dal guardando il liquido entrare circolazione. Inoltre, co-iniezione della nephrotoxicant con fluorescente destrano coniugato consente al ricercatore di verificare iniezione di successo successivamente alla procedura.
12. Delicatamente tirare indietro il joystick per rimuovere l'ago dall'embrione.
13. Dopo l'iniezione, trasferire gli embrioni per un piatto pulito e risciacquare per rimuovere il Tricaine e sostituirlo con fresco E3 / PTU.
14. Incubare l'embrione fino al punto desiderato tempo di asinis morfologia, che può essere documentata dalla fotografia in metilcellulosa mezzo di montaggio, o di un processo per l'analisi sperimentale, se lo desideri.
    Nota: Il recupero di embrioni deve essere valutato per determinare la percentuale di individui con edema, che indica comunemente danno renale.

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Risultati

Una stazione di microiniezione istituito comprende uno stereomicroscopio, micromanipolatore e regolatore di pressione (Figura 1A). Transilluminazione della piastra iniezione è preferibile visualizzare campioni durante questa procedura (Figura 1B). Preparazione dell'ago iniezione coinvolge tirando il vetro borosilicato appropriata, seguita preparando il bordo con taglio e back-caricare l'ago fine. In modo ottimale, la punta dell'ago è smussa...

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Discussione

Un svariato numero di agenti terapeutici sono stati associati con AKI ^29. Ci sono stati notevoli progressi della ricerca nella comprensione del danno indotto da molti composti individuali, come la gentamicina aminoglicosidi ³⁰ e il cisplatino chemioterapico ampiamente usato ^31,32. Alcuni cambiamenti patologici coinvolti in queste condizioni, tuttavia, rimangono oggetto di studio in corso. Una sfida emergente rimane la comprensione di come più farmaci influenzano negativamente i pazienti...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	American Bioanalytical	AB01915
Potassium Chloride	American Bioanalytical	AB01652
Calcium Chloride	American Bioanalytical	AB00366
N-Phenylthiourea (PTU)	Aldrich Chemistry	P7629
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)	Fluka Analytical	A5040
Borosilicate glass	Sutter Instruments Co.	BF100-50-10
Flaming/Brown Micropipette puller	Sutter Instruments Co.	Mo. P097
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Methylene Blue	Sigma-Aldrich	M9140
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:
60 mm x 15 mm	VWR	25373-085
100 mm x 15 mm	VWR	25373-100
(microinjection tray) 150 mm x 15 mm	VWR	25373-187
Low Temperature Incubator	Fischer Scientific	11 690 516DQ
Micro Dissecting Tweezer	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5010
Micrometer	Ted Pella, Inc.	2280-24