In Vitro permeazione di ferritine FITC-caricati attraverso un Rat barriera emato-encefalica: un modello per studiare la consegna di Nanoformulated Molecole

Riepilogo

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

Abstract

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

Introduzione

La resistenza del sistema nervoso centrale (SNC) malattie (es. Cancro, epilessia, depressione, schizofrenia e disturbo neurologico HIV-associato) alle terapie farmacologiche è dovuto a diversi meccanismi diversi, tra cui arduo permeazione farmaco attraverso la barriera emato-encefalica (BBB) . La BBB è il confine che isola i tessuti cerebrali da sostanze circolanti nel sangue. All'interno di questa barriera, uno strato di cellule microvascolari cerebrali endoteliali (BMECs), supportati da periciti e astrociti endfeet, è responsabile per l'alta selettività della BBB a tali farmaci idrosolubili con un peso molecolare superiore a 400 Da ^1. Un altro meccanismo di resistenza connessa alla droga è legata alla presenza sul BMECs di trasportatori di efflusso di droga (P-glicoproteina e multidrug resistance proteine), che co-operano per ridurre la penetrazione farmaco nel sistema nervoso centrale e facilitare la loro espulsione dal cervello ^2.

Nell'ultima decade, Sono stati sviluppati un gran numero di approcci nanotecnologici per affrontare la sfida clinico e biologico di fornire farmaci attraverso la BBB ^3-6. In questo contesto, nanosfere ferritina (FNN) rappresentano una soluzione completamente innovativa e promettente. FNN sono 12 sfere nm di 24 auto-assemblaggio ferritina (Fn) monomeri, che sono disposti in una struttura sferica cava di diametro interno 8 nm. subunità ferritina possono essere smontati a pH acido e riassemblate in un modo a memoria di forma, portando il pH a neutralità, permettendo varie molecole organiche per essere incapsulati. Pertanto, FNN rappresentano un modello interessante per lo sviluppo di multifunzionale drug delivery sistemi ^7,8. Inoltre, FNN può interagire con BMECs grazie al riconoscimento specifico di transferrina Receptor (TfR) 1, che è espresso sulla membrana luminale di queste cellule ^9.

Finora, diversi modelli in vitro della BBB sono stati sviluppati in order per chiarire trans-BBB permeabilità ai vari farmaci, tossicità verso la BBB, o l'interazione di molecole con trasportatori di efflusso. Infatti, questi modelli sono considerati validi in vitro approcci per un rapido screening di molecole attive prima di procedere con studi in vivo. Questi modelli sono costituiti da un singolo strato endoteliale dei BMECs o BMECs e astrociti co-coltura (più raramente periciti), ottenuto da animali (ratti, topi, maiali e bovini) o linee cellulari umane ^10,11,12. Il transendoteliale Resistenza elettrica (TEER) e la permeabilità apparente (P _app) di traccianti con un peso molecolare definito rappresentano due parametri critici che vengono utilizzati per determinare la qualità del modello in vitro. Qui si descrive l'impiego di un modello BBB in vitro, sulla base di una co-coltura di ratto BMECs (RBMECs) e nel ratto astrociti corticali (RCA) per studiare la permeazione trans-BBB di nanocages ferritina incapsulare isothi fluoresceinaocyanate (CIC).

Protocollo

1. Stabilire il modello BBB

Nota: Per stabilire il modello BBB si consiglia di utilizzare commercialmente disponibili RBMECs primarie e RCA. Tutte le operazioni devono essere eseguite con i reagenti e prodotti monouso sterili, trattati in una cappa a flusso laminare.

1. Coltura cellulare
   1. Coat fiasche di coltura cellulare con poli-L-lisina 100 mg / ml (1 ora a RT) o fibronectina 50 mg / ml (1 ora a 37 ° C) per promuovere l'attaccamento di RCA o RBMECs, rispettivamente. Poi, disgelo 1 x 10 ⁶ RCA e 5 x 10 ⁵ RBMECs in cellule endoteliali medio, integrati con il 5% di siero fetale bovino, 1% supplemento di crescita delle cellule endoteliali e l'1% di penicillina / streptomicina (SECM). RCA seme in un pallone T175 in 20 ml SECM e RBMECs in un pallone T75 in 10 ml SECM.
      Nota: Lo scongelamento e passaggi semina di RCA e RBMECs devono essere regolati, in termini di densità cellulare e tempo di coltura, in base al numero di condizioni sperimentali da testare con il modello BBB. Con l'iniziore con 1 fiala di 1 x 10 ⁶ RCA e 1 fiala di 5 x 10 ⁵ RBMECs, è possibile avere fino a 20 inserti BBB-cuscinetto.
   2. Mantenere le cellule a 37 ° C e 5% CO ₂ in atmosfera umidificata per circa 6 giorni, fino a circa 80% di confluenza per RCA e oltre il 90% di confluenza per RBMECs. Staccare cellule utilizzando soluzione tripsina-EDTA (tripsina 1: 250) per 5 min (1 ml tripsina per palloni T75 e 2 ml per palloni T175). Interrompere l'attività tripsina con SECM (2: 1), sospensioni di cellule centrifugare a 750 g per 5 minuti e risospendere il pellet in 60 ml SECM.
   3. Dividere le RBMECs in 3 palloni T175 e la cultura in SECM per altri 3 giorni prima della semina su inserti. Contare il numero totale di RCA vivente, osservando una sospensione cellulare diluita 1: 1 con trypan blu al microscopio ottico in una camera di Burker.
2. Cellulare Semina su Inserti
   1. Trattare un lato del tereftalato di polietilene (PET) membrana 6 multi-ben traspainserti ORL con poli-L-lisina 100 ug / ml e l'altro lato con fibronectina 50 pg / ml, per consentire fissaggio di RCA e BMECs. Maniglia gli inserti con pinzette per evitare il contatto con la membrana PET.
      1. Mettere gli inserti in una piastra 6 bene e aggiungere la soluzione fibronectina (minimo 500 microlitri) nella camera superiore. Dopo 1 h di incubazione a 37 ° C, rimuovere la soluzione di fibronectina, prendere gli inserti fuori la piastra multi-pozzo e metterli capovolta sul fondo di un 150 centimetri piatto ² Petri, che viene qui utilizzato come supporto sterile per la già ricoperto gli inserti.
      2. Delicatamente aggiungere 800 ml di poli-L-lisina sul lato inferiore dell'inserto (come mostrato in figura 1A, denominato RCA semina), e mantenere la soluzione sugli inserti per 1 ora a RT.
      3. Aspirare la soluzione e lasciare gli inserti asciugare a temperatura ambiente per 15-30 minuti. Gli inserti sono ora pronti per la semina delle cellule, ma possono anche essere memorizzati nella piastra multi-bene per diversigiorni a 4 ° C, prima di proseguire con la costruzione BBB.
         Nota: Ricordarsi di mantenere almeno 3 inserti rivestiti libera dalle cellule, per essere utilizzati come controlli per convalidare stabilimento BBB da FD40 misure di flusso.
   2. RCA Seed (35.000 / cm ²⁾ sul lato inferiore degli inserti poli-L-lisina rivestite, facendo cadere 800 ml di sospensione cellulare sul capovolto inserto (Figura 1A). Lasciare la sospensione RCA sugli inserti per 4 ore a temperatura ambiente, al fine di consentire l'attaccamento efficiente delle cellule alla membrana.
   3. Aspirare la soluzione residua, posizionare gli inserti in pozzetti contenenti 2 ml di SECM e mantenere la piastra multi-pozzo a 37 ° C e 5% CO ₂ in atmosfera umidificata, cambiando il SECM ogni 2 giorni.
   4. Dopo 3 giorni, quando le RCA sono rivestite con la faccia inferiore dell'inserto, RBMECs seme sul lato superiore dell'inserto, nel seguente modo:
      1. Staccare RBMECs da fiasche T175 e contare ilcellule viventi totale, come riportato nei passi 1.1.2 e 1.1.3.
      2. RBMECs Seed (60.000 / cm ²⁾ sulla superficie superiore dell'inserto in SECM (1.000 ml) (Figura 1B), lasciando 3 inserti con solo le astrociti, da utilizzare come TEER sfondo. Posizionare la piastra multi-bene in condizioni di coltura standard. Mantenere il sistema di coltura per almeno 3 giorni, cambiando la SECM nella camera interna ed inferiore ogni 2 giorni.

2. Convalida BBB

1. misura TEER
   1. Il giorno 3 ^° di co-coltura, controllare la TEER inserendo gli inserti BBB-cuscinetto in una camera appropriata (che ha un tetto e dove sia da camera e berretto contengono una coppia di tensione di rilevamento e elettrodi di corrente), pieno di 4 ml di SECM. Connessione a una epiteliale tessuto volt / ohmetro.
   2. Insieme con le misure TEER della BBB-sistemi cellulari, registrare i valori TEER dei 3 inserti recanti i RCA Tha saranno sottratti dai valori ottenuti con il BBBs. Moltiplicare i valori TEER risultanti dalla superficie dell'inserto (4.2 cm ²⁾ per esprimere i risultati come Ω x cm ^2.
   3. Dal 3 ^° giorno di co-coltura, misurare la TEER ogni giorno. Nota: Dopo un periodo iniziale in cui aumenta la TEER, i valori registrati sono stabili per almeno due giorni consecutivi (di solito tra il 5 ^° e il 7 ^° giorno di co-coltura). A quel punto la BBB è pronto per la seconda fase di validazione (sezione 2.2) e / o per gli esperimenti trans-BBB.
      Nota: La procedura descritta nella sezione 2.1 può essere effettuata sugli stessi BBB-sistemi dedicati ai seguenti esperimenti permeabilità (sezione 3). Operare in condizioni sterili.
2. Trans-BBB flusso di FITC-destrano 40 (FD40)
   1. Misurare il flusso FD40 dalla tomaia alla camera inferiore dei modelli BBB rispetto a quella di tutti 3 inserti vuoti(Vedi nota sezione 1.2.1) secondo le seguenti fasi:
      1. Aggiungere 1 mg / ml FD40 (diluito in SECM) nel vano superiore del BBBs, e dopo 1, 2 e 3 ore ritirare 200 microlitri SECM dalla camera inferiore e misurare l'intensità di fluorescenza dai spettrofluorimetro (λ _ex 488 nm, λ _em 515 nm, fessura 5).
      2. Ottenere i valori per SECM sfondo fluorescenceby, di 500 l di media vergine utilizzando gli stessi parametri analitici. Sottrarre la fluorescenza di fondo SECM da tutti i valori di fluorescenza FD40.
      3. Determinare la quantità di permeato FD40 per confronto dei valori di fluorescenza osservati con una curva di calibrazione prodotto con concentrazioni note (es. 0,312, 0,625, 1,25, 2,5 mg / ml) di tracciante fluorescente sciolti in 500 ml di SECM.
      4. Calcolare il coefficiente di permeabilità apparente (P _app) dai valori medi di flusso secondo:
         P _app = J / AC
         Dove J è il flusso della molecola (moli / sec), A è l'area permeazione (cm ²⁾ e C è la concentrazione della molecola nel compartimento superiore (moli / cm ^3).
         Nota: Tre o più BBB-sistemi che hanno raggiunto valori TEER adatti, devono essere dedicati esclusivamente a questa procedura di convalida, e non dovrebbero essere impiegati per i seguenti esperimenti permeabilità (sezione 3). La sterilità non è obbligatorio.

3. Trans-BBB permeazione di FITC-caricato ferritine (FNN)

Nota: Una variante ricombinante di ferritina umana (Fn), prodotto in Escherichia coli e assemblati in nanocages (FNN) per l'incapsulamento di molecole fluorescenti differenti, è disponibile presso la NanoBioLab del Prof. Prosperi (Università degli Studi di Milano-Bicocca, Italia). FNN sono caricati con FITC, secondo il protocollo descritto in precedenza ¹³ e le concentrazioni sia Fn e le molecole caricate sono accuratamente determined.

1. Trans-BBB flusso di FITC e FITC-FNN
   1. Misurare il flusso FITC-FNN dalla tomaia alla camera inferiore di modelli BBB convalidati (generalmente al 5 ^° - 7 ^° giorno di co-coltura), rispetto a quella del colorante libero dopo 7 e 24 h di incubazione, secondo le seguenti operazioni:
      1. Aggiungere FITC-FNN (50 ug / ml FNN, 1.1 pM FITC) o una quantità uguale di connessione FITC nella camera superiore di almeno 6 sistemi BBB per ogni formulazione, per ritirare 2 ml di soluzione di SECM dalla camera inferiore almeno 3 inserti dopo 7 ore, e dalla camera inferiore di altri 3 inserti dopo 24 ore.
      2. Misurare l'intensità di fluorescenza di 500 ml di campioni raccolti da spettrofluorimetro (λ _ex 488 nm, λ _em 515 nm, fessura 5).
      3. Ottenere la fluorescenza di fondo SECM misurando 500 microlitri di media utilizzando gli stessi parametri analitici. Sottrarre la fluorescenza di fondo SECMda tutti i valori di fluorescenza FITC o FITC-FNN.
      4. Determinare la concentrazione di permeato FITC o FITC-FNN confrontando i valori di fluorescenza ottenuti con due differenti curve di calibrazione ottenuti con concentrazioni note (es. 6,87, 13,75, 27,5, 55 nM) del colorante libero o nanoformulated sciolti in 500 microlitri SECM.
2. FITC-FNN Localizzazione in RBMECs
   1. Rimuovere SECM dalla camera superiore dei sistemi BBB, lavare gli inserti con PBS e fissare le RBMECs su almeno due inserti per ogni gruppo sperimentale aggiungendo 500 microlitri paraformaldeide (4% in tampone fosfato salino-PBS) nello scomparto superiore per 10 min a RT.
   2. Lavare gli inserti tre volte con PBS per rimuovere paraformaldeide residuo.
      Nota: Da questo punto in poi, la sterilità non è necessario.
   3. Tagliare adeguati pezzi della membrana PET, e procedere con la immunodecoration delle cellule secondo le seguenti fasi:
      1. permeabilitàlize RBMECs con 0,1% Triton X-100 in PBS per 10 minuti. Eseguire una fase di blocco per 1 ora a RT con una soluzione contenente 2% di albumina sierica bovina (BSA), 2% di siero di capra in PBS. Incubare i campioni con un Willebrand fattore anti-Von (VWF) a 1:20 di diluizione, per 2 ore a temperatura ambiente.
      2. Dopo aver lavato tre volte con PBS, esporre le cellule per 2 ore a temperatura ambiente ad una BSA 2%, soluzione al 2% siero di capra contenente un anticorpo secondario adatto ad una diluizione 1: 300 per rivelare l'anti-VWR e DAPI a 1: 1.500 diluizione per il rilevamento dei nuclei.
   4. Montare i pezzi inserto su vetrini da microscopio utilizzando una soluzione di montaggio Antifade (una goccia al frammento di inserimento), quindi chiudere il campione con un vetrino. Analizzare mediante microscopia confocale utilizzando un obiettivo a immersione in olio a 40X di ingrandimento, 1.5 zoom e risoluzione 1.024 x 1.024 pixel.

Risultati

Durante la creazione del modello di BBB, l'attaccamento cellulare e la crescita sugli inserti possono essere monitorati utilizzando un microscopio ottico, grazie alla natura trasparente delle membrane in PET. RCA, seminate ad una densità di 35.000 cellule / cm ^2, collegare in modo efficiente al lato inferiore dell'inserto dopo 4 ore di incubazione a RT (Figura 2A) e crescere per coprire la superficie della membrana in 3 giorni, prendendo una morfologi...

Discussione

Il metodo in vitro qui descritto rappresenta un approccio utile convalidato per studiare la consegna trans-BBB di molecole fluorescenti su nanoformulation con le nanoparticelle. Qui usiamo FNN, che rappresenta un buon candidato per studiare la traslocazione di molecole cargo attraverso la BBB. FNN è considerato il Nanovector d'oro per trans-BBB consegna della droga / agenti in quanto è espressamente riconosciuto dal recettore TfR1, che si esprime sulla membrana luminale di BMECs e media l'assorbimento...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Brain Microvascular Endothelial Cells	Innoprot	P10308	isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen
Cortical Astrocytes	Innoprot	P10202	isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen.
Endothelial Cell Medium kit	Innoprot	P60104	ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light
Trypsin-EDTA without Phenol Red	EuroClone	ECM0920D	Warm in 37 °C water bath before use
Fluorescein isothiocyanate-dextran 40,000	Sigma	FD40S	protect from light
paraformaldehyde	Sigma	158127	diluition in chemical hood
Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg	EuroClone	ECB4004L
Triton X-100	Sigma	T8787
bovine serum albumin	Sigma	A7906
goat serum	EuroClone	ECS0200D
mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor	Dako	M0616
AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs	ThermoFischer Scientific	A-11003	protect from light
DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole)	ThermoFischer Scientific	D1306	protect from light
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFischer Scientific	P36934
Poly-L-lysine Hydrobromide	Sigma	P1274	the same solution can be used several times
fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141	the same solution can be used several times
Polyethylene terephthalate (PET) inserts	Falcon	F3090	Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area
T75 Primo TC flask	EuroClone	ET7076
T175 Primo TC flask	EuroClone	ET7181
EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter	World Precision Instruments Germany	EVOM2
Endohm- 24SNAP cup	World Precision Instruments Germany	ENDOHM-24SNAP
Light/fluorescence microscope with camera	Leica Microsystems	DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module	inverted microscope for live cells with camera
Confocal Microscope	Leica Microsystems	TCS SPE
Spectrofluorimeter	Jasco	FP-8000