Un metodo di isolamento delle cellule mirata tramite Glass funzionalizzazione superficiale

Riepilogo

This protocol describes customizable surface functionalization of the desthiobiotin, streptavidin, and APTES system in order to isolate specific cell types of interest. In addition, this manuscript covers the applications, optimization, and verification of this process.

Abstract

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual nuances in expression from patient to patient. Current methodologies that try to separate cells to fill this niche result in disruption of physiological expression, making the separation technique useless as a diagnostic tool. In this protocol, we describe the functionalization and optimization of a surface for the cellular capture and release. This functionalized surface integrates biotinylated antibodies with a glass surface functionalized with an aminosilane (APTES), desthiobiotin and streptavidin. Cell release is facilitated through the introduction of biotin, allowing the recollection and purification of cells captured by the surface. This release is done through the targeting of the secondary moiety desthiobiotin, which results in a much more gentle release paradigm. This reduction in harsh reagents and shear forces reduces changes in cellular expression. The functionalized surface captures up to 80% of cells in a single cell mixture and has demonstrated 50% capture in a dual-cell mixture. Applications of this technology to xenografts and cancer separation studies are investigated. Quantification techniques for surface verification such as plate reader and ImageJ analyses are described as well.

Introduzione

Da banco approcci separazione cella corrente (ad esempio, la fluorescenza delle cellule attivate di smistamento ^1, cattura laser micro-dissezione ^2, immuno-magnetico tallone ^di separazione ¹⁾ può richiedere diverse ore di preparazione e smistamento. Questi grandi scale temporali possono influenzare i livelli di risposta e di espressione fisiologici, con conseguente analisi che non sono rappresentativi della risposta fisiologica ^3. I sistemi sono necessari che possono rapidamente ed efficacemente isolare specifici tipi cellulari senza interrompere recettore livelli di superficie cellulare per migliorare l'isolamento delle cellule e arricchimento per applicazioni biomediche. Pertanto, il razionale per il nostro approccio è quello di sviluppare un approccio dolce per l'isolamento delle cellule.

Il "lab on a chip" concetto offre la promessa di ordini di grandezza più veloce di isolamento cellulare (ore-to-minuti), e coinvolge più frequentemente catturare cellule su una superficie e rilasciare cellule o conte intracellularenti attraverso fisico ^4,5 o metodi chimici ^6. Anche se questi approcci offrono alcuni vantaggi, quali l'identificazione dell'espressione proteica ^7,8, individuando espressione di RNA ^9-11, o addirittura fornire cellule per coltura in vitro ^12,13, molte di queste tecniche non può essere tradotto per la diagnostica, come recettore delle cellule profilatura a causa ai loro ambienti non fisiologici. Agenti di sollevamento enzimatici come la collagenasi può colpire anche queste quantità del recettore ^14,15, cioè le tecniche di quantificazione recettore delle cellule che utilizzano questi agenti di sollevamento non genererà dati fisiologici precisi. Lisi cellulare impedisce differenziazione tra i recettori di superficie nativi e quelli precedentemente internalizzato ^16. Questo protocollo descrive un approccio rapido e delicato per l'isolamento delle cellule.

Protocollo

1. Pulizia della superficie di vetro e Preparazione Reagenti

1. Inserire una superficie di vetro in una macchina di plasma di ossigeno per 5 min a 50% di potenza per pulirlo.
2. Preparare ricostituito (3-amminopropil) trietossisilano (APTES) soluzione 2,5 ml 2%, con l'aggiunta di 50 ml di APTES e 2,45 ml di etanolo in un tubo conico.

2. APTES e DSB Funzionalizzazione

1. Aggiungere la soluzione APTES alle superfici. Dispensare 150 ml per pozzetto per 8 pozzetti. Pipettare 100 ul per pozzetto per 24 pozzetti. Pipettare 1,1 ml per piatti di vetro 60 x 15 mm. Coprire le superfici per evitare l'evaporazione e la distribuzione non uniforme della soluzione APTES. Collocare le superfici su un agitatore piattaforma per 50 min a temperatura ambiente, che crea una distribuzione uniforme dello strato APTES.
   NOTA: APTES è un aminosilane che forma il primo strato di superficie. Se si utilizza una superficie diversa, euristicamente determinare il volume di soluzione necessario per coprire la superficie.
2. Selezionare la temperatura del forno, mentre le superfici sono shaker: Riscaldare a 55 ° C per 2 ore per gli 8 pozzetti e 24 pozzetti. vetro di calore solo piatti a 90 ° C per 1 ora.
3. Lavare le superfici con etanolo.
   1. Somministrare la quantità di etanolo richiesto facendo riferimento basato sulla superficie utilizzata. Aggiungere 150 ml di etanolo a ciascun pozzetto per 8 pozzetti. Aggiungere 125 ml di etanolo a ciascun pozzetto per 24 pozzetti. Aggiungere 1,1 ml di etanolo per piatti di vetro.
   2. Risciacquare la superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l'angolo del pozzo. Tenere la pipetta in un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie. Risciacquare altre due volte con etanolo.
      NOTA: Se uno dei fondo di vetro piatti e hanno alcuna plastica in loro, non li riscaldare superiore a 65 ° C, come la plastica inizierà a sciogliersi e ordito.
4. Lavaggio con gas 100% di azoto erogato da un serbatoio. Mettere le superfici in oVen.
5. Preparare 2,5 ml di soluzione di d-desthiobiotin (DSB) combinando 1,5 mg / ml DSB in 37,5 ml di dimetilsolfossido (DMSO), e 5 mg / ml-etil-1 3- (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC) in 2462,5 microlitri della (pH 6) tampone 0,1 M di acido 4-morpholinoethanesulfonic hydrate (MES). Poi combinare entrambe le soluzioni.
6. Aggiungere 1 ml di 2-mercaptoetanolo β, dopo 15 minuti, nella soluzione di estinguere la reazione tra DSB e EDC. Rimuovere APTES calde funzionalizzati superfici di vetro dal forno. Attendere 5-10 min per le superfici in vetro a raffreddarsi.
7. Aggiungere MES tampone la superficie da lavare, utilizzando importi basati sulla superficie. Aggiungere 150 ml MES tampone di 8 pozzetti. Aggiungere 125 microlitri MES tampone di per 24 pozzetti. Aggiungere 1,1 ml MES buffer per piatti di vetro.
8. Risciacquare superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l'angolo del pozzo. Tenere la pipetta ad un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamentenella superficie. Risciacquare altre due volte con tampone MES.
9. Applicare la soluzione DSB alle superfici da consentire loro di incubare. Aggiungere 150 microlitri soluzione DSB per ben 8 pozzetti. Aggiungere 100 pl per soluzione DSB bene per 24 pozzetti. Aggiungere 1,1 ml di soluzione di vetro piatti DSB.
10. Posizionare le superfici in vetro DSB coperti su un tovagliolo di carta umido all'interno di una capsula di Petri. Coprire e incubare in un C frigo a 4 ° C per 18-24 ore.

3. Streptavidina Funzionalizzazione

1. Risciacquare ogni superficie di vetro tre volte con 1 ml di 1.0x tampone fosfato (PBS). Risciacquare superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l'angolo del pozzo. Tenere la pipetta in un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie. Diluire la soluzione streptavidina (SAV) stock di 0,4 mg / ml (consigliato).
   NOTA: PBS isotonica modo che possa essere utilizzato come mezzo per diluizione e risciacquo. PBS è usato come solvente per il SAv, e quindi, non influenzerà la capacità del SAv per legarsi alla superficie.
2. Applicare 0,4 mg / ml di soluzione di SAv uniformemente alle superfici in modo che un sottile strato di forme sul fondo del bicchiere, selezionare la quantità di soluzione basata sulla superficie. Per 8 pozzetti, aggiungere la soluzione SAv 150 ml 0,4 mg / ml per pozzetto. Per 24 pozzetti, aggiungere la soluzione SAv 100 ml 0,4 mg / ml per pozzetto. Per i piatti di vetro, aggiungere la soluzione SAv / ml 1,1 ml 0,4 mg.
3. Coprire e spostare le piastre a 14 cm capsula di Petri di trattenere l'umidità. Incubare la piastra di Petri in frigorifero per 18-24 ore.
   NOTA: E 'essenziale utilizzare volumi consistenti di APTES, DSB, e SAV su ogni superficie.
4. Risciacquare ogni superficie di vetro per tre volte con 150 ml di PBS per rimuovere SAv. Risciacquare superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l'angolo del pozzo. Tenere la pipetta in un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie.
5. Bagnare un tovagliolo di carta wesimo acqua deionizzata e posizionare il tovagliolo di carta appartamento a 14 centimetri Petri che circonda le piastre per trattenere l'umidità nei pozzetti. Coprire la piastra di Petri contenente i pozzi. Incubare la piastra di Petri in un livello 1 (BSL-1) frigorifero 4 ° C fino al momento biosicurezza.

4. Acquisizione delle cellule e di uscita

1. Inizia con pallone T175 (s) di cellule destinati per l'esperimento. Aspirare il supporto dal pallone (s). Lavare i media rimanenti con 5 ml di temperatura ambiente PBS. Aspirare PBS dal pallone (s).
2. Aggiungere 10 ml di agente di sollevamento non enzimatica, come cellule dissociazione Solution, al pallone T-175 delle cellule. Mettere il pallone in incubatrice per 6 minuti per consentire il sollevamento delle cellule dal pallone.
3. Dopo 6 minuti, aggiungere 10 ml di soluzione salina bilanciata freddo di Hank (HBSS; Vedi elenco dei materiali) per inattivare l'agente di sollevamento. Estrarre 20 ml di cellule per contare il numero di cellule in soluzione utilizzando un emocitometro.
   NOTA: A seconda del funcsuperfici utilizzate nell'esperimento cattura tionalized, il numero di cellule necessaria varia. Per funzionalizzati 8 pozzetti, utilizzare 300.000 cellule per pozzetto. Per i piatti di vetro funzionalizzati, utilizzare 1,1 milioni di cellule. Per funzionalizzati 24 pozzetti, sono raccomandati 125.000 cellule. Maggiori informazioni sul conteggio delle cellule si trova nel Supplemento.
4. Ripetere i punti 4.1- 4.3 per un altro fiasco di cellule, se un numero inferiore di cellule sono presenti quanto necessario per l'esperimento. Unire sospensioni cellulari e cellule raccontano per ottenere il numero totale di cellule in soluzione.
5. Centrifugare sospensione di cellule in una centrifuga a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C per ottenere un pellet di cellule concentrate. Trova la quantità appropriata di HBSS aggiungere alla sospensione cellulare per ottenere una concentrazione di 1 x 10 ⁶ cellule per ml, quindi aspirare il supernatante dalle cellule centrifugare e aggiungere il volume calcolato. Questo volume può essere calcolata utilizzando le equazioni nel supplemento.
6. Pipetta su e giù (triturare) per risospendere °e le cellule in soluzione e ridurre aggregazione cellulare in soluzione che può ridurre legame degli anticorpi. Dividere la soluzione cellulare in soluzioni sperimentali di controllo separata e. Visualizza File supplementare per i componenti e calcoli.
7. Aggiungere gli anticorpi biotinilati alle rispettive soluzioni di cellule, come descritto nel file supplementare. Incubare per 30 minuti a 4 ° C in un mixer end-over-end.
   NOTA: Per le cellule MCF7GFP, 0,5 mg / ml hIgG o 0,5 mg anticorpi / ml HLA-ABC sono raccomandati. Per macrofagi RAW, 1 mg / ml mCD11b sono raccomandati a metà del volume per tenere conto delle differenze di diluizione. Per le cellule ombelicale Vena endoteliali (HUVEC), 0,5 mg / ml hCD31 è raccomandato.
8. Lavare la superficie di vetro funzionalizzata con HBSS. Per questo esperimento, si consiglia una piastra 8 bene.
   1. Aggiungere 150 microlitri HBSS ad ogni pozzetto per 8 pozzetti. Risciacquare altre due volte con HBSS. Risciacquare superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l'angolo del pozzo.Tenere la pipetta in un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie. Mantenere freddo a 4 ° C.
9. Aggiungere le soluzioni cellulari ai pozzetti ed attendere 45 min per le cellule di incubare su ghiaccio sul shaker. Effettuare la soluzione di biotina in sterili HBSS utilizzando volumi calcolati come descritto nel supplemento.
10. Rimuovere la soluzione di cellule dai pozzetti vetro utilizzando HBSS.
    1. Delicatamente pipetta 150 microlitri HBSS in tutti i pozzetti. Pipettare quindi il HBSS. Risciacquare superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l'angolo del pozzo. Tenere la pipetta in un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie.
    2. Ripetere altre due volte. Dopo il lavaggio, aggiungere HBSS ai pozzetti per mantenere le cellule bagnato.
11. Aggiungere 150 ml di soluzione di biotina 20 mm a ogni rispettivo rilascio bene, e poi attendere 20 minuti per consentire la reazione.
12. Ricordare cellule non specificamente, legatos mediante lavaggio con HBSS come detto sopra, e quindi se si utilizza cellule fluorescente, procedere alla fluorescenza immagine cellule. Anche immagine cellule vive in un pallone (come controllo, per confrontare con le cellule nel pozzo). Se si utilizza verdi proteina fluorescente (GFP), le cellule trasfettate, l'eccitazione sarà 470 nm, e l'emissione sarà 515 nm.

5. Anticorpo Ottimizzazione: la titolazione degli anticorpi

1. Iniziare sollevando le cellule dal pallone T75 o T175, come spiegato al punto 4.1- 4.3.
   NOTA: Questi volumi sono tarati per 24 pozzetti, ma possono essere modificati per adattarsi a qualsiasi superficie di vetro funzionalizzati attraverso test euristico. Una titolazione rappresentante anticorpo è mostrato in Figura 1.
2. Contare le cellule utilizzando l'emocitometro e quindi centrifugare la soluzione di cellule in una provetta conica a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Ricostituire cellule di 1 milione di cellule per ml, utilizzando i calcoli descritti nel supplemento.
3. Dividere il 1 mcellule ilioni per ml di soluzione in sei diverse soluzioni di 500 ml in diverse provette da centrifuga per l'anticorpo (Ab) soluzioni.
   1. Diluire la soluzione di anticorpi stock da 10 mg / ml, 1 mg / ml, 100 ng / ml, 10 ng / ml, 1 ng / ml. Creare i controlli utilizzando 100 ml di Stain tampone (PBS + 1% di sodio azide + 1% BSA), e 500 microlitri di cellule per il controllo senza Ab in esso. Per il controllo in bianco (No Ab e non le cellule), utilizzano una soluzione di 300 l di PBS.
      NOTA: ATTENZIONE: La sodio azide è estremamente tossici, esplosivi, e l'estrema cura deve essere presa quando lo si utilizza. Si prega di consultare la scheda di sicurezza (SDS) e utilizzare l'equipaggiamento di sicurezza appropriato.
4. Combinare e incubare le soluzioni Ab con le soluzioni di cellule del mixer end-over-end a 4 ° C per 30 min. Sciacquare i funzionalizzati 24 pozzetti con HBSS tre volte. Risciacquare la superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l'angolo del pozzo. Tenere il pi grecopipetta ad un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie.
5. Aliquota 125 ml di ogni soluzione campione nelle APTES appropriati, DSB, e SAV funzionalizzati bene. Incubare a 4 ° C o su ghiaccio per 45 min sulla superficie del vetro. Risciacquare la superficie con HBSS tre volte per rimuovere le cellule non specificamente collegati. Risciacquare superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l'angolo del pozzo. Tenere la pipetta in un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie. Non sciacquare la riga inferiore, come quelli sono i controlli.
6. Aggiungere 150 ml di HBSS ad ogni lavato bene, mettere i 24 piastre e su ghiaccio, e quindi utilizzare un lettore di piastre per misurare la fluorescenza delle cellule GFP (eccitazione 485 nm / emissione 528 nm).

6. cellulare Ottimizzazione: Titolazione cellulare

1. Sollevare le cellule di cui al punti 4.1 -4.3.
2. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Spin giù cellulare in modoluzione in tubo conico a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Ricostituire le cellule a 1 milione di cellule per ml.
   NOTA: Ulteriori informazioni sull'uso del emocitometro può essere trovato nel supplemento.
3. Pipettare 1,6 ml della soluzione di cellule per lo stock di 1,6 milioni di cellule e mettere in un tubo conico. Pipetta 800 ml di cellule dalla soluzione di cellule per lo stock di 800.000 cellule e mettere in un tubo conico. Pipettare 80 microlitri dal magazzino delle cellule per lo stock di 80.000 cellule e mettere in un tubo conico. Dispensare 8 microlitri dal magazzino cella per 8.000 cellule magazzino e posto in un tubo conico.
   NOTA: Le concentrazioni sono date per 8 misure pozzetti, replicare, se necessario. Un esempio di output piastra è illustrata nella Figura 2.
4. Prendere le soluzioni quattro Stock e spin in una centrifuga a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Risospendere tutte le soluzioni azionari in 400 ml di HBSS.
5. Aggiungere 1,6 microlitri di 100 anticorpi ng / ml per lo stock 1,6 milioni di cellule, 0,8 μl allo stock 800.000 cellule, e 0,5 ml a tutti gli altri stock. Incubare l'anticorpo per 30 minuti nel mixer end-over-end per 30 minuti a 4 ° C. Lavare la superficie di vetro funzionalizzato con HBSS tre volte.
   NOTA: La piastra ben funzionalizzati 8 è consigliato per la microscopia quantificazione, mentre il 24 pozzetti funzionalizzato è raccomandato per lettore di piastre quantificazione. concentrazione dell'anticorpo per 8.000 cellule azione non è stata ridotta per consentire il fattore limitante della superficie cattura di non essere la mancanza di anticorpi in soluzione, ma piuttosto le proprietà cattura della superficie.
6. Applicare 150 ml di soluzioni campione in ciascun pozzetto. Applicare lo stock 1,6 milioni cella alla prima colonna di pozzi a sinistra. Applicare lo stock 800.000 cella alla seconda colonna da sinistra. Applicare lo stock di 80.000 cellule per la terza colonna da sinistra. Infine applicare lo stock di 8.000 cellule per l'ultima colonna. Incubare per 45 minuti a 4 ° C su shaker.
   NOTA: Il 1,6 milionicella stock serve come la più alta concentrazione da testare, ed è il doppio della quantità di cellule che viene tipicamente utilizzato in esperimenti di separazione cellulare (600.000 cellule per pozzetto) Lo stock 800.000 cellule serve come controllo per l'esperimento come è tipico concentrazione cellulare che viene utilizzato in esperimenti di separazione cellulare (3.000.000 cellule per pozzetto). Lo stock di 80.000 cellule serve come una diluizione di dieci volte per verificare le concentrazioni più basse per la cattura cellulare (30.000 cellule per pozzetto). Lo stock 8.000 cellule serve come una diluizione cento volte da utilizzare come un test per verificare il limite inferiore della separazione cellulare (3.000 cellule per pozzetto).
7. Risciacquare con HBSS tre volte. Risciacquare superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l'angolo del pozzo. Tenere la pipetta in un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie. Raccogliere tutti i lavaggi.
8. Immagine le cellule su un microscopio a fluorescenza, se si utilizza 8 piastre e, scattare foto di ogni survolto, e applicare 150 microlitri biotina per ogni superficie per un'ora a 4 ° C su shaker. Dopo un'ora, risciacquare pozzetti rilascio biotina con HBSS 3 volte come prima. Raccogliere tutti i lavaggi da pozzi per il conteggio con l'emocitometro e l'immagine dei pozzi di rilascio.
9. Applicare 150 ml di 20 mM soluzione biotina in eccesso nei relativi pozzetti di rilascio di biotina per 1 ora, se si utilizza 24 tavole bene, e poi sciacquare quei pozzetti 3 volte con HBSS. Quantificare 24 pozzetti utilizzando un lettore di piastre. Utilizzare un emocitometro per contare le cellule da tutti i lavaggi e raccolti.

Analisi 7. Immagine

Nota: Si raccomanda Il pacchetto software FIJI (http://fiji.sc/Fiji) per l'analisi delle immagini. Inizialmente, le immagini sono state convertite in scala di grigi in, e quindi la luminosità / contrasto è stato modificato per portare fuori le cellule.

1. Caricare l'immagine, e convertire in scala di grigi facendo clic sulla scheda immagine poi scorrendo verso il basso per "Tipo" e quindi facendo clic4; 8 bit ".
2. Aumentare il contrasto dell'immagine facendo clic sulla scheda immagine e poi scorrendo a "Regola". Clicca su "Luminosità e Contrasto", e quindi utilizzare le barre di scorrimento per rendere le cellule spiccano. Se si utilizza immagini di fluorescenza, invertire le immagini per rendere le cellule più definiti.
3. Caricare un plugin su ImageJ chiamato ITCN (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) per analizzare le immagini.
4. Aprire ITCN. Quando viene visualizzata una finestra di dialogo che richiede all'utente con diversi parametri per valutare la dimensione della cella, impostare la larghezza minima della cella di interesse prima. Selezionare l'opzione "Rileva scuri Peaks" se l'immagine è a fluorescenza e le cellule sono oscurati.
5. Impostare il valore soglia a 2 inizialmente, e poi premere il pulsante "Count". Una nuova versione contato dell'immagine apparirà con puntini rossi che delineano in cui le cellule sono state contate.
6. Regolare il parametro di soglia e la larghezza per ottenere dati cellulare più precise defining le dimensioni di una "cella". Nota: Il numero di cellule contate sarà in una finestra di dialogo sulla destra. Modifica dei parametri daranno diverso numero di cellule contate.
7. Continuare a scorrere attraverso i parametri di soglia e larghezza fino a raggiungere una buona stima del numero di cellule.

Risultati

Usando questo protocollo mostriamo cattura cellule (Figura 3A) e il rilascio di cellule (Figura 3C) di cellule MCF7GFP nonché controlli cellule vive (Figura 4). Abbiamo quantificato la cattura cella come 60% ​​e 80% sono stati rilasciati (Figura 3C). Quando abbiamo esteso questo approccio ad una miscela di RAW 264.7 macrofagi e cellule MCF7GFP, il 50% dei macrofagi RAW sono stati catturati (Fig. 3D)...

Discussione

Miglioramenti nelle tecniche di isolamento delle cellule promuove studi scientifici nelle relazioni struttura-funzione in neuroscienze ^18, staminali programmazione delle cellule in biologia rigenerativa, e la segnalazione angiogenico in biologia vascolare ^19. Infatti, colture primarie ²⁰ (ad esempio, HUVEC) in biologia vascolare avviene principalmente attraverso l'uso di tecniche di isolamento cellulare. Isolamento delle cellule è stata recentemente utilizzata anche per il ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)	Acros Organics	919-30-2	Used to make 2% APTES solution
Plasma Cleaner Pico	Diener	Model 1	Cleans surfaces and allows for bonding of PDMS to glass
d-Desthiobiotin (DSB)	Sigma	D20655	Used as the releasing mechanism in the cellular capture surface.
dimethyl sulfoxide (DMSO)	British Drug Houses (BDH)	BDH1115-1LP	Dissolves the DSB into solution
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)	Thermo-Scientific	5g: 22980 25g: 22981	Activates carboxylic acids and allows binding of proteins to glass surface.
uncoated 8-well culture slide	BD Falcon	Case of 24: 354118 Case of 96: 354108	Used in cellular experiments involving Zeiss fluorescence microscope such as initial capture and release quantification experiments
Glass bottom 24-well plates	MatTek	P24G-0-13-F	Used in cellular experiments involving the plate reader such as antibody and cellular titration experiments
Mercaptoethanol	Science Lab	60-24-2	Used to quench reaction between EDC and DSB
4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES Hydrate 99%)	Fisher Scientific	AC172590250	Used to make 0.1 M MES Buffer for use in EDC reaction
Precision Oven	Thermo Scientific	11-475-153	Used in curing of PDMS and APTES layer.
Titramax 1000 Shaker	Heidolph	13-889-420	Used to ensure even distribution of APTES on surfaces.
1x Streptavidin 5 mg [e7105-5mg]	Proteo Chem	9013-20-1	Biotin-binding protein. May cause irritation.
5 cm Glass Dish	Fisher Scientific	08748A	Used in HUVEC studies as well as future profiling studies.
14 cm Petri Dish with Cover	Sigma-Aldrich	Z717231	Used to hold samples being functionalized and transport them.
MCF7-GFP cells	Cell Biolabs	AKR211	Stored in liquid nitrogen
RAW264.7 mouse macrophages	ATCC	TIB-71	Gifted to us from Smith lab at the University of Illinois. Stored in liquid nitrogen.
TrypLE	Life Technologies	12605036	Stored in 100 ml at room temperature
Dulbecco’s modified Eagle medium	Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC	50003PC	Supplier: Corning
Nonessential amino acids	Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC	25-025-CI	Already added into DMEM by facility. Supplier: Corning.
Cell scraper	Fisher Scientific	12-565-58	Small 23 cm 50 pack
Cell Dissociation Solution	Corning	MT-25-056CI	Used to lift cells non-enzymatically for the use in cell experiments
Hemacytometer	Hausser	02-671-54	Used to count cells for quantification of cell solutions and capture and release effectivity.
Biotin	Amresco	58-85-5	Used to release cells from surface.
HBSS	Created from Recipe	N/A	Used to keep cells alive in suspension as well as wash surfaces of non-specific binding. Adapted from Cold Spring Harbor Protocols: In 500 ml, use 4 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.0402 g Na2PO4•7H2O, 0.03 g KH2PO4 and 0.5 g glucose. Add DI water to get to 500 ml, filter, and then refrigerate.
HLA-ABC Antibody	BioLegend	311402	Antibody used to capture MCF7gfp cells
hIgG Antibody	BioLegend	HP6017	Antibody used to capture MCF7gfp cells
MCF7 GFP cells	Cell Biolabs	AKR-211	Luminal Breast Cancer line that has been transfected with green fluorescent protein.
Assorted Conicals	Thermo-Scientific	15mL: 12-565-268	50/15 ml plastic conicals for storing solutions and aliquots.
Mini-Tube Rotators (End over End Mixer)	Fisher Scientific	05-450-127	Used to incubate antibody and mix other cellular solutions in order to mix
Axiovert 200M (Fluorescence Microscope)	Zeiss	N/A	Zeiss Axiovert 200 M inverted florescence microscope.
Zeba Desalting columns	Thermo-Scientific	PI-87770	Used to purify newly biotinylated antibodies after the use of the Biotinylation Kit. Instructions provided at: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf
EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation Kit	Thermo- Scientific		Used to biotinylate antibodies to allow them to integrate with the capture surface
Plate Reader	BioTek	Synergy HTX Multimode Reader	Used to quantitatively measure fluorescent intensity in the titration experiments.