Utilizzando risposta al tocco evocata e di locomozione saggi per valutare le prestazioni e sulla funzione muscolare in Zebrafish

Riepilogo

Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.

Abstract

lo sviluppo muscolare zebrafish è altamente conservata con i sistemi di mammiferi che li rende un ottimo modello per studiare la funzione muscolare e le malattie. Molti miopatie che influenzano la funzione del muscolo scheletrico possono essere rapidamente e facilmente valutati in zebrafish nel corso dei primi giorni di embriogenesi. Con 24 ore di post-fecondazione (HPF), di tipo selvatico zebrafish spontaneamente contrarre i muscoli della coda e del 48 HPF, comportamenti di nuoto mostrano controllato zebrafish. Riduzione della frequenza di o altre alterazioni, questi movimenti possono indicare una disfunzione muscolo scheletrico. Per analizzare il comportamento di nuoto e valutare l'andamento del muscolo nei primi mesi di sviluppo zebrafish, utilizziamo entrambi i test di risposta e di locomozione di fuga al tocco evocato.

saggi di risposta di fuga touch-evocati possono essere utilizzati per valutare le prestazioni dei muscoli durante i movimenti breve scoppio risultante dalla contrazione delle fibre muscolari a contrazione rapida. In risposta ad uno stimolo esterno, che in questo caso è un rubinettola testa, di tipo selvatico zebrafish a 2 giorni dopo la fecondazione (DPF) di solito presentano una potente nuotata raffica, accompagnato da curve strette. Il nostro metodo quantifica funzione del muscolo scheletrico misurando l'accelerazione massima durante un movimento raffica nuoto, l'accelerazione essendo direttamente proporzionale alla forza prodotta dalla contrazione muscolare.

Al contrario, saggi di locomozione durante precoce sviluppo larvale zebrafish sono utilizzati per valutare le prestazioni dei muscoli durante lunghi periodi di attività muscolare. Utilizzando un sistema di monitoraggio per monitorare il comportamento nuoto, otteniamo un calcolo automatico della frequenza di attività e distanza in 6 giorni old zebrafish, riflettente della loro funzione muscolare scheletrico. Le misurazioni delle prestazioni nuoto sono preziose per la valutazione fenotipica dei modelli di malattia e di high-throughput screening di mutazioni o trattamenti chimici che interessano la funzione del muscolo scheletrico.

Introduzione

Negli ultimi dieci anni zebrafish sono stati utilizzati sempre più per studiare la biologia delle cellule muscolari e le malattie. Lo sviluppo esterna rapida dell'embrione zebrafish, insieme con la sua chiarezza ottica, permette la visualizzazione diretta della formazione muscolare, la crescita, e la funzione. Il processo di sviluppo muscolare è altamente conservata in zebrafish e questo ha permesso la modellazione di successo di una serie di malattie muscolari tra cui distrofie muscolari e miopatie congenite ^1-8. Analisi dettagliata dei modelli zebrafish non solo ha fornito nuove intuizioni nella patobiologia di queste condizioni, ma anche fornito una piattaforma per la sperimentazione di terapie adeguate ^6,9-13.

L'analisi dei modelli zebrafish di malattie muscolari si basa su analisi affidabili e riproducibili per misurare le prestazioni muscolari. Studi precedenti hanno misurato con successo la capacità forza generatrice del muscolo tronco zebrafish nel pesce tra 3 e 7 DPF bystimolando elettricamente contrazione di un pesce immobilizzato collegato a un sistema di forze trasduzione ^14. Questo può fornire misurazioni dettagliate di forza, ma non sono l'ideale per esperimenti di throughput più elevati e ci sono vantaggi per la misurazione delle prestazioni muscolari durante il nuoto. Al 2 dpf zebrafish muscolare è completamente funzionale e il pesce può suscitare movimenti scoppio di nuoto in risposta agli stimoli. Il test di risposta di fuga touch-evocare viene utilizzato per misurare l'accelerazione durante un movimento raffica nuoto, che può essere usato come una misura della forza contrattile.

Una delle misure più utilizzate della funzione muscolare nei pazienti miopatia è il test del cammino di 6 minuti, che registra la distanza totale camminato su una superficie piatta e dura ^15,16. Abbiamo applicato un test simile per misurare la funzione muscolare in 6 dpf larve di pesce zebra, per cui monitoriamo la distanza totale nuotato, e il numero totale di movimenti effettuati da ciascun larva in un periodo di 10 min. Questa operazione viene eseguitautilizzando un sistema automatizzato di monitoraggio, che fornisce misurazioni affidabili e ad elevato throughput di prestazioni muscolari. Entrambi i test muscolari sono altamente riproducibili e sono stati utilizzati per quantificare le differenze di prestazioni muscolari nei modelli miopatia zebrafish ^8.

Protocollo

1. Assay risposta al tocco evocata

1. Preparazione di 2 DPF embrioni per Touch-evocato Assay Risposta
   1. Assicurarsi che l'ora del giorno in cui si svolge il test è coerente tra gli esperimenti perché l'attività può variare notevolmente durante il giorno ^17,18.
      NOTA: L'esperimento deve essere eseguita in cieco e l'ordine dei test randomizzati per ridurre al minimo gli artefatti sperimentali.
   2. Assegnare il pesce ceppi un numero, che è sconosciuto per l'individuo di effettuare l'esperimento. A seguito di questo, utilizzando liberamente disponibili strumenti online generano un elenco casuale che determina l'ordine delle prove.
   3. Almeno un'ora prima del test, gli embrioni dechorionate strappando un buco nel corion e delicatamente tirando il corion a parte con un paio di pinzette sottili. Rimuovere eventuali detriti dalla capsula di Petri prima di tornare in C incubatore 28 °.
2. L'esecuzione del test di risposta al tocco evocato
   1. sta di calorege a 28 ° C per almeno 15 minuti prima di iniziare il test.
      NOTA: Questa fase è controllata la temperatura e rimarrà a 28   ° C per la durata del test. Temperatura interesserà l'attività ed è quindi importante per mantenere una temperatura costante. Se una fase riscaldata non è disponibile, la temperatura dell'acqua deve essere monitorata e tutti gli esperimenti dovrebbe essere effettuata alla stessa temperatura.
   2. Collocare un piatto Petri riempite con terreno di embrione (5 mM NaCl, KCl 0,17 mm, 0,33 mM CaCl _2, 0,33 mM MgSO ₄ in acqua) su una fase illuminata e montare la telecamera ad alta velocità sulla capsula di Petri.
   3. Avviare il software di video registrazione della videocamera (come flusso Pix 5, descritto qui) e nella scheda "spazio di lavoro" selezionare 1.000 frame al sec (1.000 fps), come la velocità di acquisizione per garantire che veloce nuoto del pesce viene registrato.
   4. Lavorare con un embrione alla volta, posizionare l'embrione nella MIDDle della capsula di Petri con la zebrafish chiaramente visibile nel campo visivo.
      NOTA: Se l'embrione nuota via prima dell'inizio dell'esperimento sostituirlo con un altro, come riconquistare e il posizionamento dell'embrione può provocare in esso diventando desensibilizzato agli stimoli e le risposte scoppio ripetuto può promuovere la debolezza muscolare in alcuni modelli di malattia.
   5. Iniziare la registrazione cliccando sul pulsante "record" e, di fornire lo stimolo meccanosensoriali all'embrione toccando delicatamente con un ago smussato sulla parte superiore della testa.
   6. Arrestare la registrazione dopo l'embrione ha nuotato fuori dal campo visivo o restituiti al resto.
      NOTA: I picchi di accelerazione entro il primo 0,2 sec della risposta fuga scoppiare seguenti stimolo meccanico. Pertanto, assicurare che almeno durante il primo 0,2 sec di registrare il pesce è nel campo di vista della risposta di fuga. Utilizzando il software descritto al punto 1.2.3, i dati saranno salvati automaticamentecome file video .avi. software di acquisizione video alternative come Free Video Capture o Softonic, entrambi i quali sono liberamente disponibili per il download, potrebbe anche essere utilizzato.
   7. Ritorna l'embrione di un nuovo piatto di Petri e selezionare un altro embrione per il test. Eseguire il test su un minimo di 15 pesci.
3. La quantificazione di Nuoto Comportamento
   1. Per quantificare il comportamento di nuoto, avviare il software e selezionare il "Single Larve Locomotion senza sfondo sottrazione" modulo per aprire il file video salvato .avi.
   2. Utilizzando la "mano libera" o strumento di "poligono" dalla barra dei menu selezionate aree del filmato da utilizzare per l'analisi. Assicurarsi che la regione comprende sia la posizione originaria del pesce e l'area che il pesce nuoterà in. Assicurarsi che la sonda è escluso dalla zona da analizzare. Il software traccia automaticamente la traiettoria del pesce nella zona desiderata.
   3. Per eseguire tegli analisi, cliccare su "esperimento" dalla barra dei menu e selezionare "eseguire". Quando richiesto salvare il file di analisi dei dati grezzi (.phr formato) nella posizione desiderata. Una volta salvati, cliccare su "Start" per iniziare l'analisi. Terminare l'analisi cliccando su "stop" sotto il "esperimento" menu a discesa. Verrà visualizzata una finestra contenente i risultati.
   4. Scorrere verso destra per ottenere il valore "accelerazione massima". Se lo si desidera, esportare questi dati chiudendo la finestra risultati e facendo clic sul pulsante "Esporta risultati istantanei" sotto i "risultati" menu a discesa. Selezionare il file raw appropriata analisi dei dati e fare clic su Apri. Un file di testo che può essere aperto in un foglio di calcolo verrà salvato nella cartella di destinazione.
   5. Ripetere questo processo per ogni singolo pesce e media per ottenere la massima accelerazione media per ogni ceppo (vedi Figura 1).
      NOTA: In alternativa Using il software descritto qui, pacchetti simili, come il software ImageJ liberamente disponibile può essere utilizzata per estrarre i dati di movimento pertinenti. Il plugin 3D Particle Tracker può essere utilizzato per tenere traccia traiettorie di nuoto.

2. Locomotion Assay - 10-minuti di nuotata di prova

1. Preparazione di 6 DPF embrioni per l'analisi nuoto
   1. Se necessario, ordinare embrioni per il genotipo desiderato, ad esempio esaminando espressione di una proteina fluorescente o fenotipo, e posto in una capsula di Petri separata (25-30 embrioni per piastra). In alternativa, il genotipo può essere determinato dopo il completamento del test locomozione.
   2. A 3 dpf, riesaminare piastre di Petri e rimuovere eventuali embrioni non schiuse e detriti. Rientro capsule di Petri a 28 ° C incubatore fino al 6 dpf.
   3. Eseguire il test di tutti i ceppi dalle 9 alle 12:00, che è il momento in cui le larve di zebrafish sono più attivi. Casuale l'ordine delle prove e posizione nella pin ritardo di tipo selvatico e mutante campioni per ridurre al minimo gli effetti delle differenze circadiani e altri pregiudizi sperimentale.
      NOTA: E 'importante che il tempo di prova è coerente tra esperimenti perché l'attività può variare notevolmente durante la giornata.
   4. Almeno 30 minuti prima del test, posto larve in una piastra a 48 pozzetti con una larva per pozzetto. Dopo il trasferimento, riempire i pozzetti in modo che la superficie dell'acqua è appena sotto la parte superiore del pozzo, garantendo l'assenza di bolle. Rientro piastre a 28 ° C incubatore.
   5. Prendere piastre fuori dell'incubatore e acclimatarsi alla luce per cinque minuti prima del test.
2. Esecuzione Locomotion Assay
   1. Posizionare la piastra a 48 pozzetti nella camera di registrazione, che è dotato di una fotocamera digitale infrarossi, catturare fino a 60 fotogrammi / sec, in modo che le larve può essere rilevata nel buio. Verificare che tutti i pozzetti sono posti all'interno della griglia circolare sul software locomozione e che tutte le larve sono clearly rilevabile.
   2. Avviare il software e selezionare il modulo "tracking". In "file" cliccare su "generare nuovo protocollo" e modificare il numero di pozzi utilizzati per l'esperimento. Impostare sia la durata dell'esperimento e il periodo di integrazione per 10 minuti facendo clic su "parametri" menu a discesa e selezionando i "parametri del protocollo" e successivamente la scheda "tempo". Nella stessa finestra di dialogo "parametri del protocollo" fare clic sulla scheda "Opzioni" e garantire la casella di controllo "Numeriscope" viene cliccato a seguito della quale, la finestra di dialogo "parametri del protocollo" può essere chiuso.
   3. Per impostare le aree di registrazione evidenziano l'intera griglia e fare doppio clic su uno dei pozzi. Fare clic sul pulsante "disegnare aree" e disegnare intorno in alto a sinistra, in alto a destra, e pozzi in basso a sinistra e fare clic su "Build", che permette al software di determinare automaticamente la posizione di ogni bene. disegnare anche in una scalabar e clicca su "applica al gruppo". Una volta completato, clicca sul pulsante "disegnare aree".
   4. Visivamente determinare la soglia di rilevazione facendo scorrere la barra "soglia di rilevamento" ad un livello in cui solo i movimenti di pesce sono evidenziate senza segnali di fondo.
      NOTA: La soglia di rilevamento varierà tra i ceppi, e quindi le soglie devono essere determinate ogni volta che un nuovo ceppo è testato. Nei dati rappresentativi presentati una soglia di rilevamento di 25 mm / sec è stato utilizzato.
   5. Prima di iniziare il test entrare soglie di movimento per il rilevamento di inattività, e piccoli e grandi movimenti.
      NOTA: Nei dati rappresentativi presentati una soglia di inattività di 6 mm / sec e un'attività scoppio soglia di 30 mm / sec è stato utilizzato. Le soglie determinano il movimento minimo da considerato attivo e il livello richiesto per essere considerato attività di scoppio e permettono una classificazione di attività in piccoli (attiva ma al di sotto Activi scoppiosoglie ty) e grandi (superiore alla soglia di attività scoppio movimenti). Le soglie possono essere modificati a seconda dell'attività delle particolari ceppi di pesce analizzati.
      NOTA: Anche se il test può essere effettuato sia in condizioni di luce o buio, larve di pesce zebra hanno dimostrato di essere più attivi nel buio ^18.
   6. Impostare l'intensità della luce all'interno della camera di essere a 0% facendo clic sul pulsante "Impostazioni di guida di luce" sotto i "parametri" menu a discesa. Nella finestra di dialogo risultante, aggiungere le impostazioni di luce necessarie.
      NOTA: L'intensità della luce all'interno della camera può essere attivato per accendere e spegnere durante il periodo di prova per stimolare l'attività larvale
   7. Chiudere la porta della camera di registrazione e avviare la registrazione video.
3. La quantificazione di Nuoto Comportamento
   1. Dopo l'esperimento, fare clic su "stop" sotto il "esperimento" menu a discesa. A bo dialogoVerrà visualizzato x con tutti i risultati.
   2. Per accedere a questi risultati in Excel fare clic su "Apri cartella contenente" e aprire il file di Excel che compare nella cartella risultante. I parametri importanti sono "smlct" (piccolo numero di movimenti), "larct" (grande numero di movimenti), "smldist" (distanza totale coperta dai pesci in piccoli movimenti) e "lardist" (distanza totale coperta dai pesci in grandi movimenti ).
      NOTA: Dopo la registrazione, il software restituisce anche due file di output aggiuntivi nella forma di un file AVI (contenente un video della registrazione 10 min) e un file di immagine .png (contenente una rappresentazione visiva della locomozione durante la 10- min esperimento; vedi figura 2).
   3. Una volta che i valori sono calcolati locomozione, riprodurre i file .avi e .png di rivedere se i valori di locomozione calcolati accuratamente raffigurano i movimenti di nuoto del pesce (si veda la Figura3).
      NOTA: In alternativa usando il software qui descritto, pacchetti come il software ImageJ liberamente disponibili possono essere utilizzati per tenere traccia del comportamento motorio.

Risultati

Tocco evocata test di risposta può essere utilizzato per determinare la velocità e l'accelerazione dei movimenti di nuoto che è una misura proporzionale della forza muscolare. In risposta ad uno stimolo meccanico, come un piccolo colpetto sulla testa 2 dpf tipo presentano zebrafish selvaggio un nuoto veloce. Video sono stati catturati e analizzati per due diversi modelli di zebrafish miopatia: Tg (ACTA1 ^D286G -eGFP), un modello di miopatia nemalinica che ha dimostrato di avere un notevole debolezza muscolare, e un modello di distrofia muscolare di Duchenne, in cui sono stati descritti difetti muscolari gravi a 5 dpf ^19,20. Immagini da un video di un tocco tipico evocati test sono rappresentati in figura 1A. Accelerazione del pesce zebra è stato esaminato e giudicato picco nella prima 0,2 sec della risposta raffica di nuoto di fuga (Figura 1B). Questa accelerazione massima di picco fornisce una misura proporzionale alla forza gcapacità del muscolo scheletrico enerating. I valori massimi di accelerazione sono stati mediati per ottenere un valore medio accelerazione massima (± errore standard della media) per ogni ceppo: Tg (ACTA1 ^D286G -eGFP): media = 276,0 ± 28,8 m / sec ^2, n = 3 esperimenti replicati indipendenti che comprende 15 esemplari; Controllo di tipo selvatico: media = 500,8 ± 50.28 m / sec ^2, n = 3 esperimenti replicati indipendenti composto da 15 esemplari; DMD ^{PC2 - / -} mutante: media = 249.9 ± 19.1 m / sec ^2, n = 3 esperimenti replicati indipendenti composti da 12-19 esemplari; DMD ^{PC2 +/-} eterozigote: media = 235,9 ± 8,7 m / sec ^2, n = 3 esperimenti replicati indipendenti composto da 16-27 singolo pesce; DMD omozigoti ^{PC2 + / +} di tipo selvatico: media = 230,9 ± 8,7 m / sec ^2, n = 3 esperimenti replicati indipendenti composto da 8-27 singoli pesci (Figura 1C). Come previsto, il Tg ^(D286 ACTA1G -eGFP) pesci sono stati trovati ad avere una diminuzione significativa accelerazione massima indicando ridotta funzione muscolare, che è coerente con modelli di topo e dati dei pazienti ^8,21,22. La DMD ^{PC2 - / -} pesce mutante però, non ha mostrato alcuna differenza nella massima accelerazione, a 2 DPF, in linea con la rilevazione dei difetti muscolari da 3 dpf ²⁰ (Figura 1D).

saggi locomozione sono stati eseguiti a 6 dpf per determinare l'attività e la distanza swum da ceppi zebrafish come un'indicazione del rendimento muscolare. Dopo il test, una rappresentazione schematica dei movimenti nuoto nel periodo di prova di dieci minuti è stata generata, con linee rosse e verdi che rappresentano rispettivamente i periodi di movimento lento e veloce e linee nere rappresentano i periodi di inattività (Figura 2). Individuale di tipo selvatico spettacolo zebrafish alta attività relativamente senza periodi di inattività come opposed al Tg (ACTA1 ^D286G -eGFP) i pesci, che sono meno attivi durante il periodo di prova (Figura 2B).

Il comportamento di nuoto è stata quantificata la media dei valori individuali del numero di movimenti e swum distanza per ogni pesce (Figura 3). Entrambi, Tg (ACTA1 ^D286G -eGFP) pesce (Figura 3A e 3B) e DMD ^{PC2 - / -} pesce mutante (Figura 3C e 3D) sono stati trovati ad avere una significativa diminuzione del numero medio di movimenti e la distanza nuotato rispetto al loro rispettivo controlli: Tg (ACTA1 ^D286G -eGFP) pesce: numero medio di movimenti = 94,3 ± 13,6, distanza media nuotato = 112,9 ± 18,4 millimetri, n = 3 esperimenti replicati indipendenti composto da 45 pesci; controlli di tipo selvatico: numero di movimenti = 177.4 ± 14.0 significano, distanza media nuotato = 300.2 ± 22,8 millimetri, n = 3 r indipendentiesperimenti eplicate comprende 45 pesci; DMD ^{PC2 - / -} mutanti: numero di movimenti = 163.3 ± 30.0 dire, distanza media nuotato: 298,4 ± 60,37 millimetri, n = 3 esperimenti replicati indipendenti composti da 12-20 pesce; DMD ^{PC2 +/-} eterozigote: numero medio di movimenti = 362,3 ± 38,8, distanza media nuotato: 660,3 ± 86,1 millimetri n = 3 esperimenti replicati indipendenti composti da 17-27 pesce; DMD omozigoti ^{PC2 + / +} di tipo selvatico: numero medio di movimenti = 341,9 ± 91,6, distanza media nuotato = 574,3 ± 170,9 millimetri n = 3 esperimenti replicati indipendenti composti da 8-25 pesce.

Figura 1:. Quantificazione di touch-evocano test di risposta per 2 dpf zebrafish embrioni immagini (A) un'istantanea di un pesce zebra controllo durante touch-evocare test a 2 dpf. (B) del profilo di accelerazione per la prima 0.2 sec di unsingolo Tg (ACTA1 ^D286G -eGFP) (rosso) e singolo controllo (blu) zebrafish a seguito dell'applicazione del touch stimolo. L'accelerazione massima è rappresentato dalle linee tratteggiate. (C, D) Quantificazione della accelerazione massima (m / sec ²⁾ registrati da saggi di risposta al tocco evocato di (C) Tg (ACTA1 ^D286G -eGFP) zebrafish e (D) ^PC2 DMD ^{- / -} pesce mutante rispetto al controllo zebrafish a 2 dpf. Le barre di errore rappresentano ± SEM per 3 esperimenti replicati, * p <0.05. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2:. La rappresentanza dei test di locomozione per embrioni di zebrafish (A) zebrafish embrioni sono posti in piastre da 48 pozzetti e locomozione è registrato dall'alto con una fotocamera digitale infrarossi. (B) Schema di movimento pesce zebra durante il periodo di prova con linee rosse raffigurante movimenti veloci, linee verdi che rappresentano movimenti lenti e linee nere raffiguranti inattività (come determinato dalle soglie di rilevazione inseriti nel software). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3:. Quantificazione dei saggi di locomozione per 6 dpf zebrafish larve quantificazione del (A) numero di movimenti e (B) distanza percorsa dal Tg (ACTA1 ^D286G -eGFP) zebrafish rispetto ai controlli zebrafish a 6 dpf.La quantificazione della (C) numero di movimenti e (D) distanza percorsa dalla DMD ^{PC2 - / -} pesce mutante rispetto al controllo zebrafish a 6 dpf. Le barre di errore rappresentano ± SEM per 3 esperimenti replicati, * p <0.05, ** p <0.01. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Molti modelli animali diversi, tra cui topi, cani, zebrafish, mosche e vermi hanno contribuito alla nostra comprensione delle basi genetiche e molecolari di malattie muscolari, e assistito allo sviluppo di approcci terapeutici per combatterli. Il pesce zebra vanta diversi vantaggi per lo studio della malattia muscolare. Il zebrafish fornisce un sistema geneticamente manipolabile per valutare complesso patterning muscolare in un ambiente fisiologico, la quale non è possibile in sistemi di coltura in vitro. A differenza di altri modelli animali vertebrati, il gran numero di pesci prodotte, insieme con la sua chiarezza ottica, facilita la rapida, ad alta produttività in chimica vivo e screening genetico.

Qui si descrive lo sviluppo di saggi di movimento zebrafish per fornire un alto throughput e metodo automatizzato per valutare le prestazioni dei muscoli durante l'embriogenesi zebrafish. Per entrambi i test si deve riconoscere che i ritmi circadiani estimoli ambientali esterni influenzeranno in modo significativo il comportamento di nuoto zebrafish ^17,18. Test ripetuta dello stesso zebrafish anche portare ad assuefazione causando una diminuzione in risposta tattile stimolo ^23. Pertanto, al fine di ottenere risultati riproducibili tra esperimenti ogni embrione zebrafish dovrebbe essere testato solo una volta, il tempo delle condizioni di giorno e di illuminazione deve essere standardizzato, e la temperatura dell'acqua deve essere strettamente regolata.

Utilizzando il touch evocata analisi a 2 dpf possiamo misurare direttamente l'accelerazione massima di un'azione raffica nuoto, che è proporzionale alla forza muscolare. Tecniche precedenti in zebrafish hanno esaminato la forza muscolare legando entrambe le estremità degli embrioni destinati attrezzature sperimentali a seguito della quale la contrazione del muscolo viene stimolato utilizzando un campo elettrico e la capacità di generare forza del muscolo ¹⁴ viene misurata. Mentre questo metodo misura la forza capacità di generazione di tegli muscolare larvale, non misura la forza effettiva generata dal muscolo larvale durante il nuoto. Abbiamo quindi sviluppato un metodo per valutare indirettamente la forza generata durante il normale movimento natatorio larvale per fornire una valutazione generale della salute dei muscoli. Il sistema video ad alta velocità, in grado di registrare singoli movimenti zebrafish in un frame rate di 1.000 fotogrammi / sec può essere utilizzato per identificare piccole ma significative differenze nella funzionalità muscolare, che non sono direttamente distinguibile ad occhio. Sarà interessante vedere come precedentemente riportato cambiamenti nella stimolato elettricamente vigore generazione correlazione con i cambiamenti nelle prestazioni di nuoto.

Inoltre il tocco evocata saggi di risposta possono anche essere utilizzati per valutare la cinematica nuoto, quali la forma e la velocità dell'onda corpo durante il movimento natatorio ^24, per dare una misura quantitativa del comportamento locomotorio.

A causa del movimento spontaneo di zebraflarve ish dopo 3 dpf, non siamo stati in grado di eseguire le analisi al tocco evocare per misurare la funzione muscolare. Al contrario, abbiamo misurato prestazioni muscolari nel corso di un periodo più lungo per la determinazione della distanza nuotato da larve zebrafish a 6 dpf. Questo test, anche se una misura indiretta della funzione muscolare, può essere utilizzato per identificare i pesci visualizzazione rendimento muscolare alterata ⁸ o neurodegenerazione ^25,26. Questo test non solo fornisce una misura analoga al test del cammino 6 min, ma è adatto anche per automatizzata ad alta produttività in droga o mutagenesi schermi vivo.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
21 G x 1' Blunt Needle	Terumo/Admiral Medical Supplies	TE2125
48-well plates	Sigma	M8937
90 mm Petri Dishes	Pacific Laboratory Products PT	S90001
High Speed Camera	Baumer	HXC20
http://www.randomization.com	N/A		Steps 1.1.2, 2.1.3
Incubator	Thermoline Scientific	TEI-43L
Plastic Pipette	VWR	16001-188
StreamPix5	NorPix		Step 1.2.3
Temperature Control Unit	Viewpoint
Tweezers, style 8	ProSciTech	T04-821
Zebrabox System	Viewpoint
Zebralab	Viewpoint		Steps 1.3.1, 2.2.1