Indurre un blocco di replica siti specifici in<i&gt; E. coli</i&gt; Utilizzando un sistema fluorescente Repressor Operator

Riepilogo

We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

Abstract

Ostacoli presenti sul DNA, tra cui proteine ​​strettamente legate e varie lesioni, può seriamente inibire la progressione del meccanismo di replicazione della cellula. Lo stallo di un replisoma può portare alla sua dissociazione dal cromosoma, in parte o integralmente, portando al collasso della forcella di replica. Il recupero da questo collasso è una necessità per la cella di precisione completa la duplicazione dei cromosomi e successivamente dividere. meccanismi diversi Pertanto, quando si verifica il crollo, la cella si è evoluta che si svolgono per ripristinare la forcella del DNA e consentire la replica da completare con l'alta fedeltà. In precedenza, questi percorsi riparazione replicazione nei batteri sono stati studiati utilizzando danni UV, che ha lo svantaggio di non essere localizzato in un sito conosciuto. Questo manoscritto descrive un sistema che utilizza un sistema di fluorescenza Repressor Operator (FROS) per creare un blocco di proteine ​​site-specific che può indurre la fase di stallo e il crollo di replica FORKS in Escherichia coli. Protocolli dettaglio come lo stato della replica può essere visualizzato in singole cellule viventi utilizzando microscopia a fluorescenza e replicazione del DNA intermedi può essere analizzato da 2-dimensionale elettroforesi su gel di agarosio. Mutanti sensibili temperatura dei componenti replisoma (es DnaBts) possono essere incorporati nel sistema per indurre un crollo sincrona delle forche di replicazione. Inoltre, il ruolo delle proteine ​​ricombinazione e elicasi che sono coinvolti in questi processi possono essere studiate usando fori genetiche all'interno di questo sistema.

Introduzione

Durante la replicazione del DNA, la replisoma affronta gli ostacoli sul DNA che compromettono la sua progressione. Danno al DNA comprese lesioni e le lacune così come le strutture aberranti possono impedire la replisoma di procedere ^1. Recentemente, si è trovato che le proteine ​​legate al DNA sono la fonte più comune di impedimento alla replica progressione forcella ^2. La conoscenza degli eventi seguenti l'incontro del replisoma con un blocco nucleoproteina è stata precedentemente limitata dalla incapacità di indurre un tale blocco nel cromosoma di una cellula vivente in una posizione nota. In vitro analisi ha migliorato la nostra comprensione del comportamento cinetico di un replisoma attiva quando incontra un blocco nucleoproteina ^3, nonché i dettagli meccanicistici della replisoma sé ^4,5. Comprensione corrente della riparazione di replica viene generalmente effettuata con UV come agente dannoso e studiata utilizzando DNA plasmidico in vivo ^6-8 . Mentre le proteine ​​che possono essere coinvolti nella riparazione del DNA dopo incontra un blocco in vivo nucleoproteine ​​sono generalmente inteso da questi studi, se ci sono variazioni di eventi molecolari all'interno delle vie di riparazione a causa della causa distinta nel blocco di replica è ancora ancora essere determinati.

Qui, descriviamo un sistema che permette un blocco nucleoproteina da stabilire in una posizione specifica del cromosoma con un System Operator Repressor fluorescente (FROS). Utilizziamo un ceppo di E. coli che ha avuto una serie di 240 siti Teto incorporati nel cromosoma ^9. Ogni sito Teto all'interno della matrice ha un 10 bp sequenza casuale fiancheggiante di aumentare la stabilità della matrice impedendo ricombinazione RecA mediata all'interno della matrice. Questo array, e variazioni di esso, sono stati inizialmente utilizzati per comprendere E. coli dinamica dei cromosomi ^10,11, ma sono stati poi adattati alle Prevent in vivo la replicazione ^12. L'array è stato trovato per essere stabilmente mantenuto e per bloccare quasi il 100% delle forcelle di replica quando vincolato TetR ^10,12. L'uso della matrice simile Laco in vitro ha trovato sole 22 siti erano sufficienti a bloccare il 90% di replica, anche se questa matrice inferiore era meno efficace in vivo ^13. Per adattare la matrice per creare un blocco nucleoproteina, la proteina repressore deve essere altamente overproduced in condizioni ottimali in cui si lega poi alla matrice per creare un posto di blocco. La formazione del blocco, e il suo successivo rilascio, possono essere monitorate attraverso l'uso di microscopia a fluorescenza se viene utilizzata una variante fluorescently etichettato del repressore Tet. Lo stato della replica in ciascuna cella è indicato dal numero di focolai visto, in cui un unico punto focale significa solo una copia della matrice è presente all'interno della cellula e multiple foci sono indicativi di replicazione attiva. Questa ri attivaplicatura è abilitata quando il blocco nucleoproteina viene invertita mediante l'aggiunta di induttore gratuito che riduce l'affinità di legame del TetR per il sito dell'operatore sufficientemente per la replisoma procedere attraverso l'array. La proteina repressore è ancora in grado di legarsi al DNA con elevata affinità sufficiente che le società più copie della matrice possono essere visualizzati.

Maggiori dettagli intricati degli eventi presso il blocco nucleoproteina può essere scoperto usando neutro-neutro elettroforesi bidimensionale agarosio e ibridazione Southern ^14-16. Queste tecniche permettono l'analisi di strutture di DNA nella popolazione. Gli intermedi di replica che si formano durante l'evento, e potenzialmente rimangono non riparato, può essere visualizzato. Variando l'enzima di restrizione e la sonda utilizzata, gli intermedi possono essere visualizzati non solo nella regione di matrice, ma anche a monte della matrice quando la forca di replicazione regredisce ^17,18. Ilregressione verificatosi dopo la dissociazione replisoma; principali ed afflitte filamenti nascenti separano dai fasci modello e ricottura tra loro come i fili template contemporaneamente ri-ricottura conseguente DNA struttura a quattro vie (una giunzione Holliday).

Usando questo sistema è stato dimostrato che la forcella replica non è stabile quando rileva questo blocco ^18. Inoltre, derivati ​​termosensibili di componenti replisoma possono essere utilizzati per impedire ricaricare alla forcella di replicazione una volta che è collassata. Una volta che un blocco viene stabilita, il ceppo può essere spostato ad una temperatura non permissive per garantire una disattivazione sincrono del replisoma e prevenzione controllata di ricaricare. La disattivazione di temperatura indotta assicura tutte le forche all'interno della popolazione sono crollati in un dato tempo e permette la valutazione di ciò che accade quando il replisoma collassa, come il DNA viene elaborata, e ciò che è necessario per riavviare il processo di replicazione del DNA.

Un vantaggio del sistema descritto qui è che il blocco nucleoproteina è completamente reversibile; Pertanto, la capacità delle cellule di recuperare dal blocco nucleoproteina può essere seguita. L'aggiunta di anhydrotetracycline alle cellule sarà alleviare la stretta legame del repressore, permettendo una forchetta replica di procedere attraverso la cella e per ritrovare la vitalità. Il rilievo del blocco può essere visualizzata neutro neutro elettroforesi bidimensionale agarosio dopo 5 min, e mediante microscopia entro 10 min. Inoltre, l'analisi redditività può rivelare la capacità del ceppo per recuperare dal blocco replica e continuano a proliferare.

Alterando il background genetico dei ceppi utilizzati nella procedura sperimentale descritta qui, i percorsi di riparazione per questo tipo di blocco possono essere chiarite.

Protocollo

1. Il blocco della replica con FROS

1. Indurre la replica Blocco
   1. Diluire una coltura fresca durante la notte di E. coli ceppo portante una matrice TETO e pKM1 ¹⁸ a OD _600nm = 0.01 in un mezzo complesso diluita (0,1% triptone, 0,05% estratto di lievito, 0,1% NaCl, 0,17 M KH ₂ PO _4, 0,72 MK ₂ HPO ₄₎ con antibiotici come richiesto per la selezione.
      Nota: non aggiungere tetraciclina per la selezione in quanto non è compatibile con questo sistema. Rendere il volume della coltura equivalente a 10 ml per campione richiesto. Ad esempio, il volume di coltura per il disegno sperimentale in figura 1 è di 60 ml.
   2. Crescere a 30 ° C con agitazione fino a OD _{600 nm} = 0,05-0,1. Rimuovere un campione di 10 ml per servire come controllo uninduced e aggiungere 0,1% arabinosio alla cultura rimanente per indurre la produzione di TetR-YFP da pKM1. Continuare a crescere sia il non indotte e indottoculture. Dopo 1 ora, verificare la presenza di un unico punto focale all'interno di ogni cellula della cultura indotta utilizzando la microscopia a fluorescenza (vedere paragrafo 2).
   3. Se le cellule indotte sono confermati bloccato (oltre il 70% delle cellule hanno un unico fuoco), registrare _l'600nm OD e prendere un campione di 7,5 ml per l'analisi gel 2-D (vedi sezione 3). Prendere un campione equivalente dalla cultura di controllo non indotte.
2. Rilasciando la replica Blocco
   1. Per rilasciare il blocco di replica, aggiungere 100 ng ml ^-1 del anhydrotetracycline induttore gratuita (AT) per un campione di cellule bloccate 10 ml. Continua a crescere a 30 ° C per 10 min e prelevare campioni di densità cellulare (1 ml), analisi al microscopio (10 microlitri) e neutro-neutro gel di agarosio 2-dimensionali (7,5 ml).
3. Indurre Crollo del replisoma
   1. Se le celle contengono un allele sensibile alla temperatura, come ts dnaB o TS dnaC che richiede deactivazione, spostare il pallone contenente le cellule bloccate a 42 ° C. Prelevare campioni per analisi in momenti richiesti (ad esempio, 1 ora dopo l'incubazione). Dopo che le cellule sono incubate a 42 ° C per 1 ora, spostare le cellule a 30 ° C per 10 min (vedere Figura 1).
      Nota: Le cellule possono essere spostati a 30 ° C per l'analisi riavvio.

Figura 1:. Panoramica sulla procedura di blocco e di rilascio sperimentale FROS replica E. ceppi coli che trasportano l'array Teto sono coltivate a 30 ° C. Quando le cellule raggiungono un _600nm OD superiore a 0.05, produzione TetR-YFP è indotta con arabinosio (ara; 0,1%). Continua a crescere una sottopopolazione di cellule indotte ad agire come controlli a 30 ° C. Un campione di cellule indotte viene analizzata tramite microscopia a fluorescenza dopo 1 - 2 h (vedere 2.1). Se la replica èconfermato di essere bloccato, vengono prelevati campioni per l'analisi del gel 2-D indicata dalle provette (vedi 3.1) e test di vitalità (opzionale). Il blocco replica può essere rimosso con anhydrotetracycline (AT; 0,1 mg / ml) e le cellule analizzate 10 min più tardi. Se le cellule portano un allele sensibile alla temperatura (ad esempio dnaB ts), questo può essere inattivato spostando le cellule bloccate a 42 ° C per l'analisi del caso. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

2. microscopia a fluorescenza

1. Preparare un tampone agarosio pipettando 500 ml di agarosio fuso (1% in acqua) su un vetrino da microscopio; sovrapporre il vetrino immediatamente prima delle solidifica agarosio. Conservare la slitta (s) in tessuti bagnati a 4 ° C fino al momento dell'uso.
2. Quando l'agarosio si è solidificato, rimuovere il vetrino dal pad agarosio e pipetta 10 ml di battericultura sul centro del pad per impedire il movimento delle cellule durante la visualizzazione. Una volta che il campione è essiccato (circa 5 minuti), sostituire il vetrino. Mettere una goccia di olio di immersione sul vetrino e porre il vetrino sotto l'ottica.
3. Visualizzare le cellule con la funzione Phase Microscopia a 100X ingrandimento.
   1. Nella finestra di dialogo Acquisisci all'interno del software di imaging, impostare il tempo di esposizione a 100 msec. Acquisire l'immagine selezionando Acquire. Non spostare il palco. Nella finestra di dialogo Acquisisci, selezionare YFP come l'illuminazione per l'otturatore esterno collegato alla fotocamera. Impostare il tempo exporsure a 1.000 msec. Spegnere la luce della fase. Acquisire l'immagine di fluorescenza selezionando Acquire.
      Nota: Il tempo può variare a seconda della fonte di luce, microscopio e fotocamera utilizzata.
   2. Per sovrapporre la fase e le immagini fluorescenti, selezionare Colore Combina dall'interno del menu Display. Nella colore Combina finestra di dialogo, selezionare l'immagine YFP come l'immagine di fase come il bl componente verde ecomponente ue. Fare clic sul colore combinare. Determinare se la popolazione ha avuto replica bloccato da stabilire se la maggior parte delle cellule hanno un fuoco per cella.
      Nota: confronto ad un campione dal controllo senza arabinosio aggiunto è utile per identificare visivamente la differenza nella produzione EYFP.

3. Spine DNA Estrazione / Agarose

1. Aggiungere azide di sodio (concentrazione finale dello 0,1%) per i campioni di 7,5 ml di coltura da passi 1.1.3 e 1.2.1. Incubare in ghiaccio per almeno 5 minuti.
   Nota: sodio azide è estremamente tossico. Consultare la scheda di sicurezza prima di iniziare il lavoro e non maneggiare fino a quando tutte le misure di sicurezza sono state lette e comprese.
2. Centrifugare le cellule 5.000 xg per 10 minuti per far sedimentare le cellule. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 200 ml di Pett IV (PIV) tampone (10 mM Tris: HCl (pH 8.0), 1 M NaCl). Microcentrifuga (13, 000 xg per 2 minuti) per far sedimentare le cellule. discard il surnatante. In questa fase, il processo di pellet ulteriormente o conservare a -20 ° C.
3. Risospendere le cellule con la più bassa densità cellulare in 50 microlitri PIV e posto a 50 ° C. Per tutti gli altri campioni, regolare il volume di PIV così la densità cellulare finale è la stessa in ogni tubo (es Campione 1 (OD _600nm = 0,128) risospeso in 50 microlitri; Campione 2 (OD _600nm = 0,138) risospeso in 54 microlitri).
   1. Aggiungere un volume uguale di soluzione preparata di agarosio allo 0,8% in PIV (conc finale 0,4%;. Es Esempio 1 50 microlitri, Esempio 2 54 microlitri). Assicurarsi che i campioni, agarosio e PIV sono superiori a 50 ° C per evitare la solidificazione.
4. Trattare un vetrino da microscopio con 40 ml di una soluzione di vetro idrorepellente o silicone appropriata. Strofinare il vetrino con un fazzoletto di carta fino a quando è asciutto.
   Nota: Questo può essere fatto in anticipo e le diapositive trattati conservato a lungo termine a temperatura ambiente.
5. Mettere 20 gocce microlitri di tegli sospensione cellulare / agarosio sul vetrino per la produzione di tappi che sono emisferica.
   Nota: Il primo campione (risospeso in 50 ul PIV) produrrà 5 spine su una diapositiva.
6. Quando le spine hanno solidificato, farle scivolare dolcemente in una provetta per microcentrifuga e aggiungere 1 ml di tampone di lisi cellulare (10 mM Tris-HCl [pH 8], 1 M di NaCl, 100 acido mM etilendiamminotetraacetico (EDTA), lo 0,2% di sodio desossicolato, 0,5% sale di N-Lauroylsarcosine sodio (Sarkosyl), 100 mcg ml ^{- 1} lisozima, 50 mcg ml ^{- 1} RNasi A). Incubare a 37 ° C per 2 ore.
7. Rimuovere il tampone di lisi cellulare e aggiungere la soluzione 1 ml di EDTA / sarcosyl / proteinasi K (ESP) (0,5 M EDTA, 1% sale di sodio N-Lauroylsarcosine (Sarkosyl), 1 mg ml ^{- 1} proteinasi K). Incubare a 50 ° C durante la notte o fino a quando le spine sono trasparenti. Se è necessaria una seconda notte di incubazione, sostituire la soluzione ESP con tampone fresco dopo circa 18 ore.
8. Rimuovi ilESP tampone e lavare i tappi 5 volte con 12 ml di Tris-EDTA (TE) tampone (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0), consentendo un 30 min in equilibrio con ogni lavaggio. Conservare a 4 ° C in 1 ml di tampone TE.

4. neutro-neutro 2-Dimensional elettroforesi su gel

1. Trasferire una spina agarosio dal punto 3.8 a una provetta per microcentrifuga fresco e aggiungere 150 ml di tampone enzima di restrizione (1x concentrazione). Aggiungere 25-100 unità di enzima di restrizione (ad esempio, 60 unità di EcoRV; (vedi Figura 3A)). Digest a 37 ° C per 6-8 ore.
2. Al 4 ° C, versare un gel di agarosio 0,4% (300 ml) in 1x Tris / borato / EDTA (TBE) in un vassoio di gel di circa 25 x 25 cm. Inserire un pettine per rendere pozzetti circa la stessa larghezza del diametro della spina. Quando il gel è impostato, rimuovere il pettine e spostare il gel a temperatura ambiente.
3. Infilare una delle spine agarosio digeriti in un pozzo, posizionando la slitta piatta della spina contro il lato del pozzo dove tegli DNA entrerà nel gel. Inserire una sola spina nello stesso modo in ogni secondo pozzo.
4. Pipettare fuso 0,4% agarosio nei pozzetti per sigillare i tappi in posizione.
5. Carico 1 kb scala del DNA in un pozzo vuoto, lasciando ancora un divario tra la scala e campioni, ed eseguire il gel durante la notte (16 ore, 55 V) a 1x TBE a temperatura ambiente.
6. Macchia il gel in un bagno di acqua contenente etidio bromuro (0,3 mg ml ^-1) per 20 min.
   Nota: il bromuro di etidio è considerato un agente mutageno potente ed una tossina. Consultare la scheda di sicurezza prima di iniziare il lavoro e non maneggiare fino a quando tutte le misure di sicurezza sono state lette e comprese.
7. Visualizzare il DNA con un transilluminatore UV a onde lunghe e tagliare ogni frammento corsie con una retta, anche tagliare, minimizzando l'inclusione di eccesso di agarosio su entrambi i lati della corsia.
   Nota: Ad esempio, se il frammento di interesse è di 5,5 kb, tagliare un frammento di 7,5 centimetri per includere i frammenti di DNA da 5 kb al approximatEly 12 kb (vedi Figura 3A).
8. Posizionare la corsia di gel asportato in un vassoio di gel a 90 ° direzione di migrazione del DNA.
   Nota: Due file di 3 frammenti di gel può andare bene in un vassoio di gel 25 x 25 ² cm. La prima fila di corsie del gel è nella parte superiore del vassoio, la seconda fila a 12.5 cm.
9. Preparare 300 ml di agarosio per la seconda gel di dimensione (0,9% nel 1 x TBE con 0,3 mg ml ^-1 bromuro di etidio). Quando l'agarosio si raffredda a 50 ° C, pipetta la agarosio fuso attorno alle fette di gel a solidificare la loro posizione. Versare il agarosio rimanenti nel vassoio per una profondità che è almeno di livello con le fette di gel.
10. Una volta che il gel è solidificato, elettroforesi a 4 ° C in TBE 1x contenente 0,3 mg ml ^-1 bromuro di etidio a 220 V fino a quando il DNA è migrata circa 10 cm.
    Nota: 4 ore è sufficiente per un frammento di 5,5 kb che un frammento più piccolo avrà bisogno di meno tempo.
11. Asportare i blocchi in cui il DNA genomico è presente ucantare bordo di un righello di metallo, compreso il gel sopra includere il DNA non visibile (Figura 3C).

5. Ibridazione del sud

1. soluzione Preparazione
   1. Preparare depurinazione tampone (0,125 soluzione M HCl).
      Nota: Questo buffer può essere riutilizzato ed è stabile a temperatura ambiente per 1 mese.
   2. Preparare denaturazione tampone (1,5 M di NaCl, 0,5 M NaOH).
      Nota: denaturazione buffer può essere riutilizzato una volta ed è stabile per un massimo di 3 mesi a temperatura ambiente.
   3. Preparare tampone di neutralizzazione (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris). Regolare a pH 7.5 con HCl.
      Nota: tampone di neutralizzazione può essere riutilizzato una volta ed è stabile per 3 mesi a temperatura ambiente.
   4. Preparare 10x Saline citrato di sodio (SSC) tampone (0,15 M citrato trisodico, 1,5 M di NaCl, pH è 7 - 8) per l'uso in passi 5.2.4 e 5.2.6. Da questo buffer, fare una SSC magazzino 2x (per l'uso in fase 5.2.9).
      Nota: 10x SSC e 2x SSC unri stabile a temperatura ambiente per 3 mesi.
   5. Preparare Chiesa e Gilbert Hybridization Buffer ¹⁹ Modified (0,5 M tampone fosfato [pH 7,2], 7% (w / v) di sodio dodecil solfato (SDS), 10 mM EDTA). Lasciare a 65 ° C per sciogliere completamente prima dell'uso.
2. Trasferimento
   1. Sciacquare i blocchi di gel asportati in soluzione depurinazione per 10 minuti a temperatura ambiente su una sedia a dondolo o agitatore orbitale. Mantenere la velocità di agitazione basso per evitare di danneggiare i blocchi agarosio.
   2. Risciacquare i blocchi gel brevemente con acqua distillata e quindi con tampone di denaturazione per 30 min. Risciacquare ancora brevemente in acqua distillata e quindi incubare i blocchi di gel in tampone di neutralizzazione per 30 minuti con agitazione a temperatura ambiente.
   3. Tagliare una membrana di nylon alla dimensione esatta del gel (s). Tagliare un nick in alto a destra per aiutare a orientare la membrana nei passaggi futuri.
      Nota: Due blocchi gel (6 campioni) può essere visualizzato su una membrana.
   4. Versare abbastanza 10x SSC in un TRay modo che non si secca durante la notte. Creare una piattaforma circa 5 cm sopra il livello del buffer. Saturare 3 fogli di carta per cromatografia 3MM con 10x SSC e posto sulla piattaforma. Tagliare la carta cromatografia in modo che sia abbastanza lungo per essere immerso in tampone a entrambe le estremità e largo abbastanza da contenere il gel membrana sulla.
   5. Porre il gel (s) sulla parte superiore della carta cromatografia satura. Inquadrare il gel con involucro di plastica per evitare il buffer by-passando il gel durante il trasferimento. Adagiare la membrana taglio sulla superficie del gel (s). Rimuovere le bolle d'aria tra la membrana e il gel rotolando una bottiglia o una pipetta sierologica dolcemente attraverso la membrana.
   6. Tagliare tre fogli di carta cromatografia 3MM alle stesse dimensioni della membrana. Saturare i fogli di carta per cromatografia con 10x SSC e posto sulla parte superiore della membrana. Rimuovere eventuali bolle d'aria che si sono formate.
   7. tovaglioli di carta Stack di almeno 5 cm sulla parte superiore della carta assorbente seguito da un supporto solido (approPeso ximate di 1 kg per una membrana 23 x 16 cm). Lasciare che il trasferimento di procedere durante la notte.
   8. Esporre la membrana (DNA lato alto) a 1,200 J / m ² di UV per reticolare il DNA alla membrana. Non sciacquare prima di questo passaggio.
   9. Sciacquare accuratamente la membrana in 2x SSC per evitare fondo elevato sulle immagini macchia. Utilizzare la macchia immediatamente per l'ibridazione (vedi 5.3) o asciugare a temperatura ambiente, avvolgerlo nella pellicola trasparente e conservare a 4 ° C.
3. ibridazione
   1. fornetto Preriscaldare e bottiglie a 55 ° C.
   2. Aggiungere 100 mcg ml ^-1 di albumina sierica bovina (BSA) e 10 mg ml ^-1 DNA non specifico (ad esempio, il salmone DNA spermatico) nel buffer di pre-riscaldato ibridazione.
   3. Per consentire anche per la copertura del tampone di ibridazione quando la membrana viene arrotolata, collocare il blot su un quadrato di dimensioni simili di rete di nylon con il lato DNA-bound della membrana rivolta verso l'alto. Arrotolare la macchia lungo il suo lato lungo. Diapositivala macchia / mesh all'interno di una bottiglia di ibridazione. Aggiungere una quantità appropriata di tampone di ibridazione preriscaldato a srotolare il blot (ad esempio 30 ml per un cm ² membrana 23 x 16).
   4. Incubare in un forno preriscaldato, ruotare le bottiglie, per 1 ora.
   5. Preparare la sonda mescolando 50 ng purificato omologo prodotto di PCR per la regione di interesse, 150 ng di primer esameriche casuali, tampone per frammento di Klenow e H ₂ O per fare un volume di 13 microlitri. Far bollire per 3 minuti poi posto immediatamente sul ghiaccio. Aggiungere 1 ml di 1 mm dCTP / dGTP / dTTP mix, 1 ml di frammento di Klenow (5U) e 50 pCi deossiadenosina radiomarcato 5'-trifosfato sul alfa fosfati (α ³² P-dATP).
   6. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Aggiungere 1 ml di 1 mM dNTP mix e 1 ml di Klenow frammento. Incubare 20 minuti a temperatura ambiente.
   7. Far bollire Sonda per 5 minuti e aggiungere immediatamente ai tubi di ibridazione. Ibridare overnight a 55 ° C, con rotazione.
   8. Decantare il prOBE dalla membrana.
      Nota: La sonda può essere riutilizzato una volta.
   9. Sciacquare la membrana brevemente nel pre-riscaldato, tampone di lavaggio a bassa severità (2x SSC, 0,1% (w / v) di SDS). Aggiungere fresca tampone di lavaggio a bassa severità e incubare per 5 minuti a 55 ° C con rotazione. Ripetere.
   10. Lavare due volte in tampone di lavaggio medio stringenza (1x SSC, 0,1% (w / v) di SDS) per 10 min a 55 ° C con rotazione.
   11. Lavare due volte in tampone di lavaggio stringenza elevata (0.1x SSC, 0.1% (w / v) di SDS) per 5 min a 55 ° C con rotazione.
   12. Rimuovere la membrana e tamponare con il tessuto per rimuovere il liquido in eccesso. Avvolgere nella pellicola garantire che vi sia alcun residuo di umidità sulla pellicola trasparente e posto in cassette di esposizione con uno schermo di memorizzazione fosforo pre-oscurata. Chiudere la cassetta ed esporre per almeno 2 ore prima della visualizzazione utilizzando un imager fosforo.

Risultati

Il FROS è un, blocco nucleoprotein site-specific inducibile che consente intermedi di replicazione da visualizzare nelle cellule viventi ^12,18. Un disegno sperimentale generale per il campionamento delle cellule è illustrato in Figura 1. I tempi di campionamento e variazioni in background genetico fanno un sistema versatile per studiare la riparazione di un tale blocco. Lo schema illustra come mutanti sensibili alla temperatura, come ad esempio ts dnaB

Discussione

During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded^20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most commo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptone	Sigma-Aldrich	16922	Growth media component
Sodium Chloride	VWR	27810.364	Growth media component
Yeast extract	Sigma-Aldrich	92144	Growth media component
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P9791	Growth media component; Potassium buffer component
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786	Growth media component; Potassium buffer component
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	For induction of TetR-YFP production
Anhydrotetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	37919	Release of replication bloackage
Axioskop 2 Fluorescence microscope	Zeiss	452310	Visualization of cells
eYFP filter set	Chroma Technology	41028	Visualization of YFP
CCD camera	Hamamatsu	Orca-AG	Visualization of cells
MetaMorph  Software (Molecular Devices)	SDR Scientific	31282	Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript
Agarose	Bioline	BIO-41025	For agarose plugs and gel electrophoresis
Original Glass Water Repellent (Rain-X)	Autobarn	DIO1470	For agarose plug manufacture
TRIS	VWR	VWRC103157P	TE, TBE buffer component
Ethylene diaminetetraacetic acid	Ajax Finechem	AJA180	0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH.
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Bacteriostatic agent
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148	TE buffer component
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	Cell lysis buffer component
N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl)	Sigma-Aldrich	L5125	Cell lysis and ESP buffer component
Rnase A	Sigma-Aldrich	R6513	Cell lysis buffer component
Lysozyme	Amresco	6300	Cell lysis buffer component
Proteinase K	Amresco	AM0706	ESP buffer component
Sub-Cell Model 192 Cell	BioRad	1704507	Electrophoresis system
UV transilluminator 2000	BioRad	1708110	Visualization of DNA
Ethidium Bromide	BioRad	1610433	Visualization of DNA
Boric acid	VWR	PROL20185.360	TBE component
Hybond-XL nylon memrbane	Amersham	RPN203S	Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used
3MM Whatman chromatography paper	GE Healthcare Life Sciences	3030690	Southern blotting
HL-2000 Hybrilinker	UVP	95-0031-01/02	Crosslinking of DNA and hybridization
Deoxyribonucleic acid from salmon sperm	Sigma-Aldrich	31149	Hybridization buffer component
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881	Denaturation buffer component
Trisodium citrate dihydrate	VWR	PROL27833.363	Transfer buffer
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Amresco	227	Wash buffer component
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906	Hybridization buffer component
Random Hexamer Primers	Bioline	BIO-38028
Klenow fragment	New England BioLabs	M0212L
dNTP Set	Bioline	BIO-39025
Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP	PerkinElmer	BLU502A
Storage Phosphor Screen	GE Healthcare Life Sciences	GEHE28-9564-76	BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35 cm x 43 cm screen
Typhoon FLA 7000	GE Healthcare Life Sciences	28-9558-09	Visualization of blot
Hybridization bottle	UVP	07-0194-02	35 mm x 300 mm