Crescita differita Inibizione test per quantificare l'effetto di antimicrobici batteri derivati ​​sulla concorrenza

Riepilogo

The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.

Abstract

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.

Introduzione

Bacteria living in communities compete at the interspecific and intraspecific level for space and nutrients ⁶. Competition between microbes can often lead to exclusion of particular species or strains within a community. Exclusion can be due to competition for a particular receptor or nutrient, or the production of an antimicrobial compound by a member of the community ⁶.

Studies investigating competitive exclusion frequently examine the presence and absence of species using 16S rRNA sequencing ^3,4,13. However, intraspecific trait variation, for example the presence or absence of antimicrobial peptide production, can hugely impact the ability of one species to inhibit another ¹. Since 16S rRNA sequencing cannot distinguish between strains of the same species, intraspecific trait variation cannot be assessed. The technique described here can be used to assess the potential of individual strains to exclude other bacteria. This method has previously been used to show a positive correlation between the presence of Staphylococcus aureus inhibitory bacteria and the absence of S. aureus in a nasal community ⁷.

The deferred growth inhibition (competition) assay can identify production of antimicrobial compounds or nutrient competition by the inhibitor strain. It can also detect positive interactions, whereby the presence of the inhibitor strain actually improves the growth of the competitor strain. This assay can be used to create quantitative data (zone of clearing size) and qualitative data (degree of inhibition), both of which can be overlaid onto data of the presence or absence of a species within a community to find correlations between phenotype (trait) and competitive exclusion ⁷.

Protocollo

Il seguente metodo è adattato ^7,8 per testare i ceppi concorrente con ceppi inibitori-produzione.

NOTA: Questo protocollo comporta la generazione di aerosol con colture batteriche. Questa operazione può essere eseguita solo in uno spazio contenuta con l'attuazione di considerazioni di sicurezza a livello locale-approvati. Spruzzare della cultura sulle piastre di agar in una cappa di sicurezza livello 2 sarà minimizzare la contaminazione delle piastre di agar e l'ambiente circostante. Questo sarà anche proteggere il ricercatore di aerosol per inalazione di batteri spruzzati, questa è una delle principali preoccupazioni se il ricercatore sta usando livello di contenimento 2 organismi. Dispositivi di protezione adeguati devono essere indossati. L'area che circonda la capsula di Petri è meglio coperto con carta assorbente usa e getta. Si consiglia Post-spruzzo decontaminazione usando la luce UV.

1. Preparare le piastre di agar

1. Preparare infuso cuore cervello (BHI) agar in accordo con la manuistruzioni del produtto-.
2. Autoclave l'agar BHI a 121 ° C, 15 psi per 20 minuti, o secondo le raccomandazioni del produttore dell'autoclave, per sterilizzare.
3. Versare 15 ml aliquote di agar BHI sterilizzato in piastre Petri sterili e permettono di impostare.
   NOTA: verificare ogni piastra di agar da utilizzare nel dosaggio proviene dallo stesso ceppo di agar e che vi è la stessa quantità di agar in ciascuna piastra. Questo limita la variabilità di nutrienti disponibili e diffusione inibitore tra le piastre che consentono la comparabilità.

2. Preparazione sterile Brodo

1. Preparare BHI brodo in accordo con le istruzioni del produttore.
2. Aggiungere 10 ml aliquote di BHI per 28 bottiglie universali ml di vetro.
3. Autoclave il brodo BHI a 121 ° C, 15 psi per 20 minuti, o secondo le raccomandazioni del produttore dell'autoclave, per sterilizzare.
   NOTA: Assicurarsi che tutti brodo usato nel saggio proviene dallo stesso lotto di brodo autoclaved allo stesso tempo di limitare la variazione di nutrienti che potrebbero causare variazioni nei risultati.

3. Preparazione bottiglia sterile vaporizzatore (s)

1. Smontare la bottiglia vapourizer.
2. Spruzzare il 5% della superficie detergente attiva attraverso la vapourizer per eliminare gli agenti inquinanti interni, immergere la bottiglia vapourizer, coperchio e vapourizer nella superficie detergente attivo 5% durante la notte.
   NOTA: Guanti e dispositivi di protezione adeguati devono essere utilizzati durante la manipolazione della superficie detergente attiva.
3. Asciugare il vaporizzatore, coperchio e bottiglie sotto cappa a flusso d'aria sterile.
4. Riempire la bottiglia con il 70% di etanolo, ricollegare vapourizer e spruzzare un po 'di etanolo attraverso il vapourizer.
5. Mettere il coperchio sul vaporizzatore e memorizzare con l'etanolo all'interno fino all'utilizzo.
6. Immediatamente prima dell'uso, in modo asettico risciacquare la bottiglia con brodo BHI sterile e spruzzare il brodo attraverso il vapourizer.
   NOTA: Questo impedisce l'aff etanoloette l'inoculo aggiunto alla bottiglia nella sezione 6.3.

4. Preparazione della cultura durante la notte batterica (s)

1. Streak il concorrente e inibitore ceppi su una piastra di agar BHI sterile e incubare a 37 ° C in condizioni aerobiche per circa 18 ore (durante la notte).
   NOTA: Questa piastra produce uno stock di batteri che possono essere utilizzati per più repliche all'interno della stessa settimana se conservati a 4 ° C.
2. Seminare 10 ml di brodo BHI sterile con una singola colonia del ceppo batterico concorrente richiesto entro una bottiglia universale 28 ml.
3. Incubare la bottiglia universale a 37 ° C durante la notte aerobicamente agitando a 250 rpm in un agitatore orbitale.

5. Spot Cultura dell'inibitore produttrici Isolate

1. Preparare la cultura durante la notte (s) come descritto nella sezione 4.
2. Assicurarsi piastre di agar sono completamente asciutti, senza formazione di condensa sul coperchio, prima di inoculazione (ad esempio incubando plate per 60 min a 37 ° C); questo impedisce l'inoculo di diffondersi su tutta la piastra dal sito inoculazione.
3. Pipettare 25 ml di coltura durante la notte sul centro delle piastre di agar. Evitare di deprimere completamente lo stantuffo della pipetta per evitare bolle d'aria che spruzzano la cultura attraverso l'agar.
4. Lasciare la cultura asciugare a temperatura ambiente per limitare la diffusione della cultura. Incubare le piastre di agar a 37 ° C in condizioni aerobiche durante la notte.

6. La preparazione dello spray inoculo del ceppo test del concorrente (s)

1. Preparare la cultura durante la notte come descritto nella sezione 4. Diluire la notte della cultura 10 volte in BHI brodo di cedere circa 4 x 10 ⁶ CFU ml ^-1, e una sospensione di OD ₆₀₀ 0,3 ± 0,05.
   NOTA: A 10 diluizione volte non darà 4 x 10 ⁶ CFU ml ^-1 per tutte le specie batteriche, calcolare il fattore di diluizione necessaria per la diffusione placcatura diluizioni seriali tra 1 x 10 ^{-1 -1 x 10 -6.}
2. Versare la cultura diluito in una bottiglia di profumo vaporizzatore di plastica sterile.
   NOTA: Il volume totale deve essere superiore a quella necessaria per il numero di piastre di agar da spruzzare. Circa 250 microlitri per piastra è adatto a 9 cm di diametro Petri.

7. differite inibizione della crescita Assay

1. Spruzzare la cultura attraverso ciascuna delle bottiglie vaporizzatore per garantire che la cultura è caricato nel meccanismo spruzzo prima di spruzzare sul agar.
2. Da una distanza di circa 15 cm sopra l'agar, spruzzare circa 250 ml di coltura diluito (3 spray di un tipico 50 ml vaporizzatore) su tutta la superficie agar. Incubare le piastre di agar a 37 ° C in condizioni aerobiche durante la notte. Ripetere per altre piastre con lo stesso numero di spray.

8. Interpretazione differite Risultati di inibizione della crescita Assay

1. Misurare la zona di inibizione della crescita della competitività spruzzatotor ceppo (Figura 1A - C, "X" a "X") in millimetri, sottraendo il diametro dello spot centrale del inibitore-produttore (Figura 1A - C, "Y" a "Y").
   NOTA: La figura 1E mostra come questi dati potrebbe essere presentato
2. Registrare il punteggio chiarezza per le zone di inibizione.
   NOTA: Questo indica il grado di inibizione osservato. Esempi sono mostrati in Figura 1A - D, i ceppi che possono essere utilizzati per la standardizzazione sono suggeriti nella sezione rappresentativa risultati. La seguente scala può essere utilizzato per chiarezza punteggio: un punteggio chiarezza di 0 per descrivere una zona di completa inibizione della crescita del ceppo concorrente. Un punteggio di 1 per descrivere una zona di quasi completa inibizione della crescita, con solo singole colonie presenti nella zona di compensazione. Un punteggio di 2 a descrivere una zona visibile di crescita ridotta, la crescita all'interno di questa zona è confluente, o vicino a confluenti ma ridotto a densità> 50%. Un punteggio di 3 a descrivere solo riduzione crescita minima, la crescita è confluenti e ridotto di meno del 50%, una zona è ancora visibile e misurabile. Un punteggio di 4 a descrivere alcuna inibizione della crescita visibile. Un punteggio di 5 per descrivere che la crescita del ceppo concorrente è stata aumentata in prossimità della prova ceppo inibitore produttrici. Vedere la Figura 1 per esempi. Questi punteggi sono soggettivi per lo sperimentatore.

9. replicati

1. Ripetere saggi almeno in triplicato biologico per determinare la riproducibilità dei risultati ottenuti.
   NOTA: se replicati vengono eseguiti in giorni diversi, prendere le misure e segnare piatti subito dopo la rimozione dalla incubazione, allora o piastre Conservare a 4 ° C o prendere fotografie di alta qualità piastre prima di eliminarli. Storage o fotografie delle piastre consente un facile confronto dei risultati tra i diversi giorni, tla sua è particolarmente importante per la conferma di punteggio riproducibili attraverso giorni / esperimenti. Essere consapevoli del fatto che lo stoccaggio delle piastre ha il potenziale per alterare i risultati.
   NOTA: per chiare fotografie luogo piastre in posizione verticale senza il loro coperchio su una sfondo nero opaco in una zona di luce diffusa, utilizzare una fotocamera ad alta risoluzione (≥8 MP) in grado di concentrarsi su oggetti vicini all'obiettivo (modalità macro). In alternativa, alcuni imager gel con trans-illuminatore fissati alla luce bianca in grado di produrre immagini di alta qualità altamente riproducibili.

Risultati

I risultati del test dovrebbero essere osservabile come una differenza nel ceppo sovrapposto concorrente nei pressi della centrale macchiato inibitore produttrici di deformazione (Figura 1). Queste differenze possono essere interpretate come completa inibizione (Figura 1A), inibizione parziale (figura 1B e 1C), nessuna inibizione (Figura 1D) o associazione positiva. Il laboratorio ampiamente disponibili ceppi di S. epidermidis e S. Tü3298 epidermidis Rp62A, e S. epidermidis e S. Rp62A aureus Newman sono stati utilizzati nelle figure 1B e 1D, rispettivamente. Suggeriamo che questi ceppi potrebbero essere utilizzati per testare questo protocollo.

A seconda delle specie testate, completa inibizione e parziale inibizione sono molto probabilmente il risultato di peptidi antimicrobici, antibiotici o altri inhibito crescita diffusibiliR prodotti dal ceppo inibitore produttrici. Parziale inibizione è stata anche legata alla ridotta disponibilità di nutrienti per il ceppo concorrente a causa di assorbimento o sequestro di sostanze nutritive dal ceppo inibitore ^6.

Confronto tra la dimensione della zona di inibizione tra diversi isolati inibitori producono testati contro lo stesso ceppo concorrente indica differenze di uno dei seguenti: la quantità di antimicrobico prodotta dal ceppo inibitore produttrici; la capacità dell'inibitore di diffondere attraverso i media; il tipo di inibitore prodotto e il livello di resistenza del ceppo concorrente inibitori prodotta. Confronto tra la dimensione della zona di inibizione tra i diversi ceppi concorrenti testati contro lo stesso ceppo inibitore-produzione è indicativo dei livelli di resistenza dei ceppi concorrente l'inibitore prodotta.

I risultati variano a seconda del ceppo inibitorio utilizzato e il ceppo concorrente utilizzato. Ripete che utilizzano lo stesso ceppo di inibizione e concorrente dovrebbero idealmente avere lo stesso punteggio di chiarezza (descritto nel capitolo 8.2), questo indica una buona tecnica è stata utilizzata in tutto.

Se si è verificato l'applicazione incoerente dei batteri non devono essere utilizzati i piatti. Ad esempio, se la cultura test del concorrente è troppo diluire la zona di inibizione apparirà più grande e con un bordo inferiore chiaramente definito quello tipicamente osservato (Figura 2A); questo potrebbe influenzare l'affidabilità di eventuali misure di zona di confronto. Se il punto ceppo inibitore produttrici non era completamente asciugato prima notte di incubazione, il ceppo inibitore è probabile che si diffonda e non formare un punto ben definito (Figura 2B), che colpisce in genere le misure di zona, ma può colpire anche il punteggio chiarezza. Se il ceppo concorrenteNon spruzzato uniformemente questo può portare a una distribuzione della batteri (Figura 2C). Se il ceppo concorrente è troppo concentrato è possibile che il ceppo concorrente può crescere sulla parte superiore del ceppo inibitore (Figura 2C), in casi estremi questo può portare a qualche inversione dei ruoli deformazione concorrente / inibitore.

Figura 1:. La gamma di risultati qualitativi e quantitativi che possono essere ottenuti dal test di inibizione della crescita differita risultati per l'inibizione della crescita possono variare da (A) inibizione completa (punteggio di 0), (B) parziale inibizione (punteggio di 1) , (C) parziale inibizione (punteggio di 2) a (d) nessuna inibizione (punteggio di 4). Le etichette indicano i bordi di crescita dei ceppi inibitori (Y) e il bordo esterno di inibizionezone (X). La dimensione della zona di inibizione gamma da 0 mm a più di 10 mm, come mostrato in (E), che mostra le misurazioni per le piastre fotografati in A, B, C e D. I risultati sono presentati recenti isolati stafilococchi (A , C) o comuni stafilococco laboratorio isolati S. epidermidis Tü3298 (inibitore) e S. epidermidis Rp62A (concorrente) (B), e S. epidermidis Rp62A (inibitore) e S. aureus Newman (concorrente) (D). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: esempi di risultati inconsistenti a causa della scarsa tecnica I risultati possono apparire diverso da quello previsto, se (A. ) ceppo concorrente era troppo diluito, (B) ceppo inibitore non era completamente asciutto prima di incubazione / piastre non erano a secco o (C) se il ceppo concorrente non è stato spruzzato in modo uniforme ed è stato troppo concentrato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Un punto critico di questo protocollo batterica concorso specie che lo differenzia dagli altri, è la notte di incubazione dell'inibitore isolare prima dell'aggiunta dell'isolato concorrente. Il ceppo inibitore richiede questo periodo di crescita per la produzione di composti inibitori. Poiché il ceppo concorrente pone sopra lo stesso mezzo, questo metodo consente al ricercatore di osservare l'intero potenziale del ceppo inibitore di interferire con la crescita del ceppo concorrente. Come risultato, questo saggio riflette ciò che accade con la natura; un isolato è completamente stabilito in una nicchia, e l'altro deve essere in grado di contrastare eventuali variabili inibitori di essere in grado di invadere con successo la nicchia.

Ci sono due parti di questo protocollo che hanno più probabilità di causare risultati errati se eseguita in modo non corretto. In primo luogo, la sterilizzazione incompleta delle bottiglie vaporizzatore può introdurre batteri contaminanti nel dosaggio. Incubation del brodo utilizzata per risciacquare il flacone vaporizzatore nel passaggio 3.6 in un recipiente sterile può essere usato per confermare bottiglie erano completamente sterilizzato. Altri lavaggi in soluzioni disinfettanti, come Virkon, possono essere utilizzate prima del lavaggio in superficie del detergente attiva, descritta nel passaggio 3.2, se è necessaria sterilizzazione aggiuntiva.

Un secondo passo che può causare risultati errati è la diluizione del ceppo concorrente (passo 6.1). Se la diluizione non è ottimale, chiare misurazioni di inibizione non possono essere facilmente determinati. Questo test è stato ottimizzato utilizzando vari isolati nasali come inibitore-ceppi produttori in una vasta gamma di specie di batteri Gram-positivi e Gram-negativi contro S. aureus SH1000 come il ^7,8 ceppo concorrente. In seguito è stato testato utilizzando vari stafilococchi coagulasi-negativi e coagulasi-positivi come concorrente e ceppi inibitore-produzione. Durante la prova di generi diversi da quelli descritti sopra come il competitoreceppo, qualche ottimizzazione della diluizione per l'inoculo può essere necessario.

Se i punteggi chiarezza variano in modo significativo tra le ripetizioni, potrebbe essere necessario standardizzare l'inoculo ceppo concorrente impostandolo a una densità ottica specifica. Tuttavia, questo aumenta il tempo dosaggio necessario per impostare, ed è in grado di ridurre il numero di ceppi è possibile elaborare per esperimento. Visivamente regolando la cultura ad un OD appropriato utilizzando uno standard McFarland può fornire una rapida alternativa.

Una limitazione di questa tecnica è che può essere applicato solo a batteri coltivabili. Questo è il motivo per cui molti studi utilizzano 16S rRNA sequenziamento di predire le interazioni di esclusione competitiva ^3,4,13. Tuttavia, le tecniche genetiche e metagenomiche può distinguere solo i membri della comunità a livello di specie, e / o non tenere conto di particolare variazione intraspecifica tratto. E 'possibile selezionare per l'associazione di un particulgene ar che codifica un tratto con la presenza o l'assenza di una specie batterica ^5, tuttavia ciò richiede pre-conoscenza di un gene probabilmente associati con esclusione di una specie.

Una considerazione sicurezza di questa tecnica è che, a causa della generazione di aerosol di batteri, esso può essere utilizzato solo in laboratori con un armadietto di sicurezza di livello 2, o con simili precauzioni di sicurezza. Ci sono tecniche alternative per testare la concorrenza tra gli isolati che rappresentano la variazione intraspecifica tratto e non generano aerosol di batteri. Uno di questi metodi è il dosaggio simultaneo dell'antagonismo ^2. In questo metodo, un inoculo di un isolato si sviluppa su una piastra di agar, e un secondo inoculo isolato è macchiata o pugnalato sopra una volta che il primo si è asciugato. Ciò produrrebbe un ambiente in cui le tensioni sono in concorrenza diretta (antagonismo simultanea), sia in competizione per la produzione di composti inibitori e scavenging nutrienti prima. il advantage del test di inibizione della crescita differita nel corso del test antagonismo simultanea è che l'isolato inibitore deve sempre avere il vantaggio competitivo di essere completamente stabilita prima dell'invasione dell'isolato concorrente. Questo è più riflettente di ciò che succederebbe nell'ambiente, come nella maggior parte nicchie, sarà stabilito un isolato prima che venga aggiunto un altro ceppo, piuttosto che due isolati aggiunti contemporaneamente ^8.

Un'altra alternativa per evitare la generazione di aerosol di batteri sarebbe aggiungere il concorrente isolare in cima agar, che potrebbe essere versato anziché spruzzata sulla isolare inibitore. Tuttavia, il volume della parte superiore agar aggiunto dovrebbe essere di circa 3 ml di garantire una copertura uniforme della piastra. All'interno di questo volume, l'isolato concorrente non sarebbe cresce sugli stessi media come l'isolato inibitore, in modo da non soffrire di nutrienti ridotti. Il concorrente sarebbe anche non essere in contatto diretto con tutti i composti inibitori until loro diffuso nella top agar. Tale test non potrebbe essere descritto come l'inibizione differito o antagonismo simultanea.

Un metodo simile è stato precedentemente utilizzato per valutare i livelli di resistenza bacitracina tra S. clinica aureus isolati ^10. La differenza principale tra il protocollo descritto qui e quello descritto da ^10, è quest'ultimo ceppi concorrenti classificati come sensibili (completare chiarezza inhibition- punteggio 0) o resistenti (parziali chiarezza inhibition- punteggio 1-5). Il test di inibizione della crescita differita potrebbe quindi anche essere usato per individuare i livelli di resistenza ai produttori di particolari antimicrobici, o anche per la ricerca di nuovi antimicrobici attivi contro i patogeni multi-farmaco resistente.

È stato suggerito che la microflora ospitanti possono essere manipolati per eliminare componenti indesiderabili della comunità batterica ^9. L'applicazione di corinebatteri o stafilococcoylococcus epidermidis hanno già dimostrato di eliminare S. aureus colonizzazione nelle narici in una percentuale significativa della popolazione ^11,12. Studi in ceppi specifici che possono competitivamente escludere membri indesiderabili della flora ospitanti, attraverso tecniche come quella qui descritta, può quindi portare a terapie future.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain heart infusion broth	Lab M	lab049	rich general purpose media
agar-agar	Merck Milipore	101614
Petri dishes	Sarstedt	82.1473.001
Plastic perfume vaporizer	not known	-	10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket
Universal bottles		no longer in production, alternative SLS BOT5006	28 ml glass cylindrical bottle (~280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap
Decon 90	Decon		surface active cleaning agent