Preparazione di CD4<sup&gt; +</sup&gt; Le cellule T per l&#39;analisi di GD3 e GD2 Gangliosidi membrana Expression al microscopio

Riepilogo

Descriviamo un protocollo di colorazione degli anticorpi standard per l'uso in microscopia per determinare l'espressione di membrana e la localizzazione di gangliosidi a riposo e ingenuo cellule T CD4 ⁺ attivate umani. sono descritte anche in tempo reale esperimenti di PCR utilizzando <40.000 cellule che non necessitano di ulteriori kit a basso RNA ingresso.

Abstract

I metodi qui descritti per l'attivazione delle cellule T CD4 ⁺ naive in sospensione e la loro adesione a lamelle per l'analisi al microscopio confocale consentono la localizzazione spaziale e la visualizzazione dei gangliosidi coinvolti nella attivazione delle cellule T CD4 ^+, che l'espressione di complemento profiling esperimenti come la citometria a flusso, occidentale assorbente o real-time PCR. La quantificazione di espressione ganglioside tramite citometria di flusso e la loro localizzazione cellulare mediante microscopia può essere ottenuta con l'uso di anticorpi anti-gangliosidi con alta affinità e specificità. Tuttavia, una adeguata gestione delle cellule in sospensione comporta il trattamento di piastre di coltura per promuovere l'adesione necessaria richiesta per la fluorescenza o acquisizione microscopia confocale. In questo lavoro, si descrive un protocollo per la determinazione GD3 e GD2 espressione ganglioside e colocalization con il TCR durante l'attivazione ingenuo cellule T CD4 ^+. Inoltre, real-tesperimenti ime PCR utilizzando <40.000 cellule sono descritti per la determinazione del GD3 e geni sintasi GM2 / GD2, dimostrando che gli esperimenti di analisi gene possono essere eseguite con un basso numero di cellule e senza la necessità di ulteriori kit bassa RNA ingresso.

Introduzione

Le cellule T CD4 ⁺ orchestrare la risposta immunitaria attraverso le loro funzioni effettrici dopo l'attivazione da parte delle cellule presentanti l'antigene ^1. Lo studio dei meccanismi cellulari che vengono modulati durante l'attivazione permette spaccato un processo di base della funzione immunitaria. Tuttavia, lo studio delle cellule T CD4 ⁺ naive può essere complicato perché rappresentano una piccola frazione di cellule nella periferia del sangue ^2.

Attraverso la microscopia a fluorescenza diversi rapporti hanno studiato la localizzazione di diverse molecole coinvolte nella attivazione delle cellule T CD4 ^+, principalmente proteine associate alla membrana plasmatica ^3. I gangliosidi sono glicosfingolipidi acido sialico che contiene e, anche se sono stati ampiamente studiati nelle cellule nervose dove sono abbondanti, altre cellule, come le cellule immunitarie esprimono anche gangliosidi con funzioni biologicamente rilevanti ^4,5. Abbiamo precedentemente riportato that durante l'attivazione delle cellule T CD4 ⁺ naive umane vi è un up-regolazione del α2,8 sialyltransferase ST8Sia 1 (GD3 sintasi) e la sintasi GM2 / GD2, che inducono il significativo neoexpression superficie GD2 e l'up-regolazione di GD3 ganglioside ^6. Ulteriori studi di GD3, GD2 e altri gangliosidi nelle cellule immunitarie è necessario per completare una vista parziale a base di proteine ​​della funzione immunitaria.

Comunemente, lo studio dell'espressione ganglioside si basa su tecniche quali la cromatografia su strato sottile (TLC) ^7, ma questa tecnica non consente la localizzazione spaziale dei gangliosidi a livello della membrana plasmatica o in compartimenti subcellulari, limitando analisi biologiche.

In questo lavoro, si descrive un protocollo per l'identificazione anticorpo-mediata e la localizzazione di GD3 e GD2 gangliosidi nelle cellule T CD4 ⁺ naive umani e PBMC dopo l'attivazione anti-CD28 anti-CD3 /. Con questo protocollo è is anche possibile analizzare l'espressione genica e molecolare di gangliosidi in un basso numero di cellule in sospensione, con l'acquisizione di immagini di alta qualità ^6, considerando le piccole dimensioni dei linfociti (9 micron).

Protocollo

Il sangue periferico da donatori sani di sesso maschile è stato ottenuto con il consenso informato e l'approvazione del Comitato di Bioetica del Centro de Investigación en Dinamica Celular- Universidad Autonoma del Estado de Morelos.

1. L'isolamento e l'attivazione di ^cellule T CD4 umana Naïve

1. Raccogliere 2 ml di sangue periferico derivano da donatori umani sani attraverso il consenso informato e diluire con 2 ml di PBS sterile-EDTA (1x tampone fosfato (PBS), 2 mM EDTA, pH 7,4). Aggiungere il sangue diluito lentamente sulla cima di 3 ml di soluzione di saccarosio con 1.077 densità come precedentemente descritto ^8.
   Nota: migrazione differenziale durante la centrifugazione causata da differenze di densità causerà eritrociti sedimentano completamente e uno strato di cellule mononucleate meno dense formerà sopra. 2 ml di sangue periferico renderanno circa 0,5 x 10 ⁶ ingenui cellule T CD4 ⁺ dopo la purificatisui gradini.
2. Centrifugare 30 min a 250 xga 21 ° C (rotore uso per i tubi a fondo tondo con angolo fisso di 30 mm) senza interruzione per generare il gradiente di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). Dopo centrifugazione, il PBMC può osservare chiaramente come un anello bianco. Raccogliere le PBMC con una pipetta e trasferimento in provetta sterile per il lavaggio.
3. Dopo tre lavaggi con soluzione PBS-EDTA a 250 xg per 10 min procedere alla purificazione di cellule T CD4 ⁺ naive. metodi di cernita o diversi tipi di kit di purificazione sono disponibili per questo scopo. Preferibilmente, utilizzare> 1 x 10 ⁷ PBMC per la purificazione.
   1. Purificare cellule T CD4 ⁺ naive per selezione negativa con sfere magnetiche. Eseguire la selezione negativa con l'anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRγ / δ, anti-HLA-DR, e CD235a (glicoforina A) anticorpi. Valutare la percentuale di purezza attraverso la determinazione delle cellule CD4 + CD45RA + a Fbasso citometria.
      Nota: Facoltativamente, procedere alla incubazione delle PBMC notte a 37 ° C e 5% CO ₂ con una densità di 1 x 10 ⁶ cellule / ml in 10 ml di mezzo integrato per promuovere monociti aderenza e continua con la purificazione naif cellule T CD4 ^+. Il recupero efficiente di cellule naïve T CD4 ⁺ da sangue periferico dipende in gran parte il sistema di depurazione.
4. Preparare 24-pozzetti di coltura cellulare aggiungendo 250 microlitri per pozzetto di PBS con 5 mg / ml anticorpo monoclonale anti CD3 e incubare per almeno 2 ore a 37 ° C.
   Nota: Piastre con 96 pozzetti possono essere utilizzati quando si utilizzano un numero minore di cellule T CD4 ⁺ naive (ad esempio, 2 x10 ⁴ -1 x 10 ^5).
5. Rimuovere l'anti diluizione degli anticorpi CD3 dal 24 bene o 96 pozzetti e lavare i piatti due volte con sterile PBS 1x.
6. Diluire le cellule naive T CD4 ⁺ con> 95% di purezza (CD4 +CD45RA +) ad una densità di 1 x 10 ⁶ cellule / ml in advanced terreno RPMI 1640 supplementato con 3% di siero fetale bovino (o RPMI supplementato con 10% di siero), 2 mM glutammina e antibiotici (1 U / ml di penicillina, 1 ug / ml di streptomicina).
   Nota: Se è richiesta la localizzazione ganglioside in PBMC, seguire lo stesso protocollo per la diluizione e la stimolazione come descritto di seguito.
7. Aggiungere 500 ml di diluizione cella per pozzetti anti-CD3 rivestiti e non rivestiti pozzetti (cellule di controllo) nella piastra 24 pozzetti. In alternativa, aggiungere 100 ml di diluizione cella per i pozzetti della piastra da 96 pozzetti.
8. Completare le condizioni di stimolazione delle cellule T CD4 ⁺ naive nei pozzi anti-CD3 rivestiti con l'aggiunta di 1 mg / ml di anticorpi anti CD28.
9. Mantenere le riposo cellule T CD4 ⁺ il controllo nei pozzetti non rivestiti, senza aggiunta di anticorpi anti CD28. Incubare il riposo e attiva cellule T CD4 ⁺ per 0 72 ore in condizioni standard di 37 °C e 5% di CO _2.
10. Per verificare l'attivazione adeguata valutare mediante citometria a flusso l'espressione del marcatore precoce attivazione CD69 (16 ore post-attivazione) o marcatore di attivazione ritardo CD25 (48 ore post-attivazione) in riposo e attivato ingenui cellule T CD4 ⁺ incubate a 37 ° C e il 5% di CO ₂ in assenza o presenza di anticorpi anti CD3 / CD28 anticorpi ^9,10.

2. L'aderenza del Riposo e Attivato ^cellule T CD4 Naïve

1. Sterilizzare 12 mm coprioggetto tondo in autoclave e l'esposizione ai raggi UV per almeno 15 min.
2. Luogo coprioggetto in piastre di coltura cellulare di 24 pozzetti sterili.
   Nota: Per le culture con meno di 1 x 10 ⁵ cellule è preferibile utilizzare camere di scorrimento con pozzetti adattate per evitare la dispersione delle cellule del vetrino.
3. coprioggetto Coat (o camera di scorrimento) con 200 ml di poli-L-lisina (MW 150-300 KDa) 0,1% (w / v) e incubare per 5 minuti a rtemperatura OOM (RT), rimuovere e asciugare per almeno 1 ora a temperatura ambiente.
4. Mescolare con cura e raccogliere il riposo e le cellule T CD4 ⁺ naive attivati dalle piastre da 24 pozzetti. Contare le cellule e, se necessario, regolare con terreno fresco integrato per trasferire 1 x 10 ⁵ cellule per i vetrini rivestiti di poli-L-lisina. Incubare le cellule per un minimo di 6 ore a 37 ^° C e 5% CO _2.

3. La raccolta e la fissazione di Riposo e attivato cellule naive T CD4 ⁺

1. Rimuovere con attenzione il supporto dal riposo colto e cellule T CD4 ⁺ naive attivati.
2. Aggiungere 500 ml di RT PBS sterile lentamente.
   Nota: attenta aggiunta e la rimozione di soluzioni da pozzi impedisce il distacco delle cellule dal vetrino.
3. Eliminare il PBS e aggiungere un altro 500 microlitri di PBS per rimuovere completamente terreni di coltura.
4. Fissare le cellule mediante aggiunta di 500 microlitri filtrata 4% paraformaldeide (filtrazione rimuove microparticelle che possono interferire con l'analisi al microscopio) e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (preferito) o per una notte a 4 ° C.
   Attenzione: Paraformaldeide è un composto tossico e volatile. E 'noto per essere cancerogeno per l'uomo. Usare con cautela con un adeguato protocollo di sicurezza.
5. Rimuovere il fissativo e lavare almeno due volte con PBS a temperatura ambiente.
6. Procedere alla fase successiva o mantenere i pozzetti della piastra con 500 ml di PBS a 4 ° C per diversi giorni fino a colorazione.
   Nota: La sterilità durante questo processo consente di evitare la crescita di microrganismi.

4. La colorazione, montaggio e visualizzazione per Microscopia confocale

1. Rimuovere la PBS dai pozzetti. Aggiungere 500 ml di tampone di bloccaggio freddo (1x PBS, 0,5% qualità standard di albumina sierica bovina, 1% di siero fetale bovino pH 7,4). Incubare per 20 min in ghiaccio.
2. Rimuovere con attenzione il tampone di bloccaggio e aggiungere gli anticorpi primari (gangliosidi anti-GD3 clone R24, GD2 clone 14G2a),PE-coniugato contro CD25 e APC-coniugato contro TCR e isotipi controlli diluiti in tampone di bloccaggio a 2,5 mg / ml.
3. Incubare 2 ore sul ghiaccio o una notte a 4 ° C.
   Nota: lenta agitazione orbitale è preferibile.
4. Rimuovere l'anticorpo con attenzione e aggiungere lentamente 500 ml di PBS. Ripetere due volte.
5. Aggiungere gli anticorpi secondari (FITC coniugato IgG3 contro per R24 ​​contro GD3, Alexa Fluor 488 coniugato o Alexa Fluor 647 coniugato IgG2a contro per 14G2a anti- GD2) diluito in tampone di bloccaggio a 0,1 mg / ml.
6. Incubare per 1 ora in ghiaccio al buio senza agitare.
7. Lavare tre volte in PBS come descritto in 4.4). Mantenere i pozzetti con PBS sufficiente per evitare la disidratazione dei campioni.
8. Aggiungere Hoechst 333.258 macchia diluito in PBS a 0,1 mg / ml.
9. Incubare 15 minuti a temperatura ambiente e rimuovere. Lavare tre volte in PBS.
10. Porre i vetrini su un tovagliolo di carta e aggiungere 20 ml di soluzione di montaggio (50% glicerolo in PBS) o soluzione di montaggio commerciales per evitare lo scolorimento e tempra da campioni.
11. scegliere con cura il vetrino con le pinzette sottili e posizionarlo sulla soluzione di montaggio. Assicurarsi che il lato del vetrino su cui sono fissati cellule è in contatto con la soluzione. Sigillare il coprioggetto con smalto e analizzare utilizzando la fluorescenza o microscopia confocale.

5. L'isolamento di RNA

1. Preparare anticorpi anti CD3 (5 mg / ml) rivestito in piastre da 96 pozzetti. Incubare 4 x 10 ⁴ cellule T CD4 ⁺ naive / e in 100 ml di terreno di coltura integrato con anticorpi CD28 contro (1 mg / ml) per completare lo stimolo. Incubare a 37 ° C e 5% CO ₂ per 0 72 ore.
2. Dopo diversi tempi post-attivazione mettere le cellule in una provetta.
3. Aggiungere 500 ml di PBS e centrifugare a 250 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
4. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di reagente Trizol.
5. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente e conservare il campione a -8076; C per almeno 24 ore. Procedere con l'isolamento di RNA quando necessario.
   Nota: Lasciare il campione a -80 ° C per almeno 24 ore migliora la resa RNA. Inoltre, l'uso di guanti è essenziale per evitare la degradazione dell'RNA da RNasi.
6. Scongelare il campione mediante incubazione a 37 ° C per 2 minuti in un bagno d'acqua.
7. Aggiungere 200 ml di cloroformio e agitare vigorosamente a mano per 30 sec (per evitare la miscelazione aggressiva di RNA nel vortex). Incubare 5 minuti a temperatura ambiente.
8. Centrifugare 15 min a 12.000 xg a 4 ° C.
9. Recuperare la fase acquosa in una nuova provetta.
10. Aggiungere 500 microlitri isopropanolo e capovolgere il tubo tre volte.
11. Incubare 10 minuti a temperatura ambiente e centrifugare per 10 minuti a 12.000 xg a 4 ° C.
12. Eliminare il surnatante per inversione.
13. Aggiungere 1 ml di ghiaccio freddo 75% di etanolo e centrifugare 10 min a 12.000 xg a 4 ° C.
14. Completamente scartare il surnatante e asciugare il pellet di RNA lasciando il tappo del tubo aperto.
    None: A questo punto il pellet non è chiaramente visibile. Procedere comunque.
15. Risospendere il pellet in 20 ml di acqua di grado molecolare. Calcolare la concentrazione e la purezza di acidi nucleici misurando l'assorbanza 260 nm e 280 nm usando NanoDrop.
16. Procedere con attenzione per la sintesi di cDNA utilizzando qualsiasi kit trascrittasi inversa convenzionale e seguendo il protocollo del produttore di.
    Nota: circa 0,5-2 mg di RNA è ottenuto da cellule T CD4 ⁺ 4 x 10 ⁴ ingenuo. cDNA può essere sintetizzato da 100 ng di RNA e usati in reazioni di PCR in tempo reale senza la necessità di kit ingresso di basso RNA.

Risultati

Il protocollo descritto in questo manoscritto rende una buona qualità di colto e di riposo aderito e ingenuo cellule T CD4 ⁺ attivate umani (Figura 1). Le cellule T CD4 ⁺ attivate mostrano la caratteristica profilo proliferativa (Figura 1B) rispetto alla condizione di riposo (Figura 1A). Il marcatore di attivazione ritardo CD25 è utile per valutare l'attivazione efficiente a 72 h osservato mediante microscopia...

Discussione

Il protocollo descritto può essere utilizzato per localizzare gangliosidi o proteine in sospensioni cellulari di cellule T CD4 ⁺ o altre cellule immunitarie (ad esempio, PMBCs, Figura 5) a partire da un piccolo numero di cellule. A causa delle piccole dimensioni di cellule T e proprietà antiaderenti, l'acquisizione di fluorescenza immagini microscopiche comporta informazioni scarsa o bassa qualità se le cellule non siano rispettati correttamente.

Q...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	12633-012	Suplemented with 3% FBS
mouse anti human CD3 antibody	eBioscience	16-0037-81	OKT3 clone
mouse anti human CD28 antibody	ebioscience	16-0288-81	CD28.6 clone
mouse anti human GD3  antibody	Abcam	ab11779	R24 clone
mouse anti human GD2 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-53831	14G2a clone
FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody	Abcam	ab97259
Alexa Fluor 488 conjugated antimouse	Thermo Fisher Scieni¡tific	A-21131
IgG2a antibody
Alexa Fluor 647 conjugated antimouse	Thermo Fisher Scieni¡tific	A-21241
IgG2a antibody
Hoechst 333258	Sigma-Aldrich	861405
Ficoll Paque-Plus	GE	17-1440-02
Trizol Reagent	Invitrogen	15596-026
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human	MACS Miltenyi Biotec	130-094-131
BD FACSAria II	BD Biosciences		Sorting
Nunc Lab-tek chamber slide system	Sigma-Aldrich	C7182
Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus)	Olympus		Upright BX61WI and IX81
Forward sequence primer GD3 synthase	5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´		Ref. 7
Reverse sequence primer GD3 synthase	5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´		Ref. 7
Forward sequence primer GM2/GD2 synthase	5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´		Ref. 7
Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase	5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´		Ref. 7