Un modello acuta della retina per la valutazione sanguigni della retina barriera breccia e potenziali farmaci per il trattamento

Riepilogo

A basso costo, il sistema facile da usare e potente è stabilito per valutare i potenziali trattamenti che potrebbero migliorare barriera emato-retinica violazione indotta da istamina. perdita dei vasi sanguigni, l'attivazione delle cellule Müller e la continuità dei processi neuronali sono utilizzati per valutare la risposta al danno e la sua inversione con un potenziale farmaco, Lipoxin A4.

Abstract

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of Müller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of Müller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

Introduzione

Un crescente corpo di prove sostiene l'esistenza di barriera retinica sangue (BRB) ^1-5 e la sua somiglianza con la barriera emato-encefalica (BBB) ^​​6,7. Compromesso della BBB è stata strettamente legata causalmente o come marcatore diagnostico per le malattie neurodegenerative croniche come il morbo di Alzheimer (AD) ^8,9 e acuti condizioni come il delirio ^10. intuizioni meccanicistici in queste patologie e scoperte per i potenziali bersagli farmacologici sono generalmente ostacolati dalla limitata accessibilità e network complessità del cervello. Alternative come l'imaging in vivo ^11, cervello organotipica cultura ^12, colture cellulari primarie ^13,14 e sistemi di co-coltura ^{di 15} sono stati generati. Tuttavia, la maggior parte di questi modelli richiede strumenti speciali, lunghi periodi sperimentali o più marcatori per identificare le cellule. somiglianze funzionali e strutturali tra BBB e BRB nonché una correlazione tra la dysfunctions dei due sono stati sostenuto ^16-19. Inoltre, un più facile accesso, tipi cellulari ben definiti e una struttura stratificata hanno consentito la retina ben caratterizzato come una finestra al cervello. Le identità strutturali e funzionali della BBB e BRB ancora essere confrontato nel dettaglio. Tuttavia, patologie retiniche, soprattutto la breccia BRB, sono stati strettamente associati con la progressione di varie malattie, compreso il diabete ^18-19 e AD ^21,22. Pertanto, è di interesse per stabilire un sistema disfunzione BRB non solo per delineare il meccanismo ma anche per schermo potenziali farmaci. In questo rapporto, un protocollo che consente BRB disfunzione utilizzando una semplice cultura della retina acuta è sviluppato e presentato.

Aumento della permeabilità BBB e cambiamenti patologici AD-simili sono stati stabiliti in una cultura organotipica cervello incubate con l'istamina, un mediatore pro-infiammatorio ^12. Pertanto, nel sistema presentato, istamina era applied alla cultura della retina ex vivo per indurre disfunzioni BRB. Retine da diverse specie, come il Mus musculus e Bos taurus, sono stati testati. Grazie alla loro disponibilità commerciale e somiglianza con tessuti umani, bulbi oculari suina fresca sono stati utilizzati per fornire i dati qui riportati. Dopo incubazione con istamina e / o altri farmaci, le retine sono state preparate per la valutazione mediante immunocolorazione per diverse proteine ^​​12, come immunoglobuline G (IgG), uno dei principali componenti del sangue; proteina silicea fibrillare gliale (GFAP), un indicatore ben noto per l'attivazione gliale; e proteine ​​associate ai microtubuli 2 (MAP2), una specifica dei neuroni del citoscheletro proteina essenziale per l'assemblaggio dei microtubuli. Inoltre, la struttura a strati della retina consente un'analisi dettagliata dei processi di cellule Müller e cellule gangliari, quali i cambiamenti nella loro larghezza e continuità. Così diversi parametri aggiuntivi sono disponibili per valutare le conseguenze dellaBRB violazione in una fase iniziale e per valutare gli effetti di inversione di potenziali trattamenti pure.

In questo protocollo, i potenziali effetti di inversione dei farmaci schermati vengono valutati da tre prospettive: la fuoriuscita di vasi sanguigni (BVS), l'attivazione delle cellule gliali e il danno-risposta delle cellule neuronali. Diversi metodi di quantificazione sono utilizzati, per esempio, il livello di espressione dimostra intensità della immunocolorazione, misura della larghezza di un processo e la continuità dei processi neuronali mostrati da un filtro accessorio. Per meglio illustrare il metodo e per interpretare i risultati, Lipoxin A4 (LXA4), un composto endogeno sintetizzato in risposta al danno infiammatorio e attenuando la disfunzione endoteliale ^23, è stata scelta a scopo dimostrativo.

Protocollo

Tutti i protocolli sono stati effettuati nel rispetto delle norme del Comitato di cura e l'uso di animali istituzionale, se del caso.

1. Preparazione

1. Preparare il supporto di stabilizzazione con il 75% di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), il 25% Hanks 'soluzione salina bilanciata (HBSS). Mescolare bene, aliquotare e conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.
2. Preparare il tampone fosfato (PBS) e sterilizzare in autoclave. Conservare la soluzione a temperatura ambiente. Riscaldare la PBS a 37 ° C prima dell'esperimento (5 ml per pozzetto).
3. Preparare 10%, 20% e 30% di saccarosio in PBS. Filtrare tutte le soluzioni individualmente oltre separati 0,22 micron filtri per la sterilizzazione. Salvare le soluzioni a 4 ° C.
4. Preparare la soluzione di istamina magazzino in PBS ad una concentrazione di 90 mm. Sterilizzare la soluzione per filtrazione su filtro 0,22 micron. Aliquotare e salvare la soluzione a -80 ° C. Evitare ripetuti cicli di congelamento e scongelamento.
5. Rendere fresca 4% paraformaldeide (PFA) in PBS prima dell'esperimento. Posizionarlo sul ghiaccio.
   Attenzione: tenere PFA in una cappa aspirante e indossare equipaggiamento protettivo.
6. Scongelare il supporto di stabilizzazione (20 ml per retina). Aggiungere penicillina-streptomicina ad una concentrazione finale di 100 U / ml. parte calda del mezzo (15 ml per retina) a 37 ° C in incubatore prima dell'esperimento. Lasciare il resto del mezzo su ghiaccio.
7. Posizionare il HBSS (10 ml per retina) sul ghiaccio.

2. retina Cultura Organotipica

1. Trasferire i campioni ad una cappa coltura tissutale. Aprire l'oculare tagliando intorno alla lente. Utilizzando un pennello, rimuovere delicatamente il vitreo senza tirare sulla retina. staccare delicatamente la retina dal bordo di taglio con una spazzola per esporre il disco ottico. Grave il nervo ottico con un rasoio e rilasciare la retina.
2. Trasferire la retina in una capsula di Petri e risciacquare con cura la retina una volta con HBSS freddo. Trasferire il campione in HBSS su ICE. Sezionare il maggior numero di retine fuori, se necessario ripetendo passo 2.1 e questo passo.
3. Tagliare la retina a metà simmetricamente con un rasoio. Delicatamente trasferire i campioni di un 6-bene con 3 ml di mezzi di stabilizzazione per pozzetto. Consentire equilibrazione per 30 min a 37 ° C in un incubatore con l'atmosfera contenente il 5% di CO _2.
4. Preparare i seguenti reagenti durante l'incubazione a Passo 2.3: Diluire la soluzione di istamina magazzino alla concentrazione desiderata (450 micron) in media caldo. Sciogliere LXA4 (immagazzinato sotto argon) in mezzo ad una concentrazione finale di 250 ng / ml.
   NOTA: Quando si misura l'effetto di LXA4, una metà da una singola retina viene utilizzato solo per l'istamina, mentre l'altra metà è utilizzato per l'istamina con LXA4.
5. Aspirare il mezzo di stabilizzazione con attenzione e aggiungere il mezzo preparato in ogni pozzetto (3 ml per pozzetto). Incubare i campioni a 37 ° C per 1 ora in un incubatore con l'atmosfera contenente il 5% di CO _2.
6. Sciacquare ilcampioni di volta in caldo, PBS sterile.

3. Preparare i campioni per Immunocolorazione

1. Aspirare PBS dalle piastre. Aggiungere 4% PFA (3 ml per pozzetto) e incubare per 15 min a temperatura ambiente.
2. aspirare rapidamente il PFA. Lavare i campioni una volta con PBS. Trasferire i campioni al 10% di saccarosio (5 ml per pozzetto) e incubare per 2 a 4 ore a 4 ° C.
3. Trasferire i campioni ad un saccarosio 30% (5 ml per pozzetto) e incubare una notte a 4 ° C. Mescolare una parte del mezzo di congelamento commerciale con due parti di 20% di saccarosio per rendere il mezzo congelamento lavorare. Lasciare a 4 ° C per una notte o più a lungo fino a quando l'aria bolle scompaiono.
4. Trasferire i campioni al mezzo di congelamento di lavoro e raggiungere l'equilibrio per 5 min a temperatura ambiente. Tagliare ogni retina in rettangoli (circa 3 mm di 5 mm).
5. Trasferire accuratamente i campioni nei mezzi congelamento lavorare contenuta in un contenitore cilindrico (circa 1 cm Altezza Raggio x 2 cm) devzato da un foglio di alluminio. Assicurarsi che le fette retiniche verticale (orientata per fornire una sezione trasversale della retina upon sezionamento) e congelare in azoto liquido. Salvare i blocchi a -80 ° C fino al momento dell'uso.
6. Sezione ogni blocco su un criostato in 14 micron fette spesse e montare le sezioni su vetrini. Conservare i vetrini a -80 ° C fino al momento dell'uso.

4. immunocolorazione

1. Lavare le sezioni con tampone fosfato 5% di saccarosio (SPB, 5% di saccarosio in PBS, pH 7,4) una volta. Bloccare le non specifici siti di legame incubando le sezioni in tampone di bloccaggio (5% SPB con 10% siero di capra normale e 0,5% Triton X-100) per 1 ora a temperatura ambiente.
2. Incubare sezioni (su diapositive) con l'anticorpo primario appropriata (GFAP o MAP2, diluito 1: 500 in tampone di bloccaggio) per 1 ora. Aspirare la soluzione. Lavare tre volte in 5% SPB. Per la colorazione del endogena IgG, saltare questo passaggio.
3. Incubare le sezioni con la seconda corrispondenteanticorpi Dary (Cyanine3 / FITC coniugato asino anti-topo / anti-IgG di coniglio, diluito 1: 800 in tampone di bloccaggio) per 1 ora.
4. Lavare le sezioni accuratamente con 5% SPB tre volte. Preparare i campioni per la microscopia da loro montaggio in mezzo di montaggio contenente DAPI e copertura con lamelle.
5. Utilizzando un laser microscopio confocale, catturare immagini attraverso una lente 20X sotto parametri identici come l'intensità del laser, valore di guadagno, tempo di sosta, ecc tra i gruppi. Impostare le lunghezze d'onda di eccitazione / emissione per il canale blu (per rilevare DAPI) come 408/447 nm, per il canale rosso (per rilevare Cyanine3) come 561/785 nm e per il canale verde (per rilevare FITC) come 488/525 nm .

Analisi 5. Immagine

1. Quantificare la percentuale dei vasi sanguigni che perde in base ai seguenti criteri ^12: Include solo vasi sanguigni con nuclei delle cellule endoteliali all'interno del piano di sezione nel conteggio; prendere in considerazione una che perde vaso sanguigno se mostra aggardiente di immunostaining che circonda la nave.
2. Per determinare il livello di espressione, selezionare regioni di interesse e misurare il valore di grigio medio utilizzando il software di analisi di immagine.
3. Per misurare la larghezza del processo, scegliere un'area della sezione in cui i processi sono distinti (strato esterno nucleare ONL, per esempio). Quindi scegliere un campo ottico in cui tali processi sono visibili e continuo. Impostare la barra di scala in base all'impostazione microscopico, tracciare una linea attraverso il processo ed eseguire la misurazione.
4. Per analizzare la continuità del processo, selezionare regioni di interesse, applicare il filtro chiamato varianza che esalta le bordi dell'immagine sostituendo ogni pixel con la sua varianza zona, regolare automaticamente il contrasto e la luminosità, contare le righe e normalizzare il conteggio dal la zona.
5. Calcola significatività statistica con t-test di Student a due code. *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0.001. Pmolto il risultato come media ± SEM.

Risultati

Vi presentiamo un basso costo, sistema di time-efficiente e facile da usare per valutare i potenziali trattamenti che potrebbero proteggere contro la violazione BRB indotta da istamina. IgG è vincolato all'interno dei vasi in retina di controllo (Figura 1A), ma le perdite fuori dei vasi sanguigni su esposizione istamina (Figura 1B), a conferma che il modello è stata stabilita.

LXA4 è st...

Discussione

In this report, we present a powerful ex vivo acute retinal model of BRB dysfunction using the swine retina. This model system does not require special instruments and can be easily adapted under most laboratory settings. However, to obtain a successful result, several steps require close attention. After obtaining the eyeballs from the source, they must be kept at 4 °C or on ice and processed as soon as possible. When the effect of a treatment is being analyzed, two halves of the same retina must be used -...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Life Technologies	11965-092
HBSS	Life Technologies	14170-112
Sucrose	J.T.Baker	4072-05
Histamine	Sigma	H7125-1G
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen
PFA	Electron Microscopy Sciences	15710
Freezing Media	Triangle Biomedical Sciences	TFM-5
Normal Goat Serum	Rockland	D104-00-0050
Triton X-100	Sigma	T8787
GFAP Antibody	Millipore	AB5804
MAP2 Antibody	EMD Millipore	MAB3418
FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.	711-095-152
Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.	715-165-150
mounting medium containing DAPI	Vector Laboratories, Inc.	H-1200
Laser Confocal Microscope	Nikon	Eclipse Ti microscope
ImageJ	National Institutes of Health	1.45s