Rapida acquisizione di immagini 3D utilizzando ad alta risoluzione Episcopica Microscopia

Riepilogo

We describe a detailed protocol using high-resolution episcopic microscopy to acquire three-dimensional (3D) images of mouse embryos. This improved protocol utilizes a modified tissue preparation method to enhance penetration of the fluorescent dye, thereby permitting morphometric analysis of both small and large-sized specimens.

Abstract

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) morphometric data. Here, we describe the detailed protocol to image the entire mouse embryo. The protocol consists of four major sections: sample preparation, embedding, image acquisition and finally, 3D visualization. The technology requires specimens to be stained with a fluorescent dye, which can be problematic for large or dense specimens. To overcome this limitation, we have improved the existing protocol to enhance tissue penetration of the dye by pretreating the specimen with a solution containing urea and sodium dodecyl sulfate. The protocol uses only routine laboratory equipment and reagents for easy adaptation in standard laboratory settings. We show that the resulting high-resolution 3D images faithfully recapitulate the detailed morphologic features of the internal organs of mouse embryos, thereby permitting morphometric analyses. Together, we present a detailed and improved protocol using standard laboratory equipment to acquire high-resolution 3D images of small and large sized specimens.

Introduzione

The advent of 3D imaging technologies has opened the possibility of systemic analysis of detailed morphological features during fetal development. A variety of 3D imaging modalities is now available include micro-magnetic resonance imaging (micro-MRI), micro computed tomography, high frequency ultrasound, optical coherence tomography, optical project tomography and episcopic microscopy^1-4. Each modality has its own unique features in resolution, contrast, speed, cost, in utero capability and availability.

Episcopic fluorescence image capture (EFIC) and high-resolution episcopic microscopy (HREM) are episcopic microscopy imaging methods⁴. Here, high-resolution serial images are captured continuously from the block face instead of tissue sections. The resulting images faithfully reflect detailed morphological features with minimal or no tissue distortion. The acquired volumetric data is readily converted to high-resolution 3-D images suitable for accurate morphometric analysis. Because of relative low cost and high resolution, HREM and EPIC have become the superior alternatives for systemic assessment of mouse models of human birth defects^2,4-8.

Both EFIC and HREM methods require specimens to be embedded in the suitable medium. EFIC detects autofluorescence emitted from the embedded tissue. Because of this, it is limited to specimens emitting high levels of autofluorescence but not those with relatively weak autofluorescence such as early stage embryos⁹. To overcome the dependency of autofluorescence, specimens are stained with a fluorescent dye such as eosin for HREM imaging. The choices of dyes and staining methods also make HREM more compatible to detect molecular signals in the context of tissue architecture and morphology^4,10.

In this article, we present an improved HREM protocol suitable for whole body assessment of the late stage mouse embryos. To facilitate staining, we include a pretreatment step to increase tissue penetration, thereby enabling HREM imaging of older mouse embryos.

Protocollo

Tutti gli usi animali sono approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale animali all'ospedale dei bambini Boston.

Preparazione 1. Esempio

1. accoppiamento temporizzata
   1. Inserire un C57Bl6 tipo selvaggio maschio e una femmina insieme nella stessa gabbia.
   2. Controllare per la formazione di una spina di accoppiamento mattina successiva. La spina di accoppiamento (aka, vaginale o la spina copula) è una deposizione gelatinosa indurito che blocca la vagina.
   3. Impostare la data presa come giorno embrionale 0,5 (E0.5).
2. Isolamento di embrioni di topo
   1. Eutanasia femmine gravide da CO ₂ asfissia.
   2. Mettere topi supina su un tampone assorbente e spruzzare regione addominale con il 70% di etanolo.
   3. Sollevare la pelle e rendere una prima incisione 5 mm per la regione addominale caudale con le forbici chirurgiche. Tagliare e rimuovere la pelle addominale per esporre completamente gli organi interni
   4. Tagliare vicino vagina per rimuovere l'intero utero.
   5. Tagliare tra i siti di impianto lungo il corno uterino. Ogni segmento o concepito dovrebbe avere un solo embrione dentro.
   6. Mantenere i segmenti uterine a 1x fosfato ghiacciata salina tamponata (PBS).
3. embrione dissezione
   1. Luogo ogni conceptus in un piatto a parte con PBS ghiacciato sotto uno stereoscopio.
   2. Rimuovere i tessuti uterini, placenta e poi membrane fetali in modo sequenziale utilizzando dissettore sottili.
   3. Trasferire l'embrione sezionato ad un tubo da 50 ml con 1x freddo ghiaccio PBS utilizzando una pipetta di trasferimento di grandi dimensioni. Evitare di raccogliere embrione direttamente con una pinza per ridurre al minimo i danni ai tessuti.
4. Fissazione
   1. Fissare gli embrioni sezionati a 10% soluzione neutra formalina tamponata a 4 ° C per più di 24 ore con almeno 10 volumi di campione di fissativo.
5. Pretrattamento
   1. Preparare la Soluzione Clearing: 4M urea, 10% glicerolo, 4% di sodio dodecilsolfato (SDS) in acqua bidistillata.
   2. Sostituire il fissativo con la soluzione Clearing.
   3. Ruotare delicatamente il campione su un rocker a temperatura ambiente per 1 - 2 settimane. Sostituire la soluzione compensazione una volta al secondo e al terzo giorno. Il campione diventa lentamente chiaro e traslucido.
   4. Sostituire la soluzione di compensazione con formalina al 10% e lasciare su una sedia a dondolo per 2 giorni.
6. Disidratazione
   1. Lavare i campioni pretrattati con 1x PBS 3 volte per 5 minuti ciascuno.
   2. Disidratare i campioni in una serie di etanolo ascendente a temperatura ambiente su una sedia a dondolo gentile. Per embrioni E15.5, utilizzare una serie ascendente di etanolo incluso il 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% e 100% etanolo, 2 hr ogni passo. Per embrioni più vecchi, il tempo di incubazione deve essere aumentata.
7. colorazione
   1. Preparare la colorazione Soluzione: aggiungere 0.1375 grammi di eosina Y Disodium Salt e 0,0275 grammi di arancio di acridina emi (cloruro di zinco) sale a 50 ml di etanolo al 100%. Mescolare per 2 ore. Filtro con una carta da filtro. Conservare a temperatura ambiente ed evitare la luce coprendo con un foglio di alluminio.
   2. Trasferire esemplare per la soluzione colorante per 1 ora.
   3. Sostituire con soluzione colorante fresco e macchia durante la notte.
8. Infiltrazione
   1. Preparare infiltrazione Soluzione: coniugare 100 ml di soluzione A di JB-4 kit di embedding, 1,25 g di catalizzatore C, 0,275 g di eosina Y Disodium Salt e 0,055 g di acridina arancio emi (cloruro di zinco) sale. Mescolare per mescolare (200 rpm) in un secchio di ghiaccio per 2 ore, e poi filtrare con la carta da filtro.
   2. Conservare la soluzione di infiltrazione a 4 ° C per evitare la luce coprendo con un foglio di alluminio.
   3. Trasferire gli embrioni per infiltrazione Soluzione: La colorazione Soluzione (1: 1), e incubare per almeno 3 ore su una sedia a dondolo a 4 ° C.
   4. Trasferire gli embrioni per infiltrazione Solution e incubare per 3 orer su un bilanciere in una camera fredda.
   5. Sostituire infiltrazione soluzione una volta al giorno, e lasciare in una stanza fredda su una sedia a dondolo dolce per altri tre giorni.

2. Embedding

1. Mantenere Soluzione B e l'infiltrazione soluzione su ghiaccio.
2. Fare Embedding Solution (01:25 di soluzione B e infiltrazione Solution) immediatamente prima di incorporamento.
3. Orientare il campione in uno stampo embedding, poi versare freddo Solution Incorporare nello stampo embedding delicatamente. Ri-orientare con uno spillo, se necessario.
4. Utilizzare un perno per esaminare se la soluzione Embedding è solidificato. Spingere il blocco del campione, e tagliare, se necessario.
5. Riorientare il blocco del campione usando lo stampo separata per ottenere un orientamento trasversale.
6. Mettere un titolare di blocco sulla parte superiore dello stampo embedding. Delicatamente versare Integrazione Soluzione nello stampo fino a quando lo stampo e il titolare del blocco sono sommersi da Incorporare Solution.
7. Conservare il campione in un contenitore secondario e lasciarein ghiaccio per 3 - 4 ore in una cappa aspirante.
8. Conservare i campioni solidificati in un 4 ° C.
9. Sbucciare via lo stampo embedding. Mettere il blocco con lo stereomicroscopio con illuminazione obliqua per ispezionare la posizione del campione nel blocco. Sulla faccia del blocco, le linee della griglia marchio in tutto il campione.
10. Tagliare il blocco per rimuovere quantità accesso di incorporare materiale utilizzando le linee della griglia indicati come riferimenti.

3. Acquisizione di immagini

1. Bloccare il blocco del campione al microtomo e ottenere una superficie di taglio fresco. Impostare lo spessore della sezione (ad esempio, e9.5-10.5, 1,5 micron; e11.5-12.5, 2,0 micron; e13.5-15.5, 2,5 micron; E16.5-anziani, 3 micron). Mantenere il campione / blocco alla posizione iniziale del microtomo.
2. Montare il stereo microscopio con zoom fronte orizzontalmente la superficie del blocco di campione.
3. Accendere il computer e il microscopio, e avviare il software di acquisizione delle immagini.
4. Visualizzare e mettere a fuoco l'ottica al blocco facciain modalità "live view" del software di imaging.
5. Allineate microscopio e microtomo se necessario in modo che il blocco faccia è al centro del mirino.
6. Regolare zoom in modo che l'intero blocco-faccia è nel mirino.
7. Selezionare verde filtro proteina fluorescente (GFP) (eccitazione 470 ± 20 nm, dicroiche 495 nm, emissione di 525 ± 25 nm) e riorientare, se necessario.
8. Misurare e impostare il tempo di esposizione manualmente (ad esempio, 80-400 mini sec).
9. Acquisire le immagini del blocco faccia dopo ogni taglio fresco e salvare automaticamente le immagini, se possibile.
10. Registra parametri importanti, tra cui la risoluzione, spessore della sezione e lo zoom.
11. Dopo aver terminato l'intero campione, l'esportazione e convertire tutti i file di immagine in formato JPEG, se necessario.
12. Invertire tutte le immagini originali che utilizzano un software di elaborazione delle immagini, e regolare la luminosità e il contrasto.
13. Salvare tutte le immagini elaborate in una cartella separata.

4. 3DVisualizzazione

1. Carica tutte le immagini elaborate da un software di visualizzazione 3D seguendo le istruzioni.
2. Risoluzione e spessore della sezione per convertire tutte le immagini a dati volumetrici (ad esempio, le dimensioni voxel) e salvare il file 3D.
3. Allineare tutte le immagini utilizzando la modalità automatica. Regolare le singole immagini manualmente, se necessario.
4. Salvare l'immagine allineata a un nuovo nome file.
5. Analizzare le caratteristiche morfometriche del campione utilizzando il software di visualizzazione 3D.

Risultati

Abbiamo riportato le immagini HREM di alta qualità di embrioni di topo tra E9.5 e E13.5 ^8. La qualità dell'immagine degli embrioni fine scena, tuttavia, è notevolmente compromessa a causa della penetrazione tissutale limitata del eosina colorante fluorescente. Per aumentare l'efficienza di colorazione, abbiamo testato diversi metodi di pretrattamento che sono compatibili all'imaging fluorescente ^11. In particolare, gli embrioni di topo E15.5 sono stat...

Discussione

Qui, vi presentiamo un protocollo modificato utilizzando attrezzature di laboratorio di routine per acquisire immagini HREM seriali che sono compatibili per la visualizzazione 3D rapida e analisi morfometrica di strutture complesse. Perché le immagini ad alta risoluzione sono presi direttamente dalla faccia blocco, invece di singole sezioni, le caratteristiche morfologiche pregiati sono conservati e rapidamente ricostruito digitalmente in un programma di visualizzazione 3D.

imaging 3D offre...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice	The Jackson Laboratory	C57BL6
Ethyl Alcohol	Pharmco-Aaper	111000200	200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade
Formalin	Sigma	HT501128-4L
Urea	Sigma	U5128	Clearing Solution
Glycerol	Fisher scientific	G33-4	Clearing Solution
Sodium Dodecyl Sulfate	Invitrogen	15525-017	Clearing Solution
Eosin Y Disodium Salt	Fisher scientific	BP241925	Infiltration Solution
Acridine Orange hemi (zinc chloride) salt	Sigma	A6014	Infiltration Solution
Whatman paper	GE	3030-153
JB-4 Embedding Kit - Solution A	Polysciences, Inc.	0226A-800	Infiltration Solution
JB-4 Embedding Kit - Solution B	Polysciences, Inc.	0226B-30	Embedding Solution
JB-4 Embedding Kit - Catalyst	Polysciences, Inc.	02618-12	Infiltration Solution
Embedding Molds	Polysciences, Inc.	23185-1	16 x 8 mm
Peel-A-Way Sharp Embedding Molds	Polysciences, Inc.	18986-1	22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm
JB-4 Plastic Block Holders	Polysciences, Inc.	15899
Disposable Graduated Transfer Pipes	VWR	414004-014
Petrl Dish	VWR	25384-088	Embryo dissection
Forceps Inox Tip	ROBOZ	RS-5015	Embryo dissection
Graefe Tissue Forcep	ROBOZ	RS-5153	Embryo dissection
Delicate Operating Scissor	ROBOZ	RS-6700	Embryo dissection
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tubes	Falcon	352059
50 ml Polypropylene Conical Tubes	Falcon	352098
Ice Bucket	Magic Touch Iceware International Corp.	R19-343
100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats	VWR	89106-766
330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats	VWR	89106-770
Sodium Chloride	MP Biomedicals	102892	PBS Solution
Potassium Chloride	Sigma	P0662	PBS Solution
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5405	PBS Solution
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S9390	PBS Solution
Digital Camera	Hamamatsu Photonics	C11440-10C
Microtome	Leica	RM2265
Illuminator	Carl Zeiss	HXP 200C
Fluorescence Stereo Zoom Microscope	Carl Zeiss	Axio Zoom.V16
Stereo Microscope	Olympus	SZX16
Fiber Optic Light Source	Leica	KL 1500 LCD
Disposable Microtome Blade	VWR	95057-832
Single Edge Dispenser	Personna	62-0330-0000
ZEN	Carl Zeiss	pro 2012
Photoshop	Adobe	CS6 v13.0
Amira 3D Software	Visage Imaging	5.4
Computer	Dell T7600, 2x900GB SAS hard drive and 64 GB DDR3 RDIMM memory
Rocking Platform Shakers	VWR	40000-304
Standard Hot Plate Stirrer	VWR	12365-382
Analytical Balance	Mettler Toledo	AB54-S