Preparazione e<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;utilizzo di una sonda Activity-based per<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Acid amidasi

Riepilogo

Qui, descriviamo la preparazione e l'uso di una sonda per attività (ARN14686, undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] carbammato) che consente la rilevazione e quantificazione del forma attiva dell'enzima proinfiammatorie N amidasica acido -acylethanolamine (NAAA), sia in vitro ed ex vivo.

Abstract

profiling proteine ​​Activity-based (ABPP) è un metodo per l'identificazione di un enzima di interesse in un proteoma complessa attraverso l'uso di una sonda chimica che bersaglia siti attivi dell'enzima. Un tag giornalista introdotto nella sonda permette di rilevare dell'enzima etichettati da in-gel fluorescenza scansione, proteine ​​blot, microscopia a fluorescenza o spettrometria cromatografia-massa liquida. Qui, descriviamo la preparazione e l'uso del ARN14686 composto, una sonda a base di attività di clic chimica (CC-ABP) che riconosce selettivamente l'enzima N amidasi acido -acylethanolamine (NAAA). NAAA è una idrolasi cisteina che promuove l'infiammazione disattivando endogeni agonisti del recettore-alfa proliferazione dei perossisomi attivato (PPAR), come palmitoiletanolamide (PEA) e oleoylethanolamide (OEA). NAAA viene sintetizzato come full-length inattiva proenzyme, che viene attivato dal autoproteolysis nel pH acido del lisosoma. studi di localizzazione have dimostrato che NAAA è prevalentemente espressa in macrofagi e altre cellule derivate da monociti, nonché in B-linfociti. Forniamo esempi di come ARN14686 può essere utilizzato per rilevare e quantificare NAAA attiva ex vivo nei tessuti di roditori da proteine macchia e microscopia a fluorescenza.

Introduzione

Comunemente utilizzati metodi per indagare i pattern di espressione, le interazioni e le funzioni delle proteine, comprese le piattaforme di spettrometria di cromatografia-massa liquida per l'analisi fucile ^1,2, lievito metodi doppio ibrido ^3,4, e in vitro, sono limitati nel senso che sono in grado di valutare l'attività delle proteine ​​nel loro stato nativo. Attività a base di proteine ​​profiling (ABPP) può essere utilizzato per colmare questa lacuna. In questo approccio, piccola molecola sonde in grado di legare covalentemente al sito attivo di un enzima di interesse vengono coniugati ad un gruppo giornalista che consente il rilevamento di destinazione. Utilizzando click chemistry (CC), il giornalista può essere integrato nella sonda o può essere introdotto dopo l'impegno di destinazione si è verificato ^5,6. Quest'ultimo metodo richiede l'impiego di sonde contenenti opportuni gruppi chimici, ad esempio un alchino terminale o azide, che può essere modificato con una serie di reagenti giornalista tramite reazioni bio-ortogonali such come Cu (I) -catalyzed Huisgen [3 + 2] cicloaddizione ^7-9 o Staudinger legatura ^10,11.

Recentemente, abbiamo divulgato la ARN14686 composti come il primo SOA per la in vitro e in vivo di rilevamento della idrolasi cisteina, NAAA ^12. NAAA catalizza la disattivazione idrolitica di FAE saturi e monoinsaturi, tra cui oleoylethanolamide (OEA) e palmitoiletanolamide (PEA), che sono agonisti endogeni del movimento anti-infiammatorio dei recettori nucleari PPAR-alfa ^13-15. NAAA è prevalentemente espressa in macrofagi e altre cellule derivate da monociti, nonché in linfociti B ^14,16, suggerendo un ruolo nella regolazione della risposta immunitaria innata. L'enzima viene sintetizzato nel reticolo endoplasmatico rugoso in forma inattiva e viene attivata in compartimenti acidi della cellula da un meccanismo autoproteolytic ^17. La scissione autoproteolytic genera un nuovo cisteina -Terminal N (C131 in topi e ratti, C126 nell'uomo), che è il nucleofilo responsabile FAE Idrolisi ^18,19. L'inibizione farmacologica dell'attività NAAA altera l'equilibrio di sintesi / degradazione FAE a favore di un aumento dei livelli cellulari di FAE ^16,20,21. Numerosi derivati β-lattone e β-lattamici hanno dimostrato di inibire l'attività NAAA con elevata potenza e selettività ^16,22-26. Questi inibitori agiscono attraverso S -acylation della cisteina catalitica ^16,27,28.

Il ARN14686 composto è stato progettato sulla base della struttura chimica del, inibitore β-lattamici NAAA serina-derivato sistemicamente attivo, ARN726 (4-cyclohexylbutyl- N - [(S) -2-oxoazetidin-3-il] carbammato) ^16. Il gruppo 4-butil-cicloesil di ARN726 è stato sostituito con una catena alifatica C9 saturo recanti un tag alchino terminale per la successiva coniugazione CC con un tag giornalista azide-cuscinetto. Abbiamo scelto di progettare un ABP in due fasi per minimally alterano la struttura del ponteggio originale, mantenendo così l'affinità della sonda per NAAA. Inoltre, evitando l'introduzione di tag ingombranti, tale sonda potrebbe essere più adatto per il trattamento in vivo di un ABP diretta. ARN14686 inibisce NAAA con potenza elevata (hNAAA IC ₅₀ = 6 nM, rNAAA IC ₅₀ = 13 nM) formando un addotto covalente con la cisteina catalitica dell'enzima ^12. Gli esperimenti in topi vivi hanno mostrato che la sonda è selettiva nel catturare NAAA espresso nei polmoni. Acido ceramidasi, un'altra amidasi cisteina che condivide 33-34% di identità con NAAA, è stato anche identificato come un obiettivo a bassa affinità utilizzando alte concentrazioni di sonda (10 micron in vitro, 10 mg / ml per via endovenosa, iv) ^12. Abbiamo usato anche ARN14686 per studiare la presenza di NAAA attivo nei tessuti infiammati di ratto in seguito a somministrazione di adiuvante completo di Freund (CFA) ^29.

Qui, descriviamo un protocollo per i il preparatisu di ARN14686 (Figura 1) e la sua applicazione alla ricerca di NAAA attivazione ex vivo. A titolo di esempio, si descrive una procedura sperimentale di visualizzare NAAA in zampe di ratto dopo la somministrazione CFA. In questo esperimento, le proteine ​​sono estratte dal tessuto zampa dopo l'iniezione iv della sonda, e proteoma ABP-marcato è sottoposto a cc con biotina-azide. campioni Biotinylated sono arricchiti con perline streptavidina, e vengono eseguite le macchie di proteine. In un'altra applicazione, descriviamo la localizzazione di NAAA attiva al microscopio a fluorescenza nei polmoni del mouse da topi trattati con sonda. In questo caso, il tessuto viene sezionata e sezioni sono sottoposti a CC in aggiunta rodamina. Uno schema di flusso di lavoro è illustrato nella figura 2.

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Protocollo

Attenzione: Tutte le reazioni di chimica devono essere eseguite in una cappa ventilata e con l'uso di un camice, guanti e occhiali protettivi. Le reazioni dovrebbero essere effettuate anche in un ambiente di azoto.

Dichiarazione etica: Le nostre procedure che coinvolgono gli animali vengono eseguite in conformità con la normativa italiana in materia di protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali o ad altri scientifici (DM 116192), e dei regolamenti della Comunità economica europea (GU L 358/1 del CE 1986/12/18 ).

NOTA: Sintesi di [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] acetato di ammonio è descritto ad rese grandi (50 g di N -Cbz-L-serina), ma può essere facilmente ridimensionati.

1. Sintesi

NOTA: Vedere la Figura 1 per lo schema di reazione di sintesi.

1. Preparazione di 2-piridil undec-10-inil carbonato e undec-10-inil-2 oxopyridine 1-carbossilato
   1. In un 50 ml pallone da sciogliere 350 mg di undec-10-yn-1-olo in 3,5 ml di diclorometano anidro.
   2. Alla soluzione in 1.1.1, aggiungere 25 mg di 4-dimetilamminopiridina (DMAP) e 530 mg di 2-dipyridylcarbonate (DPC). Mescolare la miscela a temperatura ambiente (RT) per 16 ore.
   3. Aggiungere 20 ml di diclorometano.
   4. Trasferire il composto in un imbuto separatore. Aggiungere 15 ml di acqua, si agita, e permettere ai due fasi per separare.
   5. Aprire il rubinetto, raccogliere la fase organica (in basso), e quindi chiudere il rubinetto. Aggiungere 15 ml di una soluzione satura di NaHCO _3. Agitare l'imbuto separatore e lasciare che le due fasi distinte. Ripetere questa operazione altre due volte.
   6. Essiccare la fase organica con Na ₂ SO _4, filtrata attraverso del cotone in un pallone a fondo tondo (tara prima), ed evaporare a secchezza sotto pressione ridotta (evaporatore rotante).
   7. Pesare il matraccio ed ottenere 600 mg di olio che è una miscela di 2-piridil undec-10-inil carbonato e undec-10-inil-2 oxopyridine 1-carbossilato in un rapporto di 1,7: 1.
      ¹ H NMR (400 MHz, DMSO d ₆₎ componente principale δ = 8,39 (dd, J = 5,0, 2,0, 1H), 7,98 (td, J = 7.9, 2.0, 1H), 7,40 (ddd, J = 7,2, 4.9, 0.9, 1H), 7,30 (d, J = 8.2, 1H), 4,22 (t, J = 6.6, 2H), 2,73 (t, J = 2.4, 1H), 2.18 - 2.11 (m, 2H), 1.76 - 1,62 (m, 2H) 1.50 - 1.23 (m, 12H).
      ¹ H NMR (400 MHz, DMSO d ₆₎ componente minore δ = 7,74 (dd, J = 7.2, 1.9, 1H), 7,47 (dd, J = 6.7, 2.3, 1H), 6,44 (d, J = 9,4, 1H), 6,30 - 6.25 (m, 1H), 4,35 (t, J = 6.5, 2H), 2,72 (t, J = 2.4, 1H), 2.18 - 2.11 (m, 2H), 1.77 - 1.60 (m, 2H ), 1,52-1,20 (m, 12H).
   8. Utilizzare l'olio senza alcuna ulteriore separazione o purificazione.
2. Preparazione di [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] ammonio acetato
   1. Preparazione di benzil N - [(S) -1- (idrossimetil) -2 - [(4-metossifenil) ammino] -2-oxoethil] carbammato.
      1. In un pallone a 4-L sciogliere 141,5 g di p -anisidine in 1,5 L di tetraidrofurano e 0,5 L di diclorometano.
      2. Raffreddare la soluzione a 0 ° C in un bagno di ghiaccio.
      3. Aggiungere 50,0 g di N -Cbz-L-Serina e 43,9 g di N - (3-dimetilamminopropil) - N 'cloridrato -ethylcarbodiimide.
      4. Mescolare la miscela con una barra magnetica a 0 ° C per 30 min.
      5. Rimuovere la soluzione dal bagno di ghiaccio e mescolate con una barra magnetica a temperatura ambiente per 16 ore.
      6. Evaporare i solventi a pressione ridotta (evaporatore rotante).
      7. Aggiungere 400 ml di 1: 1 acetato di cicloesano / etile, mescolate con una spatola, e decantare.
      8. Ripetere il punto 1.2.1.7 altre due volte.
      9. Sciogliere il residuo gommoso in 500 ml di acetato di etile e lavata con 400 ml di soluzione 0,1 M di HCl (10 volte), con 400 ml di satura di NaHCO ₃ solution (2 volte), e con 400 ml di salamoia.
      10. Essiccare lo strato organico conNa ₂ SO _4, filtrare la soluzione attraverso il cotone in un pallone a fondo tondo (tara prima), ed evaporare a secchezza a pressione ridotta (evaporatore rotante).
      11. Pesare il matraccio ed ottenere 61,4 g di un solido bianco.
          ¹ H NMR (400 MHz, DMSO d ₆₎ d = 9,86 (bs, 1H), 7,52 (d, 2H, J = 9,0 Hz), 7,42-7,25 (m, 6H), 6,91-6,85 (m, 2H) , 5,06 (d, 1H, J = 12,9 Hz), 5,02 (d, 1H, J = 12,9 Hz), 4,98 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 4,24-4,15 (m, 1H), 3,72 (s, 3H), 3,70-3,57 (m, 2H).
   2. Preparazione di benzil N - [(S) -1- (4-metossifenil) -2-oxo-azetidin-3-il] carbammato.
      1. Sciogliere 58.6 g di N - [(S) -1- (idrossimetil) -2 - [(4-metossifenil) ammino] -2-oxo-etil] carbammato in 1,6 L di N, N -dimethylformamide.
      2. Raffreddare la soluzione a 0 ° C con un bagno di ghiaccio.
      3. Aggiungere 50,6 g di 1,1'-sulfonyldiimidazole e mescolare con una barra magnetica per 30 min.
      4. Raffreddare la soluzionea -20 ° C con un / NaCl bagno di ghiaccio e aggiungere 10,2 g di sodio idruro (60% in olio minerale) porzione saggio.
      5. Mescolare la miscela a -20 ° C per 1 ora, quindi spegnere con 2 ml di metanolo e 1 L di acqua.
      6. Vacuum filtrare il precipitato, lavare con 200 ml di acqua, e secco sotto vuoto.
      7. Ottenere 42,2 g di un solido bianco.
         ¹ H NMR (400 MHz, DMSO d ₆₎ δ = 8,08 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 7,42-7,28 (m, 5H), 7,30 (d, 2H, J = 8,9 Hz), 6,95 (d , 2H, J = 8,9 Hz), 5,06 (s, 2H), 4,86 ​​(ddd, 1H, J = 8,5, 5,6, 2,6 Hz), 3,90 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 3,73 (s, 3H) , 3,55 (dd, 1H, J = 5.6, 2.6 Hz).
   3. Preparazione di benzil N - [(S) -2-oxoazetidin-3-il] carbammato.
      1. Sospendere 9,0 g di benzil N - [(S) -1- (4-metossifenil) -2-oxoazetidin-3-il] carbammato in 500 ml di acetonitrile e 400 ml di acqua.
      2. Raffreddare la soluzione a 0 ° C in un bagno di ghiaccio.
      3. Aggiungere 45,4 g di ceric nitrato di ammonio porzione saggio oltre 45 min e mescolare con una barra magnetica a 0 ° C per 15 min.
      4. Aggiungere 500 ml di satura di NaHCO ₃ soluzione cautela e quindi aggiungere 500 ml di acetato di etile.
      5. Filtrare il precipitato e lavare con 200 ml di acetato di etile.
      6. Separare la soluzione bifasica e lavare lo strato acquoso con 200 ml di acetato di etile (3 volte).
      7. Essiccare la fase organica con Na ₂ SO _4, aggiungere 5 g di carbone attivo, filtrare attraverso un tampone di silice di diatomee, ed evaporare a secchezza sotto pressione ridotta (evaporatore rotante).
      8. Aggiungere etere etilico e mescolare con una spatola.
      9. Filtrare il solido ed ottenere 4,85 g di un solido biancastro.
         ¹ H NMR (400 MHz, DMSO d ₆₎ δ = 7,97 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 7,94 (bs, 1H), 7.42- 7.30 (m, 5H), 5,05 (s, 2H), 4,67 (ddd, 1H, J = 8,7, 5,4, 2,7 Hz), 3,40 (t, 1H, J = 5,4 Hz,), 3,09 (dd, 1H, J = 5.4, 2.7 Hz).
   4. Preparazione di [(S) -2-oxoazetidin-3-il] -ammonium Acetate.
      1. Sciogliere 0,93 ml di acido acetico in 245 ml di acetato di etile. Segnare questo come "trapping soluzione".
      2. Sciogliere 3,28 g di benzil N - [(R) -2-oxoazetidin-3-il] carbammato in 298 ml di etanolo.
      3. Aggiungere 14,1 ml di cicloesadiene e 3,27 g di palladio al 10% su carbone.
      4. Mescolare la sospensione a temperatura ambiente per 12 ore, e poi filtrare attraverso un breve blocco di terra di diatomee. Versare il liquido eluizione direttamente nella soluzione di cattura.
      5. Evapora il solvente a pressione ridotta (evaporatore rotante), mantenendo la temperatura inferiore a 35 ° C.
      6. Triturare il solido ottenuto con tetraidrofurano ed ottenere 1,72 g di un solido bianco.
         ¹ H NMR (400 MHz, DMSO d ₆₎ d = 7,68 (bs, 1H), 3,99 (ddd, 1H, J = 5.2, 2.4, 1.2 Hz), 3,32 (t, 1H, J = 5.2 Hz), 2.79 (dd, 1H, J = 5.2, 2.4 Hz), 1,90 (s, 3H).
3. Preparazione di undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] carbammato
   1. In 10 ml pallone a fondo tondo, sciogliere 60 mg di [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] acetato di ammonio in 2 ml di diclorometano anidro.
   2. Raffreddare la soluzione a 0 ° C in un bagno di ghiaccio e aggiungere 81 ml di N, N -diisopropylethylamine goccia a goccia.
   3. Sciogliere 350 mg della miscela grezza contenente undec-10-inil-2 oxopyridine 1-carbossilato in 2 ml di diclorometano anidro, aggiungere alla soluzione e agitare a temperatura ambiente per 15 h. Si evapora il solvente a secchezza a pressione ridotta (evaporatore rotante).
   4. Purificare mediante cromatografia su colonna (gel di silice) utilizzando una apparecchiatura cromatografica automatizzato:
      1. Assorbire il campione su gel di silice, equilibrare la colonna con cicloesano, e caricare il campione nella cartuccia.
      2. Eluire con cicloesano / etile acetato 100: 0 a 0: 100 e raccogliere picchi sulle provette.
      3. Evaporare il solvente delle frazioni corrispondenti al composto a secchezza a pressione ridotta (evaporatore rotante) ed ottenere 40 mg di un solido bianco.

2. Preparazione dei reagenti CC

1. Preparazione di 5 mm della soluzione di molecole Tag-azide
   1. Disciogliere 1,5 mg di azide-PEG3-Fluor 545 in 0,5 ml di dimetilsolfossido (DMSO). Preparare delle aliquote di 0,5 ml provette da microcentrifuga e conservare a -20 ° C.
   2. Disciogliere 1,1 mg di azide-PEG3-biotina in 0,5 ml di DMSO. Preparare delle aliquote di 0,5 ml provette da microcentrifuga e conservare a -20 ° C.
2. Preparazione di 50 mm di soluzione di Tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP)
   1. Sciogliere 14.3 mg di TCEP in 1 ml di acqua, e renderlo fresco ogni volta.
3. Preparazione di 50 mM soluzione di CuSO ₄ · 5H ₂ O
   1. In una fiala di vetro, sciogliere 12.48 Mg di CuSO ₄ · 5H ₂ O in 1 ml di acqua. Conservare a temperatura ambiente per un massimo di un mese.
4. Preparazione di 83,5 mM Soluzione stock di Tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] ammina (TBTA)
   1. In una fiala di vetro, sciogliere 8,85 mg di TBTA in 200 ml di DMSO. Conservare a temperatura ambiente per un massimo di un mese.
5. Preparazione di 1,7 mm soluzione di lavoro di TBTA (immediatamente prima dell'uso)
   1. Aggiungere 20 ml di 83,5 mM TBTA in una fiala di vetro e diluire con 180 ml di DMSO.
   2. Aggiungere 800 ml di terz -Butanol e vortice.

3. NAAA analisi di espressione in Paw tessuto di ratti trattati con CFA

NOTA: L'uso di sesso maschile ratti Sprague-Dawley, del peso di 175-200 g, ed eseguire tutte le procedure in conformità con le linee guida per l'uso etico degli animali. ratti Casa in gabbie ventilati su un ciclo di luce di 12 ore / scuro e dare loro il libero accesso al cibo e all'acqua. Per il protocollo di CFUn trattamento, vedere l'articolo pubblicato da Bonezzi et al. ²⁹ usare gli animali 7 giorni dopo la somministrazione CFA.

1. La somministrazione endovenosa di ARN14686
   1. Sciogliere ARN14686 nel veicolo (15% PEG e soluzione salina Tween 15%). Calcolare la concentrazione della soluzione in base al peso di ratto (dose di 3 mg / kg, volume di iniezione 5 ml / kg).
   2. Procedere con iv iniezioni in tre ingenuo e tre ratti CFA-trattati. Mettere ogni ratto in un dispositivo di sicurezza in plastica appropriata. Quindi, posizionare la coda di ratto in acqua calda per 2-4 minuti per consentire la vasodilatazione, e iniettare il composto IV attraverso la vena della coda.
   3. Iniettare tre ratti (ingenuo e CFA-trattati) IV con un solo veicolo.
2. Paw Collection e la dissezione
   1. Sacrificare i topi da CO ₂ inalazione 4 ore dopo la sonda o il veicolo amministrazione e raccogliere le loro zampe tagliando loro 0,5 cm sopra il ginocchio con un bisturi.
   2. Rimuovere con cura la pelle da dissezione forbice-assistita e sezionare i tessuti molli dal loro raschiando dalle ossa. Eliminare le ossa e raccogliere i tessuti molli delle zampe. campioni congelare Snap in azoto liquido e conservare a -80 ° C.
3. Paw omogeneizzazione e lisosomiale preparazione proteina
   NOTA: Evitare l'uso di detergenti e buffer contenente ammina, in quanto possono inibire la reazione CC.
   1. Combinare tessuto zampa da 3 ratti (ottenuti come descritto nella sezione 3.2.1) e omogeneizzare loro in 4 ml di 320 mm di saccarosio in PBS (PBS, pH 7,4) e un cocktail inibitore della proteasi (vedi Materiale / Reattivo tabella); utilizzare uno strumento di dispersione ad alte prestazioni (vedi Materiale / Reattivo Tabella).
   2. Centrifugare l'omogeneizzato di tessuto per 20 min a 1000 xga 4 ° C; salvare il surnatante.
   3. Aggiungere 2 ml di 320 mm di saccarosio in PBS e il cocktail inibitore della proteasi per il pellet e tessutiomogeneizzare nuovamente.
   4. Centrifugare per 20 min a 1000 xga 4 ° C e aggiungere il surnatante a quello dal punto 3.3.2.
   5. Centrifugare il surnatante raccolti per 30 minuti a 12.000 xg a 4 ° C.
   6. Pesare il pellet e risospendere in due volumi di PBS (ad esempio, 200 l per ogni 100 mg di pellet). Trasferire in una provetta da 1,5 ml di raccolta e congelare a -80 ° C per 1 ora.
   7. Scongelare i campioni e congelare ancora per 1 ora a -80 ° C.
   8. Ripetere il ciclo di congelamento / scongelamento altre due volte.
      NOTA: Questa fase ha lo scopo di solubilizzare la proteina. Congelare durante la notte se necessario.
   9. Centrifuga per 1 ora a 100.000 xg a 4 ° C. Raccogliere il surnatante, che contiene proteine ​​lisosomiali solubili, e scartare il pellet. Conservare a -80 ° C o procedere immediatamente con la quantificazione delle proteine.
   10. Quantificare il contenuto proteico usando un test di proteine BCA ³⁰ kit commerciale (vedi Materiale / reagente Tabella ), seguendo le istruzioni del produttore.
   11. Conservare i campioni a -80 ° C fino al momento dell'uso.
4. CC con azide-PEG3-biotina
   NOTA: Il protocollo di CC e di arricchimento perline streptavidina (passi 3,4-3,6) sono leggermente modificato dal protocollo pubblicato da Speers e Cravatt ^31.
   1. Preparare 500 microlitri (1 mg / ml, in PBS) di proteine ​​lisosomiali da ratti probe- e trattati con veicolo (ratti naive e CFA-trattati).
   2. campioni Preclear con 40 ml di una sospensione al 50% di agarosio streptavidina (lavare tre volte con 1 ml di PBS prima dell'uso) per 1 ora a 4 ° C. Centrifugare per 4 min a 1000 xga 4 ° C e prendere il surnatante.
   3. Aggiungere 11,3 ml di ± 5 mm magazzino di azide-PEG3-biotina e vortice.
   4. Aggiungere 11,3 ml di 50 mM magazzino di preparati TCEP e vortice.
   5. Premix 34 ml di una soluzione di lavoro preparata al momento di 1,7 mm TBTA con 11,3 ml di 50 mm CuSO ₄ · 5H ₂ O stock.
   6. Aggiungere 45,3 ml di una soluzione premiscelata TBTA / CuSO ₄ · 5H ₂ O e vortex.
   7. Incubare la reazione a 25 ° C per 2 ore (un tempo di incubazione più lunghi non influenzino la reazione). Osservare la precipitazione delle proteine ​​in questa fase. Mescolare dopo la prima ora di incubazione.
5. La rimozione dei reagenti CC eccesso
   1. Centrifugare i campioni per 4 min a 6.500 xg a 4 ° C e rimuovere il surnatante.
   2. Aggiungere 750 ml di metanolo freddo e risospendere mediante ultrasuoni (5 sec con un sonicatore sonda).
   3. Centrifugare i campioni per 4 min a 6.500 xg a 4 ° C e rimuovere il supernatante usando una siringa con ago.
   4. Ripetere il punto 3.5.2 due volte (sonicazione non è richiesta).
   5. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 325 ml di sodio dodecil solfato (SDS) 2,5% in PBS al pellet e sonicare 3x proteine ​​per 5 sec.
   6. Riscaldare i campioni per 5 min a 65 ° C e un sonicareguadagno.
   7. Centrifugare per 5 min a 6500 xg a temperatura ambiente e salvare il surnatante.
   8. Aggiungere 1,4 ml di PBS per diluire la concentrazione di SDS allo 0,5%. Conservare a -20 ° C o continuare con l'arricchimento streptavidina.
6. streptavidina arricchimento
   1. Con PBS, portare il volume dei campioni ottenuti nel passaggio 3.5.8 a 4,2 ml. Aggiungere 40 ml di una sospensione al 50% di agarosio streptavidina utilizzando una punta cut-end (lavare tre volte con 1 ml di PBS prima dell'uso).
   2. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente con rotazione e centrifugare per 2 min a 1400 x g.
   3. Rimuovere il surnatante senza seccare le perline pellet e utilizzare surnatante residuo per trasferire le perle di un 1 ml girare colonna (vedi Materiale / Reattivo Tabella).
   4. Lavare per gravità con 3x 1 ml di 1% SDS (in PBS), 3x 1 ml di 6 M urea (in PBS), e 4x 1 ml di PBS.
   5. Uso 2x 500 microlitri di PBS per trasferire le perline in una provetta da 1,5 ml e centrifugare per 2 min a 1400 xga RT. Aspirare delicatamente il surnatante con una siringa e l'ago.
   6. Eluire proteine resina legata aggiungendo 25 ml di tampone di eluizione (6 M urea, 2 M tiourea, 2% SDS, e 6 mM biotina, tutti in PBS) per 15 minuti a RT seguita da 15 minuti a 95 ° C ^32.
7. Proteine Blot
   1. Aggiungere 5 ml di 6x Laemmli tampone (9 ml: 0,5 ml di 1 M Tris-HCl pH 6,8, 5 ml di 20% SDS, 5 mg blu di bromofenolo, 3 ml di glicerolo, e H ₂ O fino a 9 ml) e aggiungere 5% β-mercaptoetanolo immediatamente prima dell'uso. Brevemente centrifugare i campioni a 2.000 xg per agglomerare le resine e di carico 25 microlitri del supernatante ottenuto in un gel di poliacrilamide 4-12%.
   2. Eseguire elettroforesi su gel e trasferimento proteina sulla membrana assorbente secondo le istruzioni ³³ del produttore.
   3. Saturare la membrana assorbente per 1 ora con 10 ml di un tampone di bloccaggio (vedi Materiale / reagenti Table) contenente 0,1% Tween-20.Evitare l'uso di latte, come si può aumentare il fondo.
   4. Lavare la membrana con 10 ml di 0,05% Tween-20 in PBS e aggiungere 10 ml di streptavidina fluorescente (vedi Materiale / Reagente Table) sciolto in 10 ml di tampone di bloccaggio più 0,1% Tween-20 per 1 ora a RT.
   5. Lavare 4 volte con 0,05% Tween-20 in PBS ed una volta con PBS solo (10 min ciascuna).
   6. Utilizzare uno scanner di immagini (vedi Materiale / Reattivo Tabella). Accendere lo strumento e il computer collegato. Attendere fino al momento.
   7. Avviare il programma di acquisizione e seleziona la modalità di fluorescenza. Selezionare l'area della membrana e scegliere la cartella di destinazione per i file salvati.
   8. Impostare i seguenti parametri di acquisizione: 680 nm di lunghezza di eccitazione, filtro BPFR700, 1000 V tubo fotomoltiplicatore (PMT) Valore (canale 2), e 25 micron dimensione del pixel. Acquisire l'immagine.

4. La localizzazione dei cataliticamente attivo NAAA nel topo polmoni fluorescenza Microscopia

NOTA: Utilizzare maschio topi da 8 a 10 settimane di età e di eseguire tutte le procedure in conformità con le linee guida per l'uso etico degli animali. Mice House in gabbie ventilati su un ciclo di 12 ore luce / buio e dare loro il libero accesso al cibo e all'acqua.

1. La somministrazione endovenosa di ARN14686 nei topi
   1. Sciogliere ARN14686 in veicolo: 15% PEG e il 15% di Tween-20 soluzione salina. Calcolare la concentrazione della soluzione in base al peso del mouse (dose di 3 mg / kg, volume di iniezione 5 ml / kg).
   2. Procedere con l'iniezione endovenosa di 3 topi. Mettere ogni mouse in un dispositivo di sicurezza in plastica appropriata. Poi, posizionare il coda di topo in acqua calda per 2-4 minuti per consentire la vasodilatazione e iniettare il composto IV attraverso la vena della coda.
   3. Iniettare 3 iv topi con unico veicolo.
2. Lung Raccolta e Slice preparazione
   Attenzione: maneggiare con cura paraformaldeide in una cappa aspirante, e indossare guanti!
   1. Anestetizzare topi con chloidrato ral (400 mg / kg). Confermare l'anestesia con un pizzico punta. Eseguire un perfusione transcardial come segue:
      1. Superficialmente tagliare la pelle ventrale con le forbici ed esporre le superfici della membrana toraciche e peritoneali.
      2. Superficialmente tagliare la membrana peritoneale con le forbici, appena sotto il processo xifoideo, ed esporre il diaframma e gli organi viscerali. Fare attenzione a non lacerare alcuna vascolarizzazione significativo.
      3. Aprire la cavità toracica tagliando il diaframma da una parte laterale all'altra.
      4. Inserire l'ago 25 G collegato alla pompa a siringa automatizzato ed infondere 20 ml di soluzione salina allo 0,9% seguiti da 60 ml di 4% PFA in tampone fosfato (0,1 M, pH 7,4).
   2. Una volta che la perfusione è completo, estrarre il cuore con pinze e con attenzione sezionare fuori. Afferrare la trachea con una pinza e tagliare completamente attraverso di essa con le forbici. tirare delicatamente la trachea verso l'alto e rimuovere i polmoni dalla gabbia toracica. Sezionare il tessuto diseparare il polmone destro da sinistra.
   3. Postfix il tessuto in paraformaldeide al 4% per 1 ora, congelare i campioni a freddo 2-metilbutano, e conservare a -80 ° C.
   4. Raccogliere 40 sezioni micron utilizzando un criostato, montarle immediatamente su vetrini (uno ogni cinque), ed elaborarli per immunoistochimica come descritto di seguito.
3. Tessuto Fette Permeabilizzazione e blocco
   1. Lavare con PBS (2x per 5 min) e permeabilize con 0,1% Triton X-100 PBS per 15 minuti a RT.
   2. Lavare con PBS (2x per 5 min) e bloccare con 3% di albumina di siero bovino (BSA) in PBS per 30 minuti a RT.
   3. Lavare con PBS (2x per 5 min) e procedere con CC.
4. CC con azide-PEG3-Fluor 545 su fette di tessuto
   1. Preparare una soluzione mescolando i reagenti CC preparate come descritto nella sezione 2. Per 1 ml di soluzione, aggiungere: 2 ml di azide-PEG3-Fluor 545 (5 mm magazzino), 20 ml di TCEP (preparata al momento 50 mM stock), 58,8 ml di TBTA (preparati al momento 1,7 soluzione di lavoro mm), 20 l di CuSO ₄ · 5H ₂ O (50 mm magazzino), e 900 ml di PBS.
   2. Aggiungere circa 400 ml di mix CC per le fette di tessuto, che sono stati preparati in base al paragrafo 4.2. Fare attenzione che il volume prescelto di mix CC è sufficiente a coprire le fette. Incubare per 1 ora a RT al riparo dalla luce.
   3. Lavare con PBS (1x per 5 min), metanolo freddo (1x per 5 min), una soluzione di 1% Tween-20 e 0,5 mM EDTA in PBS (3x per 2 min), e PBS (1x per 5 min).
   4. Aria secca, aggiungere una goccia di antifade di montaggio con DAPI (vedi Materiale / Reattivo Table) e chiudere con vetrini (evitando la formazione di bolle), e sigillare con smalto. Conservare a 4 ° C fino all'analisi.
5. Acquisizione dell'immagine
   1. Utilizzare un microscopio confocale dotato di 546 nm e 450 nm laser di eccitazione (vedi Materiale / Reattivo Table) a seguitoil manuale d'uso.
   2. Selezionare una lente obiettivo 60X con NA = 1,40, facendo in modo di visualizzare in anteprima la diapositiva attraverso gli oculari e di concentrarsi su una zona di interesse.
   3. Determinare i parametri di acquisizione in funzione delle caratteristiche del campione e attrezzature.

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Risultati

ARN14686 è stato progettato sulla base del patibolo dell'inibitore ARN726 NAAA. Il gruppo 4-butil-cicloesil di ARN726 stato sostituito con una catena alifatica C9 saturo recanti un tag alchino terminale (Figura 1). Il tag alkyne stato introdotto per permettere l'uso di una procedura di etichettatura in due fasi per aggiungere un fluoroforo o una molecola di biotina via CC. Questa caratteristica rende ARN14686 uno strumento molto versatile per sondare NAAA in...

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Discussione

L'attività enzimatica è finemente regolata a diversi livelli, tra cui l'RNA di trascrizione, la sintesi proteica, traslocazione di proteine, modificazione post-traslazionale, e l'interazione proteina-proteina. Spesso, l'espressione dell'enzima da solo non tiene conto per la sua attività. ABPP stato sviluppato per studiare l'attività delle proteine ​​nel loro stato nativo. Sono necessarie due funzioni: una sonda chimica che si lega covalentemente al sito attivo di un enzima di interesse e ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,1’-sulfonyldiimidazole	Sigma Aldrich	367818	Harmful
2-dipyridylcarbonate	Fluorochem	11331	Harmful
2-Methylbutan	Sigma Aldrich	M32631	Flamable, toxic,hazardous to the aquatic environment
4-(Dimethylamino)pyridine	Sigma Aldrich	107700	Toxic
Acetic acid	Sigma Aldrich	695092	Flammable, Corrosive
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998	Flammable, Toxic
Activated charcoal	Sigma Aldrich	161551
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A9434	Harmful
Azide-PEG3-Biotin	Jena Biosciences	CLK-AZ104P4
Azide-PEG3-Fluor 545	Jena Biosciences	CLK-AZ109
BCA protein assay kit	Thermo Fisher Scientific	23227
Bio-spin columns	Biorad	732-6204
Biotin	Sigma Aldrich	B4501
Blocking buffer	Li-Cor Biosciences	927-40000
β-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250	Higly toxic
Bovin serum albumine (BSA)	Sigma Aldrich	A7030
Bromophenol blue	Sigma Aldrich	B0126
Bruker Avance III 400	Bruker
Celite	Sigma Aldrich	419931	Health hazard
Ceric ammonium nitrate	Sigma Aldrich	22249	Oxidizing, Harmful
Chloral hydrate	Sigma Aldrich	C8383	Higly toxic
CuSO4.5H2O	Sigma Aldrich	209198	Toxic
Cyclohexadiene	Sigma Aldrich	125415	Flammable, Health hazard
Cyclohexane	Sigma Aldrich	34855	Flammable, Harmful, Health hazard, Environmental hazard
Dichloromethane	Sigma Aldrich	34856	Harmful, Health hazard
Diethyl ether	Sigma Aldrich	296082	Flammable, Harmful
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Acros Organics	348441000
Dimethyl sulfoxide d6 (DMSO-d6)	Sigma Aldrich	175943
Ethanol	Sigma Aldrich	2860	Flammable, Harmful
Ethyl acetate	Sigma Aldrich	34858	Flammable, Harmful
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Irdye 680-LT Streptavidin	Li-Cor Biosciences	925-68031
IRDye680-LT Streptavidin	Licor	925-68031	Briefly centrifuge before use to precipitate protein complexes
Methanol	Sigma Aldrich	34966	Highly toxic
Methanol	Sigma Aldrich	34860	Flammable, Toxic, Health hazard
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma Aldrich	E7750	Harmful, Corrosive
N,N-diisopropylethylamine	Sigma Aldrich	D125806	Flammable, Corrosive, Toxic
N,N-dimethylformamide	Sigma Aldrich	227056	Flammable, Harmful, Health hazard
N-Cbz-L-Serine	Fluorochem	M03053	Harmful
Nikon A1 confocal microscopy	Nikon		Read the user manual
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel	Thermo Fisher Scientific	NP0335BOX
Palladium on carbon	Sigma Aldrich	330108
p-anisidine	Sigma Aldrich	A88255	Toxic, Health hazard, Environmental hazard
Paraformaldehyde	sigma Aldrich	441244	Toxic, respiratory harmful, corrosive, falmable
Poly(ethylene glycol)	Sigma Aldrich	P3265
ProLong Gold antifade mountant with DAPI	Thermo Fisher Scientific	P36931	Avoid bubbles formation
Protease inhibitor cocktail	Sigma Aldrich	P8340
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L3771	Toxic, corrosive, falmmable
Sodium hydride	Sigma Aldrich	452912	Flammable
Sodium sulfate	Sigma Aldrich	239313
Starion FLA-9000 immage scanner	FUJIFILM		Read  the user manual
Streptavidin agarose	Thermo Fisher Scientific	20349
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
Tert-butanol	Sigma Aldrich	360538	Toxic, flammable
Tetrahydrofuran	Sigma Aldrich	186562	Flammable, Harmful, Health hazard
Thiourea	Acros Organics	424542500	Toxic, warm at 50 °C to dissolve
Tris	Sigma Aldrich	RDD008
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Sigma Aldrich	C4706
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)	Sigma Aldrich	678937
Triton-x100	Sigma Aldrich	X100	Toxic
Tween-20	Sigma Aldrich	P9416
Tween-80	Sigma Aldrich	P1754
Ultra turrax IKA T18 basic tissue homogenizer	IKA
Undec-10-yn-1-ol	Fluorochem	13739	Harmful
Urea	Sigma Aldrich	U5378	Toxic, warm at 50 °C to dissolve