Visualizzazione Frequenza Stromule con microscopia a fluorescenza

Riepilogo

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Abstract

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Introduzione

Chloroplasts are dynamic organelles in plant cells responsible for photosynthesis and a host of other metabolic processes. Signaling pathways from the chloroplast also exert significant influence on plant physiology and development, coordinating plant responses to environmental stress, pathogens, and even leaf shape^1-6. Recently, biologists have gained interest in a poorly understood aspect of chloroplast structure: stromules, very thin stroma-filled tubules that extend from the surface of the chloroplast⁷.

The biological functions of stromules remain unknown, although stromule frequency is known to vary in response to environmental stimuli^7-9, and stromules may be capable of transmitting signaling molecules between organelles⁶. All types of plastids (not only the green, photosynthetic chloroplasts, but also clear leucoplasts, starch-filled amyloplasts, and pigmented chromoplasts, to name a few types of plastids) make stromules, and stromules are found in all land plant species that have been examined to date. Stromules can extend and retract dynamically, appearing or disappearing within seconds, or they can remain relatively stationary for long times. One of the major hurdles facing stromule biologists is that stromules are often studied using dramatically different methods, tissues, and species, making comparisons across the stromule biology literature difficult. Going forward, standard practices and thorough descriptions of the experimental systems used to study stromules will be critical to discovering the function of these ubiquitous features of chloroplast morphology.

Here we describe methods for visualizing stromule formation in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana leaves. In the mesophyll, chloroplasts are densely packed into large, three-dimensional cells, which makes it difficult to accurately and rapidly visualize stromules by confocal microscopy. By contrast, epidermal cells are relatively flat, contain fewer chloroplasts, and are at the surface of the leaf, allowing for easy and rapid visualization of stromules. N. benthamiana is an ideal model system for these experiments because, unlike many plant species, all cells in the epidermis of N. benthamiana make chloroplasts¹⁰. In the epidermis of most plants, including Arabidopsis thaliana, only the stomatal guard cells have chloroplasts, while other epidermal cells have "leucoplasts", plastids that are clear, relatively amorphous, and nonphotosynthetic^9,11,12. Thus, whereas a single field of view of an A. thaliana epidermis might show only a handful of chloroplasts in a pair of guard cells, a field of view of an N. benthamiana epidermis will include dozens or even hundreds of chloroplasts. All of the methods described here, however, can be modified to investigate other questions in stromule biology; for example, we have used the same approach to study leucoplast stromules of A. thaliana⁹.

Protocollo

NOTA: per questo protocollo, si sono concentrati sulla analizzando frequenza stromule nell'epidermide di N. benthamiana lascia. Diverse linee transgeniche stabili sono stati generati che può essere utilizzato per questo scopo, tra cui 35S _PRO: FNRtp: EGFP ¹³ e NRIP1: Cerulean ^6. Entrambe queste linee mostrano robusta espressione di fluorofori nello stroma dei cloroplasti delle foglie cresciute in un'ampia gamma di condizioni. In alternativa, fluorofori cloroplasti mirati possono essere transitoriamente espressi in N. benthamiana utilizzando Agrobacterium trasformazioni ^13. Questo è meno ideale che le linee transgeniche, dal momento che le infiltrazioni tumefaciens inducono alcune risposte di difesa basali in N. benthamiana e le interazioni con Agrobacterium possono alterare la frequenza stromule nella foglia ^14, potenzialmente complicando l'interpretazione dei risultati. Infine, di visualizzare formazione stromule in vitro,cloroplasti possono essere estratti da tutte le specie vegetali, utilizzando sia fluorofori geneticamente codificati o un colorante fluorescente, come descritto nella sezione 5 di seguito. ^9,15

NOTA:. Metodi dettagliati per la coltivazione delle piante sono stati precedentemente descritti ¹⁶ In breve, crescere N. piante benthamiana in 4 vasi "riempite con qualsiasi miscela di suolo professionale che fornisce un buon drenaggio. Rivestimento piantine con una cupola di plastica per i primi 10-14 giorni di tempo per fornire un ambiente umido per la germinazione. aggiungere qualsiasi combinazione di fertilizzanti di serie seguendo le istruzioni del produttore per 14- giorno-vecchi impianti. crescere le piante sotto la luce bianca, con ~ 100 micromol fotoni m ^-2 sec ^-1 intensità della luce. piante acquatiche regolarmente.

1. Preparazione campioni di foglie per la visualizzazione

NOTA: le dinamiche Stromule sono influenzati da ferendo ^{8, in} modo preparazione dei tessuti deve essere condotta immediatamente prima della visualizzazione stromules mediante microscopia confocale. Idealmente, un campione deve essere visualizzato con 15 min dopo la rimozione dalla pianta.

1. Tagliare una piccola sezione della foglia con una lama di rasoio molto tagliente. Utilizzare sempre la stessa regione della foglia di coerenza, ed essere certi di visualizzare la stessa superficie (adaxial o abaxial) in tutti gli esperimenti.
2. Subito dopo il taglio della sezione di foglia, immergere la sezione foglia in una siringa da 5 ml senza ago riempita con acqua, rimuovere l'aria dalla siringa, e applicare un vuoto coprendo l'orifizio siringa con un dito e tirando lo stantuffo.
   1. Rilasciare lo stantuffo delicatamente per evitare di danneggiare la sezione di foglia. Ripetere questo due o tre volte, o fino a quando la maggior parte dell'aria è stato rimosso e la foglia sembra essere verde intenso.
      NOTA: Questo passaggio rimuove l'aria nella foglia che può interferire con accurata visualizzazione dei stromules.
3. Aggiungere una goccia d'acqua su un vetrino e posizionare la sezione foglia su questo calo. Quindi, aggiungere un altro drop di acqua all'inizio della foglia, e posizionare un vetrino sulla foglia. Se ci sono bolle d'aria, toccare delicatamente il vetrino fino a quando non vengono rimossi. Il vetrino è ora pronto per la microscopia, e dovrebbe essere visualizzato immediatamente.

2. Visualizing Stromules con confocale microscopia a fluorescenza

1. Con luce trasmessa, concentrarsi su un campo di vista vicino al centro della sezione del foglio (lontano dalle cellule danneggiate dalla lama di rasoio). Utilizzare un obiettivo 20X modo che molti cloroplasti possono essere visualizzate contemporaneamente. Salvare un'immagine con luce trasmessa in modo che i tipi di cellule possono essere distinti in seguito, se necessario.
2. Commutare la sorgente di illuminazione a un laser con opportuni filtri di eccitazione ed emissione per il fluoroforo utilizzato. Ad esempio, eccitare GFP con un laser 488 nm e raccogliere emissioni tra 500 nm e 525 nm.
   1. Utilizzando il software del microscopio, selezionare il canale GFP e fare clic per regolare l'apertura a foro stenopeico al 1 Aiunità ry. Selezionare scansione laser, per avviare la visualizzazione del campione, e quindi fare clic sul canale GFP per regolare l'intensità del laser e il guadagno del rivelatore per ridurre al minimo la potenza del laser, mentre ancora la visualizzazione chiaramente stromules. Una volta che queste impostazioni sono state determinate, tenerli il più coerente possibile in tutti gli esperimenti.
3. Preparare un esperimento impili z che raccoglierà una serie di immagini attraverso l'epidermide foglia nel campo visivo.
   1. Per la z impili, includere tutti cloroplasti epidermiche nel campo di vista per evitare distorsioni (per esempio, se cloroplasti vicino alla superficie del foglio hanno più stromules in condizioni testate).
   2. Prendere immagini a l'intervallo massimo possibile che includerà tutti stromules ma ridurre al minimo il tempo necessario per una z impili. Ad esempio, se 1 unità Airy è equivalente ad una sezione confocale a fuoco che è 2 micron profondo, riprendere un'immagine ogni 2 micron è probabile ideale.
      NOTA: Il epidermi foglias è una superficie irregolare, per cui la profondità totale del z impili varierà a seconda del campione; la maggior parte -Pile z richiederanno 10-20 immagini, ma possono includere più.
   3. Regolare la velocità di scansione e risoluzione dell'immagine come necessario per assicurarsi che la z impili viene raccolto rapidamente (tipicamente entro 5-10 min, se possibile). Salvare la z impili per una successiva analisi.

Processing 3. Immagine

1. Determinare la frequenza stromule utilizzando qualsiasi software di analisi delle immagini. Per questo protocollo, si consiglia di utilizzare ImageJ, che è a disposizione del pubblico dal National Institutes of Health (http://imagej.nih.gov/ij/), o l'aggiornamento popolare di ImageJ, Fiji (http://fiji.sc / Fiji).
2. Unire la z impili in un'unica immagine utilizzando la sporgenza massima intensità nel software.
3. Identificare e contare manualmente tutti i cloroplasti nell'immagine.
4. Per ogni cloroplasto, determinare visivamente se uno o più stromulessono visti che si estende dal cloroplasto in immagine z unito impili. Per esempi, vedi Figura 1.
   NOTA: Poiché le funzioni biologiche di stromules non sono noti, ogni, stroma-riempite, prolungamento tubolare sottile dal cloroplasto può essere considerato un "stromule", indipendentemente dalla lunghezza. Come regola generale, un'estensione stroma-riempita dal cloroplasto è un stromule se è inferiore a circa 1 micron di diametro lungo la maggior parte della sua lunghezza ^7. Assicurarsi che una persona analizza tutte le immagini per controllare le differenze soggettive nel determinare se un cloroplasto ha un stromule. Un secondo ricercatore deve verificare in modo indipendente le frequenze stromule per ridurre ulteriormente pregiudizi soggettivi.

4. Disegno sperimentale e campionamento

NOTA: Stromule frequenza è molto variabile tra le foglie, ma diversi rapporti suggeriscono che c'è una piccola variazione nella frequenza stromule all'interno di un individuale ^9,17 foglia.

1. Calcolare la frequenza foglio stromule da un unico campo di vista di una foglia. Eliminare la foglia, e considerare questo un campione indipendente. Non considerare campi separati di vista da una foglia come campioni indipendenti.
   NOTA: Non vi è ampio consenso sul modo migliore di misurare le variazioni nell'attività stromule, e fino a quando la funzione di stromules è più chiaramente definito, i ricercatori dovrebbero continuare ad essere creativi nel quantificare la dinamica stromule. Per fare un confronto tra letteratura, tuttavia, norme comuni di segnalazione devono essere utilizzati in aggiunta agli approcci più creativi. Come minimo, segnalare sempre la frequenza di cloroplasti che hanno uno o più stromules.
2. Determinare la frequenza dei cloroplasti che hanno stromules in un campo di vista. Utilizzare ImageJ per identificare tutti i cloroplasti in un campo di vista. Quindi, per ogni cloroplasto, determinare se il cloroplasto è formato almeno un stromule. Rapporto frequenza stromule come Percentage di cloroplasti con stromule.
   NOTA: Alcuni ricercatori trasformano la percentuale, per esempio con la trasformazione arcoseno, prima di riportare le frequenze stromule; Anche se questa è una opzione per l'analisi statistica, l'arcoseno di frequenza di stromule non è un valore intuitivo, e non ha bisogno di essere riportato nel testo principale o figure di uno studio.
   1. Come approccio alternativo, contare il numero totale di stromules, e dividerlo per il numero totale di cloroplasti.
      NOTA: Nella maggior parte dei casi, questo produrrà risultati simili per avvicinarsi 4.2; può sovrastimare la frequenza stromule, tuttavia, se un solo cloroplasto ha formato molti stromules. Nell'esempio mostrato in risultati rappresentativi, ad esempio, diversi cloroplasti hanno due o più stromules, aumentando il numero di stromules per cloroplasto al 40/87 (rispetto a una frequenza stromule di 33/87).
   2. In alternativa, determinare la lunghezza stromule anziché frequenza stromule. La lunghezza può essere misuratain ImageJ tracciando il stromule con lo strumento linea a mano libera.
      NOTA: Dal momento che il ruolo biologico di stromules rimane sconosciuta, non è chiaro che la lunghezza stromule colpisce la loro funzione. Relazione significative differenze di lunghezza stromule se osservati, ma inoltre segnalare le frequenze stromule (come descritto in 4.2).
      NOTA: la frequenza Stromule può essere molto variabile tra le foglie diverse alle stesse condizioni di crescita. Pertanto, anche se la determinazione della frequenza stromule può richiedere molto tempo, gli esperimenti devono essere attentamente progettati per includere campioni di grandi dimensioni. Utilizzando set di dati dal nostro laboratorio, abbiamo determinato che un campione di almeno 16 piante per ogni trattamento è di solito sufficientemente potente per determinare se vi è una differenza statisticamente significativa di almeno una variazione di 1,5 volte in frequenza stromule tra due condizioni (con il campione α = 0.05 e β = 0,80).
3. L'analisi statistica dei risultati.
   1. Per confrontare il meun frequenze stromule di due trattamenti, utilizzare il test t di Welch (noto anche come il test t test o t heteroscedastic supponendo che la varianza disuguale).
      NOTA: Questo test non è potente come test t di Student convenzionale, ma il test t di Welch è vantaggioso perché non si assume che la varianza nella distribuzione di frequenza stromule è simile tra i trattamenti.
      NOTA: Dal momento che la frequenza stromule è una "proporzione", la sua distribuzione campionaria è previsto per essere binomio più che normale, che potrebbero analisi statistiche teoricamente skew se le dimensioni del campione sono molto bassi o se la frequenza stromule è molto basso (vicino allo 0%) o molto alta (vicina al 100%). Alcuni report hanno usato trasformazioni arcoseno prima analisi statistiche, che ha lo scopo di trasformare una distribuzione binomiale di una distribuzione normale, e, quindi, di soddisfare i requisiti standard di test t di Student o ANOVA. In pratica, tuttavia, untrasformazioni rcsine hanno poco o nessun effetto sulla analisi statistica, e pertanto non sono raccomandati. Invece, ripetere gli esperimenti di aumentare la dimensione del campione, che consentirà di aumentare la potenza statistica e ridurre gli errori di interpretazione dei dati.
   2. Qualunque sia l'approccio statistico utilizzato, assicurarsi di segnalare con attenzione la strategia di campionamento, la dimensione del campione, test statistico, e il valore di p per ogni esperimento.
      NOTA: Come con altri campi della biologia, un valore di p inferiore a 0,05 può essere considerato "statisticamente significativo", anche se i ricercatori dovrebbero certamente riportare il valore p preciso ottenuto. Se p è leggermente superiore a 0.05, aumentando la dimensione del campione con due o tre esperimenti possono aiutare a chiarire se la differenza osservata è riproducibile e statisticamente significativa.

5. Estrazione cloroplasti Intact di visualizzare Stromule Dynamics

NOTA: Diversi metodisono stati utilizzati per isolare cloroplasti da foglie, comprendente un protocollo leggermente diverso in un recente studio sulla formazione stromule in vitro ^15. Il protocollo descritto di seguito utilizza un metodo relativamente semplice che non cede campioni cloroplasti biochimicamente puri, ma ha invece isolare una grande quantità di intatte, cloroplasti sani ^9,18.

1. Preparare tampone di estrazione a freddo: 50 mm Hepes NaOH, 330 mm sorbitolo, 2 mM EDTA, 1,0 mm MgCl ₂ e 1,0 mm MnCl _2. Regolare il pH a 6,9 con NaOH e HCl, e conservare in frigorifero prima dell'uso.
   NOTA: Anche se non è necessario, utilizzando tamponi freddi e mantenere i campioni in ghiaccio, quando possibile, produrrà una percentuale maggiore di cloroplasti intatti.
2. Preparare buffer di isolamento: 50 mm Hepes NaOH, 330 mm sorbitolo, 2 mM EDTA, 1,0 mm MnCl _2, 1,0 mm _MgCl2, 10 mM KCl, e 1,0 mm di NaCl. Regolare il pH a 7,6 con NaOH e HCl e conservare in frigorifero prima dell'uso.
3. Se le foglie non sonoesprimendo un fluoroforo stromale geneticamente codificato, preparare carboxyfluorescein diacetato soluzione (CFDA): Soluzione 50 mM CFDA in dimetilsolfossido (DMSO) (2,3 mg CFDA per 1,0 ml DMSO).
   NOTA: L'esatta concentrazione non è critica. Mantenere CFDA magazzino al buio in ogni momento. Conservare piccole aliquote di 50 mm CFDA a -20 ° C.
4. Per isolare cloroplasti, rimuovere ~ 5-10 g di foglie di diverse piante e sciacquare brevemente in acqua fredda. Trasferire immediatamente a 50 ml tampone di estrazione a freddo. foglie Grind utilizzando un frullatore con diversi impulsi brevi. Filtrare su due o tre strati di garza per rimuovere i detriti foglia, dividere i cloroplasti estratti in due 50 ml provette da centrifuga e centrifugare per 1 min a 750 x g.
5. Eliminare il surnatante e risospendere le cloroplasti verdi nel buffer di isolamento 10 ml. Centrifugare ancora per 1 min a 750 xg, scartare il surnatante e cloroplasti risospendere in tampone isolamento per portare il volume finale a 5 ml.
6. Trasferimento 201, l dei cloroplasti a una diapositiva, coprire con un vetrino, e cominciare la microscopia.
   NOTA: cloroplasti da piante transgeniche che esprimono proteine ​​fluorescenti plastid mirati sono ora pronti per la visualizzazione al microscopio a fluorescenza confocale.
7. Stain cloroplasti da piante che non esprimono proteine ​​fluorescenti plastid mirati di visualizzare stromules.
   1. Aggiungere 5 ml di 50 mm CFDA magazzino alle 5 ml cloroplasti-sospese in un tampone di isolamento. Portare la concentrazione finale di 50 mM.
   2. Consentire cloroplasti di incubare per 5 minuti, e poi trasferire una piccola aliquota (~ 50 ml) a una diapositiva, coprire con un vetrino, e cominciano la microscopia.
   3. Utilizzare un set di filtri FITC o GFP. Utilizzare un obiettivo 20X di visualizzare molti cloroplasti simultaneamente, o un obiettivo più alto di visualizzare un unico cloroplasto isolato.
      NOTA: CFDA sarà fluorescenza all'interno dello stroma dei cloroplasti intatti.
   4. Se vi è una forte fluorescenza di fondo, lavare il chloroplasts di nuovo in 10 ml di tampone di isolamento dopo la 5 min incubazione con CFDA, centrifugare per 1 min a 750 xg, scartare il surnatante, e risospendere in 5 ml di tampone di isolamento.

Risultati

Questo protocollo è stato utilizzato per visualizzare la frequenza stromule di giorno e di notte nei cotiledoni di giovane N. piantine benthamiana. Fette da una pila Z sono state fuse in un'unica immagine (Figura 1A). Per scopi visivi, che l'immagine è stata poi desaturata e invertito in modo che appare stroma nero (Figura 1B). I cloroplasti sono stati etichettati o come non avere stromules (asterisco verde) o che han...

Discussione

Quando si indaga stromules, tre importanti fattori devono essere considerati durante: (i) la manipolazione del tessuto vegetale deve essere ridotto al minimo, (ii) il sistema sperimentale deve essere mantenuta costante, e (iii) le strategie di campionamento deve essere attentamente pianificata per garantire robusta, i dati vengono analizzati riproducibili.

Stromules sono molto dinamici: possono estendere e ritrarre velocemente davanti agli occhi di un osservatore al microscopio. Inoltre, la ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
NaOH	Fischer-Scientific	S320-1
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
EDTA	Fischer-Biotech	BP121
MnCl2	Sigma-Aldrich	221279
MgCl2	Sigma-Aldrich	M0250
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
NaCl	Sigma-Aldrich	S9625
Laser Scanning Confocal Microscope	Carl Zeiss Inc	Model: LSM710
Carboxyfluorescein diacetate (CFDA)	Sigma-Aldrich	21879
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	EMD	MX1458-6
Waring blender	Waring	Model: 31BL92
Fiji	fiji.sc		Open-source software for analyzing biological images