Un modello murino di Gruppo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonizzazione vaginale

Riepilogo

Lo scopo di questo protocollo è di imitare gruppo umano B Streptococcus (GBS) la colonizzazione vaginale in un modello murino. Questo metodo può essere usato per studiare risposta immunitaria e fattori batterici contribuiscono GBS persistenza vaginale, nonché per testare strategie terapeutiche.

Abstract

Streptococcus agalactiae (streptococco di gruppo B, GBS), è un Gram-positivi, colonizzatore asintomatico del tratto gastrointestinale umano e del tratto vaginale del 10 - 30% degli adulti. Negli individui immunocompromessi, compresi i neonati, donne incinte e gli anziani, GBS può passare a un patogeno invasivo provocando sepsi, artrite, polmonite e la meningite. Perché GBS è un batterio patogeno leader di neonati, la profilassi corrente è composto di uno screening in ritardo di gestazione per GBS colonizzazione vaginale e la successiva terapia antibiotica peri-parto delle madri GBS-positivi. Heavy GBS onere vaginale è un fattore di rischio per entrambe le malattie neonatali e la colonizzazione. Purtroppo, poco si sa circa l'host e fattori batterici che incoraggiare o consentire GBS colonizzazione vaginale. Questo protocollo descrive una tecnica per stabilire persistente GBS colonizzazione vaginale utilizzando un unico β-estradiolo pre-trattamento e campionamento giornaliero per stabilire loa battericad. La comunicazione precisa inoltre particolari metodi per somministrare terapie o reagenti di interesse aggiuntivi e per raccogliere vaginale liquido di lavaggio e tessuti dell'apparato riproduttivo. Questo modello di topo favorirà la comprensione dell'interazione GBS-host all'interno dell'ambiente vaginale, che porterà a potenziali bersagli terapeutici per il controllo materno colonizzazione vaginale durante la gravidanza e per prevenire la trasmissione al neonato vulnerabili. Sarà anche essere di interesse per aumentare la nostra comprensione delle interazioni generali batterico-ospite nel tratto vaginale femminile.

Introduzione

Streptococcus agalactiae, streptococco di gruppo B (GBS), è un incapsulato batterio Gram-positivi che spesso viene isolato dal intestino e tratto genito-urinario degli adulti sani. Nel 1970, GBS è emerso come l'agente principale di mortalità neonatale infettiva, con oltre 7.000 casi di malattia neonatale all'anno ^1. Precoce della malattia di GBS (EOD) si verifica nelle prime ore o giorni di vita, si pone come polmonite o distress respiratorio, e spesso si sviluppa in sepsi, mentre la malattia ad esordio tardivo (LOD) ne consegue dopo diversi mesi e si presenta con batteriemia, che spesso anticipi a meningite ^2. A partire dal 2002, i Centri per il Controllo e la Prevenzione delle Malattie raccomanda lo screening universale per GBS colonizzazione vaginale a fine gestazione e la profilassi antibiotica intrapartum (IAP) per le madri GBS-positivi ^1. Nonostante la riduzione della malattia ad esordio precoce a circa 1.000 casi negli Stati Uniti ogni anno a causa di IAP,GBS rimane la principale causa di sepsi neonatale ad esordio precoce e tardiva comparsa rimane inalterato ^1. Sia in utero, durante il travaglio, o anche nei casi ad esordio tardivo, l'esposizione neonatale a GBS richiede la sopravvivenza, trasversale attraverso una serie di ambienti e barriere di accoglienza, evasione immune, e, nel caso di meningite, attraversamento del sangue- altamente regolamentato encefalica ^2. A monte di queste interazioni virulenti nel neonato è la colonizzazione iniziale del tratto vaginale materno. Materna GBS tassi di colonizzazione vaginale vanno 8-18% nei paesi sviluppati e in via di sviluppo, con un tasso medio stimato del 12,7% ^3,4. GBS colonizzazione del tratto vaginale durante la gravidanza può essere costante, intermittente, o di natura transitoria tra singole donne ^5. È interessante notare che, a materni di età> 36 anni è associata con la colonizzazione persistente ^6. Numerosi fattori di rischio biologici e socio-economici per la colonizzazione GBS vaginaleè stato identificato. Fattori biologici includono gastrointestinale colonizzazione GBS e l'assenza di Lactobacillus all'interno dell'intestino. Tuttavia, l'etnia, l'obesità, l'igiene e l'attività sessuale sono stati anche associati con GBS trasporto vaginale ^7.

Anche se noti per causare infezioni neonatali, GBS provoca anche una varietà di infezioni materne sia peri-parto e dopo il parto. GBS carrello viene aumentata in donne che presentano una vaginiti ⁸ e, in alcuni casi, può anche essere l'entità della malattia ^9. Inoltre, GBS ascensione del tratto riproduttivo durante la gravidanza può causare infezioni intra-amniotico o corionamnionite ^10. Inoltre, fino al 3,5% delle gravidanze, GBS diffonde alla vescica urinaria per provocare una infezione delle vie urinarie o batteriuria asintomatica ^11. bacteriuria GBS durante la gravidanza è associato ad un aumentato rischio di febbre intrapartum, corionamnionite, parto prematuro, e premature rottura delle membrane ^12. Presi insieme, la presenza di GBS nel tratto vaginale è legata ad infezioni di più tessuti dell'ospite, e la capacità di eliminare GBS da questa nicchia è fondamentale per la salute materna e neonatale.

Fino a poco tempo, la maggior parte del lavoro esaminare interazioni GBS con il tratto cervicovaginale era limitato a modelli cellulari in vitro ^13-15. Questi esperimenti in vitro hanno rivelato fattori batterici che sono importanti per l'adesione, tra cui proteine di superficie come una pili e ricco di serina ripete ^17,18, così come i sistemi di regolazione a due componenti ^15,19 e la risposta trascrizionale globale dell'epitelio vaginale GBS ^19. Tuttavia, per chiarire completamente le interazioni ospite-microbo all'interno del tratto vaginale, un modello animale robusto è necessario. I primi lavori hanno dimostrato che GBS può essere recuperato dal tratto vaginale di topi inoculati ^20,21 e ratti ^{22 sia in condizioni di gravidanza e non gravide. Nel 2005, a breve termine la colonizzazione GBS vaginale è stato modellato nei topi per esaminare l'efficacia di un enzima fago litico per il trattamento di GBS vaginale nel corso di un periodo di 24 ore 23. Diversi anni dopo, un modello di topo GBS colonizzazione vaginale a lungo termine è stato sviluppato per studiare i fattori di accoglienza e batteriche che disciplinano GBS persistenza. Questo modello ha identificato numerosi fattori che contribuiscono alla GBS colonizzazione, comprese le appendici superfici 17,18 e GBS sistemi a due componenti 19,24. Questo modello ha contribuito alla identificazione dei meccanismi di risposta dell'ospite 19,25 ed è stato utilizzato per testare diverse strategie terapeutiche, tra cui peptidi immunomodulatori 26 e probiotici 27. Questo protocollo fornisce le indicazioni necessarie per inoculare GBS nel tratto vaginale mouse e per monitorare successivamente colonizzazione e raccogliere campioni per ulteriori analisi.}

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Protocollo

Tutto il lavoro animale è stato approvato dall'Ufficio di Lab Animal Care a San Diego State University e condotta sotto gli standard veterinari riconosciuti. Topi femmina, età 8 - 16 settimane, sono stati utilizzati per lo sviluppo di questo metodo.

1. Preparazione e intraperitoneale Iniezione di β-estradiolo

1. Misurare β-estradiolo (0,5 mg / topo) su carta pesare indossando dispositivi di protezione adeguati (DPI). ATTENZIONE: β-estradiolo può essere assorbito attraverso la pelle e delle mucose.
2. Trasferire β-estradiolo in una provetta conica da 15 ml e vortex fino a quando tutti i grumi vengono rimossi e la β-estradiolo è una polvere fine. Elaborare olio di sesamo (100 ml / topo) in una siringa da 10 ml. Siringa-filtro olio di sesamo nel tubo conico da 15 ml contenente il β-estradiolo usando un filtro da 0,45 micron. Agitare la provetta conica da 15 ml fino alla β-estradiolo è una sospensione omogenea in olio di sesamo.
3. Elaborare il beta-essospensione tradiol in una nuova siringa da 10 ml. Con 18 G, 1-in. ago, un'aliquota 100 ml di sospensione in siringhe tubercolina da 1 ml. Preparare una siringa per ogni mouse. Mettere un nuovo, sterile, 26 G, ½-in. ago su ogni siringa da tubercolina.
4. Somministrare 0,5 mg di β-estradiolo sospesa in 100 ml di olio di sesamo (5 mg / ml) per ciascun topo 24 ore prima dell'inoculo batterico. Iniettare ogni topo all'interno della cavità peritoneale, nei quadranti addominali inferiori, appena a destra oa sinistra della linea mediana, come descritto in precedenza ^28.
   NOTA: Nessuna pulizia o clipping del sito di iniezione è necessaria.

2. vaginale inoculazione con GBS

1. Un giorno prima dell'inoculo, crescere a 5 ml coltura liquida durante la notte di un ceppo GBS di interesse, come la A909 (sierotipo Ia), in Todd Hewitt Broth (THB) a 37 ° C.
2. Sottocultura cultura overnight GBS a volume 01:10 in THB fresca e incubare a 37 ° C. Far crescere labatteri agli fase di mid-log (OD ₆₀₀ = 0,4-0,5). NOTA: Questo genere prendere 2 - 3 ore, a seconda del ceppo di GBS.
3. Trasferire la sottocultura di una sterile batteri tubi e pellet coniche 15 ml a 3.000 × g per 5 min. Aspirare il surnatante. Risospendere il pellet batterico in 200 ml di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS).
4. Utilizzando il pellet risospeso, portare 3 - 5 ml di PBS (1 ml per 10 topi) esattamente OD ₆₀₀ = 0.4 in un nuovo tubo 5 ml cultura. Questo sarà una concentrazione di ~ 1 × 10 ⁸ unità formanti colonie (CFU) / ml. Trasferimento a un nuovo tubo conico da 15 ml e ri-pellet i batteri a 3.000 × g per 5 min. Aspirare il surnatante.
5. Risospendere il pellet in PBS a 1/10 del volume originale. Ad esempio, se 3 ml di OD ₆₀₀ = 0.4 è stato pellettati, poi risospendere in 300 ml di PBS. NOTA: Questa è la sospensione finale batterica (~ 1 × 10 ⁹ CFU / ml) utilizzato per l'inoculazione animale.
6. Reserve 50 ml di questa sospensione per la diluizione di serie e placcatura in THB agar per determinare l'inoculo esatto.
7. Inoculare ogni topo con 10 microlitri della sospensione batterica finale in modo che 1 × 10 ⁷ CFU viene somministrato a ciascun topo.
   1. Per inoculare, trattenere il mouse manualmente, garantendo la pelle floscia alla collottola tra il pollice del gestore e l'indice e quindi immobilizzare la coda, come descritto in precedenza ^28.
   2. Redigere 10 ml di GBS previste al punto 2.6 in un gel da 200 ml punta di carico della pipetta. Inserire la punta da 5 a 10 mm nel lume vaginale e dispensare i 10 ml di inoculo.
      NOTA: punte di carico gel sono preferite rispetto alle normali punte di 200 microlitri per ridurre al minimo il rischio di traumi o lesioni d'organo, in particolare nei topi più giovani o più piccoli.
   3. Subito dopo l'inoculazione, rilasciare la collottola ed elevare la fine posteriori del mouse, sollevando il mouse per la coda e walking le zampe anteriori su una superficie dura per ~ 1 min.
   4. Visivamente l'apertura vaginale per qualsiasi riflusso di inoculo. Se si osserva riflusso, un puntale per pipetta può essere usato per manipolare o ingrandire l'apertura vaginale, facilitando l'assorbimento del riflusso nel lume. Inoltre, riflusso può essere aspirato tramite pipetta e ri-inoculato.
      NOTA: Se la somministrazione di agenti topici, organismi probiotici, o proteine ​​di interesse, un volume fino a 20 ml in un buffer fisiologica può essere dato nel tratto vaginale.

3. tamponamento la Lumen vaginale per quantificare GBS carico

1. Preparare una micro-centrifuga tubo da 1,5 ml per il mouse con l'aggiunta di 100 ml di PBS. Appena prima di tampone, pre-bagnare il tampone in PBS.
2. Trattenere il mouse come descritto al punto 2.7.1 e inserire il tampone 10 mm nel lume vaginale. Ruotare delicatamente il tampone 4 volte in senso orario e 4 volte in senso antiorario, esercitando una leggera pressione sulla parete vaginale.
3. Trasferire il tampone per la provetta da 1,5 ml con 100 ml di PBS. Prima di placcatura, vortex la provetta per ~ 15 sec per rilasciare i batteri dal tampone. In serie diluire ogni campione in PBS e la piastra di 20 ml di diluizioni 1:10 attraverso 1: 10.000 su piastre di agar differenziale medio preparati secondo le istruzioni del produttore. Incubare le piastre a 37 ° C per 24 ore. colonie GBS appariranno sia rosa brillante o malva a colori. Altri flora endogena saranno inibiti, o appariranno come colonie blu, bianco, o grigio.

4. Raccogliere fluido vaginale Lavage

1. Trattenere il mouse come descritto al punto 2.7.1. Utilizzando un 200 ml di gel di carico punta della pipetta, pipetta 20 ml di PBS nel lume vaginale. pipettare delicatamente l'intero volume su e giù 4 volte all'interno del lume, e poi ritirare l'intero volume nella stessa punta della pipetta. NOTA: Se il liquido di lavaggio è densa di muco, uno standard di 200 microlitri punta della pipettapuò essere utilizzato per raccogliere il liquido di lavaggio finale.
2. Se il risparmio liquido di lavaggio per l'analisi delle citochine o CFU quantificazione, erogare in una provetta da 0,7 ml. Se la determinazione della fase di estro, erogare almeno 5 ml di liquido di lavaggio su un vetrino e osservare le cellule sotto ingrandimento 100X su un microscopio ottico. NOTA: Per esempi di stadi estro, si veda la Figura 1.

5. Tessuto Dissection e omogeneizzazione

1. Per ogni mouse, preparare tre tubi da 2 ml con tappo a vite (una per ogni tessuto: vagina, cervice e utero). Riempire ogni provetta con ampi (0,4 - 0,5 g) 1,0 mm perline zirconia per coprire il fondo a forma conica del tubo.
2. Autoclave provette preparate prima di raccogliere il tessuto per 30 minuti a 121 ° C, specialmente se quantificazione carica batterica. Aggiungere 500 ml di PBS sterile ad ogni provetta. Pesare ogni tubo dopo la sterilizzazione in autoclave e record per riferimento futuro per calcolare il peso dei tessuti recuperati.
3. Sacrifica il mouse utilizzando metodi istituzionali approvati come CO ₂ asfissia e dislocazione cervicale. Spray giù l'addome ventrale con il 70% EtOH. Con le forbici sterili, aprire la cavità addomino, sollevare la pelle schiena e muscoli addominali, e spostare l'intestino in modo che il tratto riproduttivo è esposto.
4. Sterilizzare le forbici con il 70% EtOH, pulire se necessario, e tagliare entrambe le corna uterine di media lunghezza tra il corpo dell'utero e delle ovaie. Utilizzando forbici e pinze, grassi separata viscerale, membrane, e la vescica urinaria lontano dal tratto riproduttivo, lo spostamento caudale.
5. Sterilizzare le forbici come descritto al punto 5.4. Trasversalmente tagliare la vagina più vicino alla vulva come possibile separare il tratto riproduttivo dal corpo. Sollevare e rimuovere il tratto riproduttivo intatto e metterlo in una piastra di Petri sterile.
6. Utilizzando un nuovo lama di rasoio, separare l'utero dalla cervice in un taglio trasversale. Sterilizzare la lama di un rasoio con il 70%EtOH, e quindi separare la cervice dalla vagina in un taglio trasversale. NOTA: Ci sarà una quantità minima di tessuto uterino ancora attaccato alla cervice. Ci sarà una quantità minima di tessuto vaginale ancora attaccato alla cervice.
7. Utilizzando pinze sterili, trasferire singoli tessuti nelle loro rispettive provette da 2 ml contenenti PBS e omogeneizzazione perline. Pulire la pinza con il 70% EtOH tra gestione ogni tessuto.
8. Pesare ciascuna 2 ml provetta con tappo a vite e sottrarre il peso iniziale del tubo per determinare il peso del tessuto. pesi tessuto variano tipicamente circa 20 - 100 mg. Strettamente sigillare le provette con tappo a vite e omogeneizzare i tessuti per 1 min alla massima velocità in un omogeneizzatore tessuto.
9. Per quantificare carica batterica, in serie diluire 25 ml di omogenato tissutale e diluizioni piastra 01:10 attraverso 1: 10.000 su piastre agar differenziali. Incubare le piastre come descritto al punto 3.3. Per memorizzare i campioni per la quantificazione di citochine, congelare omogenati di tessuti a -20 ° C.

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Risultati

Durante lo sviluppo di questo modello, sono state fatte diverse osservazioni per quanto riguarda i fattori che influenzano la durata della GBS colonizzazione vaginale. Per determinare fase estrale come ad impatti di inoculazione GBS persistenza batterica, i topi sono stati in scena il giorno della inoculazione mediante liquido di lavaggio vaginale. La Figura 1 illustra le quattro fasi del ciclo estrale mouse, come determinato da wet-montare liquido di lavaggio vaginale, ...

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Discussione

Per promuovere l'avanzamento della comprensione delle interazioni GBS con lo sia l'host e altri microbi nell'ambito dell'ospite, è necessario un modello animale. Questo lavoro descrive gli aspetti tecnici di stabilire GBS colonizzazione vaginale nei topi. Questo protocollo raggiunge> 90% colonizzazione topi senza l'uso di anestetici per inoculare i batteri o per raccogliere campioni di tampone, immuno-soppressori per consentire la colonizzazione, vaginale prelavaggio, o additivi per addensare l&#...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sesame oil	Sigma Aldrich	S3547-250ML
β-Estradiol	Sigma Aldrich	E8875-1G	CAUTION: Wear appropriate PPE. β-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces.
200 μl gel loading pipette tips	USA Scientific	1252-0610
Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs	Puritan	25-801 A 50
CHROMagar StrepB	DRG International	SB282
Todd Hewitt Broth	Hardy Diagnostics	7161C
18 G, 1.5 inch needles	BD	305199
26 G, 0.5 inch needles	BD	305111
10 ml syringes	BD	309604
1 ml syringes	BD	309659
0.45 μm PVDF syringe filters	Whatman	6900-2504
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x	Corning	21-031-CV