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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui si descrive un protocollo volto ad indagare l'impatto di aberrant splicing sulla resistenza ai farmaci nei tumori solidi e le neoplasie ematologiche. A questo scopo, abbiamo analizzato i profili trascrittomica dei modelli genitoriali e resistenti in vitro attraverso RNA-Seq e stabilito un metodo basato qRT-PCR per convalidare geni candidati.

Abstract

La resistenza ai farmaci rimane un problema importante nel trattamento del cancro sia per neoplasie ematologiche e tumori solidi. resistenza intrinseca o acquisita può essere causato da una serie di meccanismi, tra cui una maggiore eliminazione del farmaco, diminuito assorbimento di droga, l'inattivazione di droga e alterazioni dei bersagli farmacologici. Dati recenti hanno mostrato che oltre dal noto genetica (mutazione, amplificazione) ed epigenetici (metilazione del DNA, istoni modificazioni post-traduzionali) modifiche, i meccanismi di resistenza ai farmaci potrebbe anche essere regolata da aberrazioni splicing. Si tratta di un settore in rapida crescita di indagine che richiede un'ulteriore riflessione al fine di pianificare approcci terapeutici più efficaci. Il protocollo descritto in questo documento ha lo scopo di investigare l'impatto di aberrant splicing sulla resistenza ai farmaci nei tumori solidi e le neoplasie ematologiche. A questo scopo, abbiamo analizzato i profili trascrittomica di diversi modelli in vitro attraverso RNA-Seq e stabilireEd un qRT-PCR metodo basato per convalidare geni candidati. In particolare, abbiamo valutato la splicing differenziale di DDX5 e PKM trascrizioni. Il aberrant splicing rilevato dallo strumento computazionale MATS stato convalidato in cellule leucemiche, mostrando che le diverse varianti di splicing DDX5 sono espresse nelle cellule resistenti vs parentale. In queste cellule, abbiamo anche osservato un rapporto più elevato PKM2 / PKM1, che non è stato rilevato nel Panc-1 controparte gemcitabina-resistenti rispetto ai genitori Panc-1 le cellule, suggerendo un diverso meccanismo di farmaco-resistenza indotta dall'esposizione gemcitabina.

Introduzione

Nonostante i notevoli progressi nel trattamento del cancro, la resistenza delle cellule maligne alla chemioterapia, sia intrinseco o acquisito in seguito ad esposizione al farmaco prolungata, è il motivo principale per il fallimento del trattamento in una vasta gamma di leucemie e tumori solidi 1.

Al fine di delineare i meccanismi alla base della resistenza ai farmaci, in modelli in vitro di linee cellulari sono stati sviluppati da selezione graduale di cellule tumorali resistenti agli agenti chemioterapici. Questa procedura imita i regimi utilizzati nelle impostazioni cliniche e permette quindi a un'indagine approfondita dei meccanismi di resistenza rilevanti. Cellule resistenti che sopravvivono al trattamento sono poi distinti da cellule sensibili parentali utilizzando saggi di vitalità cellulare / citotossicità 2. In profili di resistenza ai farmaci in vitro di cellule primarie hanno dimostrato di essere significativamente correlata alla risposta clinica alla chemioterapia 3.

High-throughput cytotosaggi tossicità costituiscono un metodo conveniente per determinare la sensibilità ai farmaci in vitro. Qui, la vitalità delle cellule è valutata per esempio 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazolio bromide - MTT assay 4, che si basa sulla conversione metabolica di alcuni substrati (cioè, sali di tetrazolio) in prodotti colorati, riflettendo così l'attività mitocondriale di cellule. In alternativa, il contenuto di proteina cellulare può essere quantificata usando il saggio 5 sulforodamina B (SRB). Qui, il numero di cellule vitali è proporzionale alla densità ottica (OD) misurata ad una lunghezza d'onda appropriata in uno spettrofotometro, senza bisogno di ampio e che richiede tempo procedure di conteggio delle cellule. L'inibizione della crescita indotto da un certo farmaco chemioterapico può essere calcolato sulla base del diametro esterno dei pozzetti in cui le cellule sono state trattate con un agente di prova e comparati con il diametro esterno di cellule di controllo non trattate. Una curva dose-risposta è obtained tracciando concentrazioni di farmaco rispetto a percentuali di cellule vitali relativi alle cellule di controllo. Infine, la sensibilità ai farmaci può essere riportato come la concentrazione che provoca il 50% di inibizione della crescita cellulare rispetto alle cellule non trattate (IC 50).

I meccanismi alla base della resistenza ai farmaci includono molte anomalie differenti, come alterazioni influenzano l'espressione genica dei determinanti di attività di droga e il metabolismo cellulare. Queste lesioni molecolari, tra cui le mutazioni, aberrazioni ad un trascrizionale e livello post-trascrizionale, nonché regolazione epigenetica disturbato spesso colpiscono geni coinvolti sia nel metabolismo dei farmaci o apoptosi 6.

Alternative splicing pre-mRNA e la sua regolazione intricata hanno recentemente ricevuto una notevole attenzione come un romanzo entità che possono dettare la resistenza ai farmaci delle cellule tumorali 7. Fino al 95% dei geni umani sono splicing alternativo in cellule normali mediante questostrettamente regolamentato processo che produce molte isoforme di proteine ​​differenti dallo stesso gene. Splicing alternativo è spesso liberalizzato nel cancro e diversi tumori sono caratterizzati da splicing alterato di un numero crescente di geni coinvolti nel metabolismo dei farmaci (ad esempio, deossicitidina chinasi, sintetasi foli, o proteine multifarmaco resistenza) 6,8. Tuttavia, un'analisi completa dei profili di giunzione delle cellule resistenti ai farmaci è dolorosamente carente. Pertanto, è imperativo sviluppare metodi high throughput per analisi alternative splicing. Questo potrebbe aiutare a sviluppare approcci terapeutici più efficaci.

Durante l'ultimo decennio, il rapido sviluppo delle tecnologie di prossima generazione di sequenziamento (NGS) ha arricchito la ricerca biomedica con nuove informazioni sui meccanismi molecolari che regolano regolazione dell'espressione del genoma e il loro ruolo in vari processi biologici 9. RNA-sequenziamento (RNA-Seq) è un potente sub-applicazionedi NGS nel campo della trascrittomica. Esso consente una profilazione genome-wide (qualitativamente e quantitativamente) dei modelli di espressione di migliaia di geni contemporaneamente e ben si adatta per la caratterizzazione di nuovi mRNA codificanti così come lungo l'RNA non codificante, miRNA, siRNA, e altri piccoli RNA classi (ad esempio, snRNA e Pirna) 10,11.

RNA-Seq ha molti vantaggi rispetto alle tecnologie precedenti per la caratterizzazione del trascrittoma (ad esempio, Sanger sequenziamento e microarray di espressione). Essa non si basa su l'annotazione del genoma esistente, ha un livello di singolo nucleotide di risoluzione e ha una gamma dinamica più ampia per la stima livello di espressione. In breve, il flusso di lavoro sperimentale di base di esperimenti di RNA-Seq è costituito da poliadenilato trascrizione (mRNA) la selezione e la frammentazione, seguita da conversione in cDNA, di costruzione di biblioteche e sequenziamento profondo, infine, massicciamente paralleli 12,13. A causa della rapida diminuzione della sequencincosti g Nel corso degli ultimi anni, l'RNA-Seq sta gradualmente sostituendo le altre tecnologie e sforzi significativi sono stati fatti per migliorare i protocolli di preparazione biblioteca. Per esempio, è ora possibile per conservare le informazioni filo di trascritti di mRNA segnando il secondo filone di cDNA con deossiuridina trifosfato (dUTP) e, prima di amplificazione PCR, digerire il filo segnato con uracile-DNA-glycosilase (UDG). Questo processo aumenta la precisione di annotazione genica e stima dei livelli di espressione 14,15.

L'analisi e l'interpretazione dei dati di RNA-Seq richiedono pacchetti software di calcolo complesse e potenti e la trasformazione delle condutture bioinformatici 16,17. In primo luogo, la cruda legge subiscono il controllo di qualità, eliminando artefatti tecnici e biologici e scartando (trimming) le sequenze che non raggiungono i requisiti di qualità rigorosi. Successivamente la legge per ogni campione sono mappati ad un genoma di riferimento e indicizzatoin gene-livello, esone livello o livello di trascrizione, per determinare l'abbondanza di ciascuna categoria. A seconda dell'applicazione, i dati ricercati sono poi calcolate attraverso modelli statistici per l'identificazione di espressione allele-specifica, splicing alternativo, fusioni geniche e polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) 12. Infine, l'analisi differenziale sul livello selezionato (cioè, l'espressione genica o splicing alternativo) può essere utilizzata per confrontare campioni ottenuti in condizioni diverse.

Analisi splicing differenziale descrive le differenze di utilizzo del sito di splicing tra i due campioni. Un numero crescente di pacchetti software dedicati a questo scopo sono disponibili sulla base di diversi modelli statistici, le prestazioni e l'interfaccia utente 18. Tra questi, Mats (Analisi multivariata di Trascrizione Splicing) emerge come uno strumento di calcolo liberamente disponibile e preciso sulla base di un quadro statistico Bayesiano e progettati per rilevare diffeeventi di splicing renziale da entrambi i dati RNA-Seq singoli o accoppiati end. Partendo dai file allineate (.bam), STUOIE in grado di rilevare tutti i principali tipi di eventi alternativi di splicing (exon skipping, alternativa 'sito di splicing alternativo, 5' 3 sito di splicing, esoni si escludono a vicenda e ritenzione di introni - anche vedi Figura 1).

Innanzitutto, identifica software legge che supportano un certo evento giunzione, per esempio esone skipping e le classifica in due tipi. "Inclusione legge" (per l'evento giunzione canonica) mappare all'interno del esone indagato e abbracciare le giunzioni tra quella specifica esone e le due esoni fiancheggianti a monte ea valle. "Skipping legge" (per l'evento di splicing alternativo) abbracciano la giunzione tra i due esoni fiancheggianti. Successivamente, MATS restituisce il livello di inclusione normalizzato per entrambi gli eventi canonici e alternativi e confronta i valori tra i campioni o condizioni. Infine, calcola P-value unnd false discovery rate (FDR) supponendo che la differenza nel rapporto variante di un gene tra due condizioni supera una soglia definita dall'utente per ciascun evento splicing 19,34.

A seguito di analisi di splicing differenziale in combinazione con RNA-Seq, una vasta validazione sperimentale è giustificato al fine di identificare i candidati veri positivi gene 18. Quantitative inversione trascritto-polymerase chain reaction (qRT-PCR) è il metodo più comunemente utilizzato e ottimale in validazione dei candidati ottenuti dalle analisi di RNA-Seq 20. Lo scopo di questo lavoro è quello di fornire una solida metodologia per indagare Profili di droga splicing di resistenza legate nei tumori solidi e le neoplasie ematologiche. Il nostro approccio utilizza RNA-Seq-based trascrittoma profili dei modelli di linee cellulari selezionate di tumori resistenti ai farmaci in combinazione con un metodo di qRT-PCR stabilito per la validazione dei geni candidati coinvolti nella resistenza ai farmaci.

I modelli della linea di cellule di leucemia umana utilizzati in questo studio hanno incluso pediatrico cellule T leucemia linfoblastica acuta (T-ALL) linea cellulare CSFR-CEM (CEM-WT), i suoi due glucocorticoidi (GC) resistente subclones CEM -C7H2-R5C3 (CEM-C3) e CEM-C7R5 (CEM-R5) 21,22 e il metotrexato (MTX) Subline resistente CEM / R30dm 23. Anche se le attuali terapie a base di GC e MTX stabilire beneficio clinico in circa il 90% dei casi, la comparsa di GC-resistenza rappresenta ancora un problema irrisolto con un meccanismo molecolare chiaro. Per isolare sub-cloni GC-resistente, le cellule CEM-WT sono state coltivate in 1 micron dexametasone (Des) per 2 o 3 settimane. Subline MTX-resistente CEM / R30dm è stato sviluppato attraverso ripetuta a breve termine (24 ore) esposizione delle cellule CEM-WT a 30 micron MTX come mimica di protocolli clinici. È interessante notare che questa linea cellulare visualizzata anche una resistenza incrociata a Dex (risultati non pubblicati), per i quali il meccanismo non è del tutto chiaro.

Il tum solidoo il modello studiato in questo studio è adenocarcinoma del dotto pancreatico, noto per la sua straordinaria refrattarietà alla chemioterapia. A questo scopo, abbiamo selezionato linea Panc-1 cellula e la sua gemcitabina resistente sub-clone Panc-1R ottenuta mediante incubazione continuo con 1 pM del farmaco 24. Qui si descrive un metodo per scoprire nuovi meccanismi alla base in vitro resistenza ai farmaci mediante la combinazione di tre protocolli: saggi di citotossicità colorimetrici per valutare la sensibilità ai farmaci nelle cellule leucemiche e cellule tumorali di tumori solidi, gasdotto RNA-Seq-based per identificare varianti di splicing nuovi legati alla la sensibilità ai farmaci / resistenza e RT-PCR e qRT-PCR per convalidare potenziali candidati.

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Protocollo

1. Caratterizzazione di Profili di droga resistenza attraverso citotossicità Assays

  1. Leucemico Cell Culture Linea
    1. Mantenere il T-cellule parentali ALL linea cellulare CCRF-CEM (CEM-WT) così come i suoi sublines resistenti ai farmaci, tra CEM / R30dm, CEM-R5 e CEM-C3, nel 25 cm 2 in media 10 ml RPMI-1640 contenente 2.3 mM di acido folico supplementato con 10% siero fetale di vitello e di 100 unità / ml di penicillina G e 100 ug / ml di streptomicina.
    2. Cultura le cellule in atmosfera umidificata a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%.
    3. Lasciare crescita cellulare a concentrazioni tra 2 - 3 x 10 6 cellule / ml.
    4. Dividere le cellule due volte a settimana a una concentrazione iniziale di 0,3 x 10 6 cellule / ml (ad esempio, se la concentrazione cellulare è di 3 x 10 6 cellule / ml, trasferimento sospensione cellulare 1 ml in un pallone nuovo contenente 9 ml di mezzo fresco). Eliminare la cultura dopo 20 passaggi consecutivi.
  2. Cultura Linea pancreatico carcinoma a cellule
    NOTA: Mantenere la linea pancreatica cellule di carcinoma umano Panc-1 in 75 cm 2 fiasche di coltura in 10 ml di mezzo DMEM con elevato glucosio e L-glutammina supplementato con 10% siero fetale bovino e 100 unità / ml di penicillina G e 100 ug / streptomicina ml . La variante resistente ai farmaci, Panc-1R, viene coltivato nello stesso terreno di coltura contenente 1 mM gemcitabina disciolti in acqua sterile. Ulteriori dettagli sono forniti in 24.
    1. Coltivare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%.
    2. Dividere le celle ogni 2 - 3 giorni in un rapporto di 1: 5 quando le cellule raggiungere la confluenza di circa il 90%.
    3. Per dividere le celle, lavare il due volte con tampone fosfato (PBS), aggiungere 1 ml di tripsina / EDTA per 75 cm 2 pallone di coltura e incubare a 37 ° C per 3 min.
    4. Aggiungere 9 ml di mezzo e raccogliere le cellule staccate in un tubo da 15 ml. Seed sospensione cellulare 2 ml in una nuova conta pallonevorazio 8 ml di mezzo. Eliminare la cultura dopo 20 passaggi consecutivi.
  3. MTT Assay per cellule leucemiche
    1. Preparare in anticipo la soluzione MTT: sciogliere 500 mg di MTT formazan in 10 ml di PBS e mescolare (protetto dalla luce) con un agitatore magnetico per circa 1 ora. Sterilizzare la soluzione con un filtro di 0,22 micron. NOTA: La soluzione può essere conservato in aliquote da 10 ml a -20 ° C. Proteggere dalla luce diretta dopo lo scongelamento.
    2. Preparate in anticipo il isopropanolo acidificato: aggiungere 50 ml di 2 M HCl a 2,5 L di isopropanolo. NOTA: Conservare la soluzione per almeno un mese a temperatura ambiente prima dell'uso. Se l'isopropanolo non viene acidificata correttamente, potrebbe formare precipitati con il terreno e compromettere la lettura spettrofotometrica.
    3. Preparare un separato da 96 pozzetti a fondo piatto "giorno 0" (controllo) Piastra per garantire stima più accurata di inibizione della crescita: dedicare 3 a 6 pozzi per ogni linea cellulare, aggiungere 30 ml di crescitamedie e 120 ml di sospensione cellulare (8.000 celle) per ogni pozzetto e 150 ml di mezzo di crescita nei pozzetti corrispondenti a spazi (non le cellule). Procedere dal punto 1.3.9 al punto 1.3.13 di questa sezione per misurare la densità ottica (OD). NOTA: Ulteriori dettagli sono forniti in 4.
    4. Preparare un piatto sperimentale a 96 pozzetti a fondo piatto: dedicare 30 pozzi a concentrazioni di farmaco (10 concentrazioni, ciascuna in triplice copia), 10 pozzi per controllare le cellule e 10 pozzi per controllare mezzo senza cellule (spazi) e preparare una gamma di diluizioni di droga di desametasone ( Dex) utilizzando Dimetilsolfossido come solvente.
      NOTA: Per le cellule CEM-WT la gamma di diluizione Dex è tra 2 micron e 0,97 nM. Per le cellule CEM / R30dm, CEM-R5 e CEM-C3 la gamma di diluizione Dex è compresa tra 640 micron e 0,33 nM.
    5. Aggiungere 30 ml di ogni diluizione Dex in un pozzo all'interno della piastra a 96 pozzetti. Assicurati di includere ogni concentrazione in un triplice copia.
    6. Aggiungere 30 ml di terreno di coltura per benes corrispondente alle cellule di controllo e 150 ml di mezzo di crescita nei pozzetti corrispondenti a spazi vuoti.
    7. Raccolto in crescita esponenziale cellule e risospendere a loro concentrazione ottimale di semina.
      NOTA: Per determinare concentrazioni ottimali di cellule di partenza, si raccomanda di valutare il profilo di crescita di ciascuna linea cellulare linea cellulare in una piastra a 96 pozzetti da semina cellule a diverse concentrazioni e misurare quotidianamente per almeno 4 giorni. Scegli una concentrazione di semina che impedisce la crescita eccessiva di cellule dopo 72 ore, in quanto questo influenzerà l'esperimento saturando i valori OD. Per CEM-WT, CEM-C5 e CEM-R5 la concentrazione ottimale di semina è di 8.000 cellule / pozzetto, mentre per CEM / R30dm è di 5.000 cellule / pozzetto.
    8. Aggiungere 120 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto contenente sia la soluzione farmaco o mezzo di crescita (pozzetti corrispondenti alle cellule di controllo). Riempire i pozzetti esterni vuoti della piastra con 150 microlitri di PBS per assicurare una buona umidità nella piastra e incubare thpiastre e per 72 ore a 37 ° C con 5% di CO 2 in un incubatore di coltura cellulare.
    9. Aggiungere 15 ml di soluzione di MTT ad ogni pozzetto e agitare la piastra per 5 min con una piastra shaker fino ad un massimo di 900 frullati / min.
    10. Posizionare le piastre indietro a 37 ° C con 5% di CO 2 in un incubatore di coltura cellulare e incubare per altri 4 - 6 ore.
    11. Aggiungere 150 ml di isopropanolo acidificato in ogni pozzetto e mescolare bene con una pipetta multicanale per risospendere a fondo tutti i cristalli formazano. Inizia con i pozzetti del bianco e assicurarsi di lavare le punte bene prima di procedere ad un'altra riga della piastra.
    12. Incubare la piastra a temperatura ambiente (RT) per 10 min.
    13. Utilizzando un lettore di micropiastre, determinare la densità ottica a 540 e 720 nm per garantire una misurazione accurata correggendo per lo sfondo OD. Quindi salvare i dati in un file di foglio di calcolo e analizzarlo 4.
  4. SRB test per le cellule pancreatiche Carcinoma
    1. Sciogliere SRB reagente in acido acetico 1% a una concentrazione finale di 0,4% (w / v).
    2. Sciogliere acido tricloroacetico (TCA) in acqua ultrapura a una concentrazione finale di 50% (w / v).
    3. Sciogliere Tris (idrossimetil) -aminometano in acqua ultrapura a una concentrazione finale di 10 mM.
    4. Preparare un 96 pozzetti piastra inferiore di controllo "giorno 0" piatto separato per garantire stima più accurata di inibizione della crescita: semi di 6 pozzi con le cellule che crescono in fase esponenziale a 100 di media ml a una concentrazione semina appropriato e aggiungere 100 medie ml solo per pozzi corrispondenti a spazi vuoti. Incubare per una notte a 37 ° C con 5% di CO 2 per garantire la corretta adesione delle cellule alla piastra. Quindi aggiungere 100 microlitri di media a tutti i pozzetti e procedere ai passaggi 1.4.8 - 1.4.16 di questa sezione.
    5. Preparare un piatto sperimentale a 96 pozzetti a fondo piatto: le cellule del seme che cresce in fase esponenziale in triplice copia in 96 pozzetti piastre a fondo piatto alla densità appropriata in 100 ml di medium utilizzando una pipetta multicanale.
      NOTA: Per determinare concentrazioni ottimali di cellule di partenza, si raccomanda di valutare il profilo di crescita di ciascuna linea cellulare linea cellulare in una piastra a 96 pozzetti da semina cellule a diverse concentrazioni e misurare quotidianamente per almeno 4 giorni. Scegli una concentrazione di semina che impedisce la crescita eccessiva di cellule dopo 72 ore, in quanto questo influenzerà l'esperimento saturando i valori OD. Per le cellule Panc-1 e Panc-1R, la concentrazione ottimale di semina è di 8000 cellule / pozzetto.
    6. Aggiungere 100 microlitri medie e medio solo pozzetti e incubare una notte a 37 ° C con 5% di CO 2 per garantire la corretta adesione delle cellule alla piastra.
    7. Preparare una serie di diluizione farmaco di gemcitabina compreso tra 1 micron e 10 nM per Panc-1 e 1 mm e 100 nM per le cellule Panc-1R. Aggiungere 100 microlitri di ogni diluizione in un pozzo appropriata della piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale. Assicurarsi di avere ogni concentrazione in triplice copia. Inoltre,aggiungere 100 ml di media ai media solo pozzi e le cellule di controllo. Incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 per 72 ore.
    8. Aggiungere 25 microlitri soluzione TCA freddo ai pozzetti utilizzando una pipetta multicanale e incubare le piastre per almeno 60 min a 4 ° C per precipitare e fissare le proteine ​​al fondo dei pozzetti.
    9. Svuotare la piastra rimuovendo brevemente medio e secco su un tessuto.
    10. Lavare 5 volte con l'acqua del rubinetto, quindi svuotare il piatto e lasciare asciugare a temperatura ambiente.
    11. Aggiungere 50 soluzione SRB microlitri per pozzetto utilizzando una ripetizione-pipetta e colorare per 15 min a temperatura ambiente.
    12. Svuotare la piastra rimuovendo la macchia SRB.
    13. Lavare 4 volte con acido acetico 1%, quindi svuotare la piastra e lasciare asciugare a temperatura ambiente.
    14. Aggiungere 150 microlitri soluzione Tris per pozzetto utilizzando una pipetta multicanale e miscelare per 3 minuti su una piastra-agitatore fino ad un massimo di 900 frullati / min.
    15. Leggere la densità ottica a 540 nm (o 492 nm se tegli od i valori sono troppo alti).
    16. Analizzare i dati.
  5. Analisi dei dati per MTT e SRB saggi
    1. Calcolare i valori di OD di cellule a "giorno 0" con la seguente formula: OD Giorno 0 cellule = controllo OD - media pozzetti bianchi OD
    2. Calcolare la percentuale di cellule sopravvissute per ogni concentrazione di farmaco secondo la seguente formula:% di cellule trattate = [cellule trattate OD - media OD pozzetti del bianco - OD Giorno 0] Media / [cellule di controllo OD - media OD pozzetti del bianco - OD Day0] * 100
    3. Tracciare la curva dose-risposta (concentrazione di farmaco vs. inibizione della crescita in%).
    4. Calcolare la concentrazione del farmaco che inibisce la crescita delle cellule del 50% (IC 50) usando la curva dose-risposta.

2. Isolamento RNA e Biblioteca di preparazione per l'RNA-sequenziamento

  1. Esempio Collessione e RNA Isolation
    1. Per le cellule CEM: raccogliere 10 6 cellule direttamente dal terreno di coltura.
    2. Per Panc-1 e Panc-1R: rimuovere media, lavare le cellule due volte con PBS e staccare aggiungendo tripsina-EDTA e incubando a 37 ° C per 3 min. Aggiungere terreno di coltura e raccolto 10 6 cellule.
    3. Spin down campioni a 300 xg per 3 minuti, rimuovere il surnatante ed estrarre mRNA totale utilizzando disponibili in commercio a membrana di silice colonne di rotazione, seguendo il protocollo del fornitore.
    4. Determinare la concentrazione e la purezza di RNA totale utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis.
      NOTA: RNA è considerato di elevata purezza se il rapporto di assorbanza 260 nm / 280 nm è superiore a 1,8. I campioni possono essere conservati a - 80 ° C.
    5. Valutare l'integrità RNA totale mediante elettroforesi di 200 ng di campione 1% gel colorato con bromuro di etidio.
      NOTA: Il rilevamento di due bande intatte corrispondente mammiferi 28S e 18S rRNA approssimativamente2 kb e 1 kb di dimensioni è indicativa della buona integrità RNA totale.
  2. Sequencing Biblioteca Preparazione
    1. Utilizzare 2 mg di mRNA totale per ogni campione. Seguire protocollo di preparazione biblioteca mRNA secondo le istruzioni del produttore.
    2. Determinare la qualità e la concentrazione di ogni libreria usando un sistema bioanalyzer. Pool le librerie in un singolo campione fino ad una concentrazione finale di 10 nmol / L e misurare con bioanalizzatore.
    3. Usare il sistema di sequenziamento high-throughput con singola modalità di lettura di 100 bp.
      NOTA: Leggi lunghezza> 80 bp è necessaria per identificare le isoforme di trascrizione.

3. Rilevamento di splicing differenziale da Sequencing Legge

  1. Allineamento della Legge di riferimento genoma e di verifica della qualità
    1. Compilare un'annotazione gene (file .gtf) dalla tabella NCBI refGene utilizzando il browser tavolo UCSC (25,963 geni).
    2. Eseguireallineamento gapped annotazione-consapevole di sequenziamento legge al genoma di riferimento (GRCh37) utilizzando STAR.
    3. Ordina e indicizzare i file di allineamento risultanti con strumenti di Picard.
    4. Eseguire il controllo della qualità post-mapping utilizzando RSeQC e samtools.
  2. Differenziale splicing Detection tra gruppi campione
    1. Installare Python e le versioni corrispondenti di NumPy e SciPy. Scaricare e installare samtools. Scaricare e installare papillon e tophat,
    2. Aggiungere le directory Python, bowtie, tophat e samtools alla variabile d'ambiente PATH $. Scarica pre-costruito indici bowtie (hg19). Scarica RMATS versione 3.0.9.
      NOTA: Ulteriori dettagli su RMATS sono forniti in 19 e 34.
    3. Rilevare eventi di splicing alternativo confrontando ciascuna linea cellulare Dex-resistente ai CEM-WT e Panc-1 a Panc-1R in MATS separata corre secondo la figura 5A.
    4. Per rilevare eventi di splicing differenziale da previoamente Il sequenziamento allineato legge (file .bam), Mats gestito utilizzando i comandi dalla figura 5B per CEM-WT vs CEM- C3, CEM-WT vs CEM-R5, CEM-WT vs CEM / R30dm e Panc1 a Panc- confronti 1R.
      NOTA: MATS creerà una cartella di output con due file txt con risultati per tipo di anomalia splicing analizzati (SE - exon skipping, A5SS - alternativa 5 'sito di splicing, A3SS - alternativa 3' sito di splicing, MEX - esoni si escludono a vicenda e RI - ritenzione introni): un file contenente i risultati in base ai conteggi di giunzione solo e un secondo file con i risultati in base ai conteggi di giunzione e legge sul bersaglio. Inoltre, un file .txt supplementare con una panoramica risultato viene generato nella stessa cartella.
    5. Per SE, A5SS, A3SS e l'importazione RI per i fogli di calcolo i file txt in base ai conteggi di giunzione e legge sul bersaglio. Per MEX importare i file .txt basati su conta solo giunzione.
      NOTA: file di output MATS è ordinato per ascendente P-valori e contiene diversi parametri: ID gene, simbolo gene, Cromosomica e la posizione filo, coordinate genomiche dei frammenti splicing alternativo, conta così come la lunghezza di inclusione e saltando forme per entrambi i campioni analizzati, la lunghezza di inclusione e forma utilizzata per la normalizzazione, p-value, false discovery rate skipping (FDR ), livello di inclusione per ciascun campione sulla base di conteggi normalizzati e il punteggio differenziale inclusione (media (IncLevel1) - media (IncLevel2)).
    6. Selezionare statisticamente significativi geni candidati con un FDR <10% per l'ulteriore validazione (ad esempio, DDX5 e PKM2).
    7. Visualizza gli eventi di splicing alternativo con Integrativa Genomica Viewer (IGV, https://www.broadinstitute.org/igv/), come riportato in Figura 5.

4. validazione dei risultati mediante RT-PCR e qRT-PCR Assays

  1. disegno Primer
    NOTA: Al fine di fornire una validazione affidabile dei risultati ottenuti con il gasdotto bioinformatica, l'mRNA transcripts derivanti da eventi di splicing alternativo sono amplificati utilizzando RT-PCR e visualizzate mediante elettroforesi su gel di agarosio dei prodotti di PCR. Cyanine colorante verde come SYBR green test qRT-PCR viene utilizzato per quantificare giunzione specifiche varianti rispetto ad un gene housekeeping. Figura 7 illustra la strategia applicata per visualizzare il esone 12 skipping evento del gene DDX5 e di quantificare il escludono a vicenda esone 9 e esone 10 del gene PKM.
    1. Per il saggio RT-PCR, coppie di disegno primer ricottura per esoni costitutivi (esone 10 e esone 13) situati a monte ea valle dei siti di splicing alternativo (figura 7a).
      NOTA: La dimensione amplicone dovrebbe coprire tra 100 e 800 bp per garantire una netta separazione dei prodotti di PCR previsti su gel di agarosio. La temperatura di ricottura dei primer deve essere compresa tra 55 e 65 ° C e il contenuto GC non deve superare il 60%.
    2. Cyanine assay verde (Figura 7B).
      1. Controllare l'omologia di sequenza dei due esoni mutuamente esclusive e design due coppie di primer ciascuno dei quali specificamente e rileva esclusivamente una sola delle due varianti di splicing.
        NOTA: Per PKM, il primer inverso annealing to esone 11 comune ad entrambe le varianti, mentre i primer forward sono specifici variante e ricottura to esone 9 (PKM1) o esone 10 (PKM2).
      2. Al fine di rilevare DDX5 gene full-length, ricuocere il primer inverso all'interno del esone saltato (esone 12).
        NOTA: Per la rilevazione specifica della variante DDX5 ΔEx12, il primer inverso attraversa il confine exon11 / exon13. Utilizzare lo stesso primer forward che annealing a esone costitutiva 10 per entrambe le reazioni.
        NOTA: La dimensione amplicone deve essere compresa tra 80 e 200 bp.
  2. Prima strand cDNA Synthesis
    1. Impostare la trascrizione inversa di 1 mg di RNA isolato in cDNA utilizzando 200 / ml di Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) rever Use trascrittasi nel suo buffer di reazione diluito 1: 5 con acqua sterile. Aggiungere DTT 1 micron, 0,05 mg di esameri casuali, desossinucleotide mix (dNTP) 1 mm e 40 U / ml di inibitore della ribonucleasi.
    2. Vortex brevemente e incubare la miscela di reazione a 37 ° C per 2 ore.
    3. Incubare la miscela di reazione a 70 ° C per 5 minuti per inattivare la trascrittasi inversa, trasferiscono la miscela in ghiaccio e rallentano utilizzando una microcentrifuga. I campioni possono essere utilizzate immediatamente o conservate a - 20 ° C.
  3. RT-PCR Reazione e agarosio gel
    1. Impostare la reazione PCR in un tubo di PCR per ciascun campione mescolando 12,5 ml di concentrato 2x PCR mastermix, 1,25 ml di 10 mM forward primer e la stessa quantità per il primer inverso fino ad un volume finale di 25 ml con acqua sterile.
    2. Aggiungere 1 ml di cDNA per il mix e posizionare i tubi nel termociclatore. Eseguire il programma come segue: denaturazione iniziale: 95 ° C per 2 min.Ribadire i seguenti passaggi per 35 cicli: denaturazione a 95 ° C per 25 sec; annealing a 52 ° C per 35 sec; estensione a 72 ° C per 1 min. Impostare estensione finale a 72 ° C per 5 min.
    3. Preparare gel di agarosio 1% sciogliendo 1 g di agarosio in 100 ml 1x tampone TBE. Aggiungere 2,5 ml di bromuro di etidio alla soluzione. ATTENZIONE: il bromuro di etidio è cancerogeno, maneggiare con cura utilizzando una cappa.
    4. Caricare i campioni ed eseguire il gel in 1x tampone TBE a 100 V per circa 30 minuti in un sistema di elettroforesi.
    5. Rivela il gel con una macchina fotografica digitale UV e salvare l'immagine.
  4. qRT-PCR e analisi dei dati
    1. Impostare la reazione PCR verde Cyanine per ciascun campione mescolando 12,5 ml di 2x verde PCR Mastermix, 2 microlitri di 5 mM primer forward e lo stesso importo per il primer inverso fino ad un volume finale di 15 ml con acqua sterile in un tubo di PCR . Preparare una miscela per ogni giunzione specificavariante da rilevare (PKM1, PKM2, DDX5 figura intera, DDX5 ΔEx12) e per il gene housekeeping (GUS).
    2. Caricare il Mastermix su un bianco a 96 pozzetti e preparare i duplicati per ogni campione.
    3. Diluire il cDNA 10x in acqua, aggiungere 5 ml di ciascuna miscela e posizionare la piastra nel termociclatore. Eseguire il programma come segue: denaturazione iniziale: 95 ° C per 5 min. Ribadire i seguenti passaggi per 45 cicli: denaturazione a 95 ° C per 10 sec; ricottura a 58 ° C (per DDX5 e DDX5 ΔEx12 mescola) o 60 ° C (per PKM1 e PKM2 mix) per 20 sec. Impostare estensione finale a 72 ° C per 20 sec. Impostare melting curve applicando un gradiente dal 65 al 97 ° C.
    4. Per valutare la specificità dei set di primer per il bersaglio, controlla le curve di fusione e di verificare che un singolo picco è formato per ogni set di primer.
    5. Calcolare i secondi valori derivati ​​delle curve di amplificazione ed esportare i valori di soglia ciclo (Ct).
    6. Calculate livelli di espressione relativi (REL) della giunzione mRNA varianti rispetto alla pulizia GUS (riferimento) gene in ogni campione utilizzando il metodo "delta Ct (ΔCt)". La formula è: rel = 2 - ΔCt, dove ΔCt = Ct bersaglio giunzione variante - gene di riferimento Ct
    7. Al fine di quantificare l'abbondanza relativa di varianti di splicing, calcolare il rapporto REL utilizzando la formula: Rapporto REL ratio = REL giunzione variante 1 / REL giunzione variante 2.

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Risultati

I saggi di citotossicità descritti nel protocollo forniscono un metodo affidabile e robusto per valutare la resistenza delle cellule tumorali agli agenti chemioterapici in vitro. Per mezzo del saggio MTT, sensibilità alla Dex è stata determinata in quattro linee T-ALL cellulari, comprese le cellule parentali CEM-WT Dex-sensibili, e tre sublines Dex-resistenti: CEM / R30dm, CEM-R5 e CEM-C3. Due diversi intervalli di concentrazione dovevano essere utilizzati a causa della grand...

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Discussione

Qui si descrive un nuovo approccio che combina tecniche di screening di citotossicità consolidate e potente trascrittomica NGS a base di analisi per identificare eventi di splicing differenziali in relazione alla resistenza ai farmaci. Analisi spettrofotometriche sono metodi high-throughput convenienti e affidabili per valutare la sensibilità ai farmaci in modelli tumorali in vitro e rappresentano la prima scelta per molti laboratori che effettuano proiezioni di citotossicità. Risoluzione dei problemi così ...

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Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Riconoscimenti

The authors would like to acknowledge prof. J.J. McGuire, prof. R. Kofler and dr. K. Quint for providing the resistant cell lines used in this work. The study has been founded by grants from Cancer Center Amsterdam (CCA) Foundation (to JC, EG and RS), the KiKa (Children Cancer-free grant for AW) foundation, the Law Offices of Peter G. Angelos Grant from the Mesothelioma Applied Research Foundation (to VEG and EG), Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), Istituto Toscano Tumori (ITT), and Regione Toscana Bando FAS Salute (to EG).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Sulforhodamine BSigma-Aldrich230162
Trichloroacetic acidSigma-Aldrich251399
CCRF-CEMATCC, Manassas, VA, USAATCC CCL-119
Panc-1ATCC, Manassas, VA, USAATCC CRL-1469
DMEM high glucoseLonza, Basel, Switzerland12-604F
RPMI-1640 Gibco, Carlsbad, CA, USA11875093
Fetal bovine and calf serumGreiner Bio-One, Frickenhausen, Germany758093
penicillin G streptomycin sulphateGibco, Carlsbad, CA, USA15140122
Tris(hydroxymethyl)-aminomethaneSigma Aldrich252859
MTT formazanSigma AldrichM2003
Anthos-Elisa-reader 2001Labtec, Heerhugowaard, NetherlandsUV-Vis 96-well plate spectrophotometer
Greiner CELLSTAR 96 well platesGreiner/SigmaM0812-100EA
Trypsin/EDTA Solution 100 mlLonza, Basel, SwitzerlandCC-5012
CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany82051-074
CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany82050-856
Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%)B.Braun Melsungen AG, Germany362 3140

Riferimenti

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