Automated quantificazione e analisi di procedure di conteggio delle cellule Uso ImageJ Plugin

Riepilogo

This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.

Abstract

L'Istituto Nazionale di ImageJ di salute è una potente suite di software, liberamente disponibile l'elaborazione delle immagini. ImageJ ha algoritmi di analisi delle particelle complete che possono essere utilizzati in modo efficace per contare varie particelle biologiche. Quando il conteggio gran numero di campioni di cellule, l'emocitometro presenta un collo di bottiglia per quanto riguarda il tempo. Allo stesso modo, contando le membrane da saggi di migrazione / invasione con la ImageJ plug cellulare contatore, anche se precisa, è il lavoro eccezionalmente intenso, soggettiva, e famoso per causare dolore al polso. Per rispondere a questa esigenza, abbiamo sviluppato due plugin all'interno ImageJ per il solo compito di emocitometro automatizzata (o volume noto) e il conteggio delle cellule migrazione / invasione. Entrambi i plugin si basano sulla capacità di acquisire micrografie di alta qualità con il minimo di sfondo. Sono facili da usare e ottimizzato per il conteggio rapido e l'analisi di campioni di grandi dimensioni con strumenti di analisi integrati per aiutare la calibrazione dei conteggi. Combinando il principio di bases of Cell Contatore con un'analisi automatizzata algoritmo di conteggio e post-conteggio, questo aumenta notevolmente la facilità con cui saggi di migrazione possono essere elaborati senza alcuna perdita di precisione.

Introduzione

Nel conteggio delle cellule in vitro è un'importante tecnica di base in una vasta gamma di esperimenti di coltura tissutale. Accuratamente determinare il numero di cellule in una coltura è essenziale per la riproducibilità sperimentale e standardizzazione ^1,2. Conteggio cellulare può essere eseguita manualmente utilizzando un emocitometro e utilizzando una varietà di metodi automatizzati, ciascuno con i propri vantaggi e svantaggi ^3,4,5. La maggior parte dei metodi automatizzati per il conteggio delle cellule appartengono ad una delle due classi, quelli che utilizzano il principio Coulter o citometria a flusso. Contaglobuli sfruttano cellule resistenza elettrica per determinare il numero di cellule e le dimensioni. Sono veloci, accurati e più economico rispetto citometri a flusso. Tuttavia, essi sono raramente utilizzati solo per il conteggio delle cellule a causa del loro costo considerevole rispetto al conteggio manuale ^3. Flusso citometri, d'altra parte, sono costosi ma hanno molte applicazioni, come il conteggio delle cellule, analisi della forma cellule, structure e cella di misura interna marcatori ^4,5. Le macchine che utilizzano uno di questi due principi sono disponibili da molti produttori. Conteggio manuale è conveniente, ma richiede tempo e soggetto a bias mentre i metodi automatici sono dotati di una frazione del tempo richiesto per il conteggio manuale, ma utilizzando macchine costose ^6.

Altre procedure di coltura cellulare comune ha in saggi di motilità cellulare in vitro, vale a dire, la migrazione cellulare e dell'invasione ^7. saggi di migrazione e invasione sono comunemente usati per studiare la motilità cellulare e invasività in risposta ad una risposta chemiotattica. Inoltre, essi sono ampiamente utilizzati per studiare lo sviluppo embrionale, la differenziazione, la risposta infiammatoria, e le metastasi di più tipi di cellule ^7-11. Le cellule che sono migrati o invaso attraverso la membrana porosa di un saggio di migrazione possono essere quantificati in due modi diversi. In primo luogo, colorando le cellule con un colorante fluorescente, dissociazione from la membrana, e la quantificazione usando un lettore di fluorescenza ^12. Una limitazione di questo metodo di quantificazione è che nessun record può essere conservato delle membrane e non vi è alcuna possibilità per ulteriori analisi ^13. Il secondo metodo di quantificazione è per migrato / celle da fissi e colorati con colorante fluorescente o più comunemente, con coloranti citologici, come violetto di cristallo, toluidina colorante blu o ematossilina invaso; quindi le cellule vengono quantificati utilizzando manualmente immagini microscopiche invertite di queste membrane che è un compito molto tempo ^12,13.

Per superare gli inconvenienti di conteggio manuale delle cellule, sono stati sviluppati due contatori di cellule automatizzati affidabili ed accurate per concentrazione cellulare e per il dosaggio di migrazione. Questi algoritmi automatizzati contatore di cellule sono stati sviluppati per ImageJ come plugin usando il linguaggio del computer Java di Oracle. ImageJ è uno strumento di elaborazione immagine pubblica e diffuso sviluppato dal National Institute of Health (NIH) ^14,15; in tal modo, scrivendo questi plugin per ImageJ facilita l'integrazione nella comunità biologica.

Automazione del conteggio delle cellule assicura un throughput elevato e riproducibilità rispetto al conteggio manuale. Anche se altri software e plug-in disponibili possono essere utilizzati per calcolare la concentrazione cellulare attraverso l'analisi delle immagini ^5,16,17, cellulare Concentrazione calcolatore di plug-in è veloce e può anche gestire diluizioni di cellule e trattamenti. Inoltre, tutti i risultati ei calcoli di questi due contatori possono essere salvati ed esportati. I due plugin descritti nel presente documento sono ottimizzate per l'impiego di un microscopio a contrasto di fase per l'imaging cellulare dal vivo e ampio campo di vista (cattura tutta la membrana) di imaging per membrane dosaggio migrazione attraverso l'uso di un ambito dissezione. I plugin sono liberamente disponibili per il download con le istruzioni di installazione da: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

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Protocollo

1. Microscopio e Camera Setup (Cell Concentrazione Calculator)

1. Aumentare la lampadina luminosità completa con la manopola di regolazione della luce, passare alla lente dell'obiettivo 4X, e garantire filtri contrasto di fase vengono selezionati.
   NOTA: Qualsiasi microscopio a contrasto di fase invertito per coltura di tessuti con uno sfondo scuro, ad esempio, PHP fase di contrasto, può essere utilizzato seguendo le procedure del microscopio e della fotocamera standard.
2. All'interno del software del microscopio, impostare le impostazioni di cattura di immagini ai valori predefiniti.
   NOTA: Vedere manuale d'uso del microscopio per trovare la posizione di queste impostazioni.
   1. Set 'luminosità', 'contrasto', e 'la saturazione' al 100% e 'gamma' e 'guadagno' a 1,0.
      NOTA: A seconda del software, 'luminosità' e 'contrasto' possono default un valore di 0% invece del 100%.
   2. Set di catturare fotografie in bianco e nero con la più alta risoluzione dispone (1.600 x 1.200 pixel (px) o superiore).
      NOTA: A 'saturazione' di 0% è sufficiente se un ambiente in bianco e nero non è disponibile.
3. Posizionare un emocitometro serie sul palco microscopio e catturare un'immagine come illustrato nella (Figura 1A); questa è l' 'immagine del volume di calibrazione'. Regolare i tempi di esposizione, come richiesto.

2. Immagine Volume calibrazione

1. Aperto ImageJ e dal menu plugin, avviare la concentrazione delle cellule calcolatore (CCC) plug-in, ad esempio, Plugin> Analyzer> 'cellulare Concentrazione Calculator'.
   1. Se il pannello di destra 'immagine di volume calibrazione' non è visibile, fare clic su 'Calibra' di mostrarlo.
2. In ImageJ, aprire l' 'immagine di taratura del volume' dal punto 1.3 ( 'File'> 'Apri') e CCC clic sul pulsante 'Get Immagine Dimension'.
   NOTA: Questo riempirà sia in Larghezza immagine ecaselle di testo Altezza con la risoluzione dell'immagine in pixel automaticamente.
3. In ImageJ, selezionare il 'Tool Straight Line' accanto agli strumenti di selezione e di disegnare una linea retta per tutta la lunghezza del emocitometro primario (P) L'incontro dimostrato nella (Figura 1B) facendo clic e trascinando il cursore.
   1. Premere il tasto 'M' per visualizzare la finestra di risultati con le misurazioni linea retta. Digitare il valore della colonna lunghezza nella casella di testo 'P-square Lunghezza' a CCC (Figura 1B).
   2. Fare clic sul pulsante 'Calcola Immagine Volume' per l'uscita del volume dell'immagine nella casella di testo Immagine Volume. In alternativa, se il volume di questa immagine è già noto, digitare il volume in nL nel box immagine Volume.
4. Fare clic sul pulsante 'Salva'.
   NOTA: Il plugin è calibrato.

3. Camera Calibration Esposizione

1. A seguito di raccolta di cellule percontando via emocitometro, carico di 10 ml di cellule in una camera del emocitometro e posizionarlo sul palco microscopio.
2. Utilizzando le stesse impostazioni dal punto 1.2, regolare il tempo di esposizione in modo che le linee del emocitometro sfondo scompaiono.
   1. Regolare la messa a fuoco in modo che l'interno delle cellule è più scura della membrana cellulare, indicando fuoco all'interno della sezione centrale della cella e non i poli.
   2. Ulteriore regolare l'esposizione in modo che le cellule non sono sovraesposte e simili a quelli raffigurati nella (Figura 1C).
      NOTA: le linee emocitometro leggermente visibile sono accettabili. Si consiglia di salvare o registrare le impostazioni per mantenere la precisione e riproducibilità.

4. Acquisizione di immagini

1. Per ogni campione di cellule, carico di 10 ml in entrambe le camere del emocitometro per aumentare la potenza inferenza statistica ^2. Posizionare il emocitometro sul palco microscopioper l'imaging.
   NOTA: La risoluzione e l'ingrandimento di ogni immagine deve essere lo stesso del 'immagine di calibrazione Volume'. Il plugin conta tutte le immagini di qualsiasi cartella selezionata; tenere immagini per essere conteggiati insieme nella stessa cartella.
   1. Se una funzione di incremento automatico il nome del file è disponibile, accenderlo e assicurarsi che ogni immagine non viene mostrata dopo la cattura per aumentare il throughput.
      NOTA: il salvataggio e la chiusura di ogni immagine sarà drasticamente rallentare il processo manualmente. Fare riferimento al manuale utente del microscopio per informazioni sulla disponibilità di una funzione di auto-incremento.
   2. Cattura almeno tre immagini che non si sovrappongono della regione centrale del emocitometro anche se più (5-10) si raccomanda di aumentare la precisione.
      NOTA: evitare sia la parte superiore e di quella inferiore delle camere come cellule tendono ad aumentare in densità a entrambe le posizioni. Prendere lo stesso numero di immagini per ogni camera. Questo è necessario per il corretto funzionamento del plugin durante il conteggio.

5. Conteggio immagine e diluizioni

1. In CCC, clicca su 'Conte cellule' e osservare la finestra di dialogo Scegli directory. Selezionare una cartella da contare.
2. Osservare la casella di inserimento numero del campione dopo aver selezionato una cartella. Inserire il numero di immagini scattate per camera, per esempio, 4.1.2, e fare clic su 'Ok'. Il plugin sarà ora contare tutti i JPG, TIFF e PNG nella cartella selezionata in ordine alfabetico.
   NOTA: Facendo clic sul pulsante 'Sample Viewer', si apre la finestra di visualizzazione di esempio che visualizza le informazioni sui campioni contati. concentrazione del campione è la concentrazione media di tutte le immagini scattate per ogni camera. I campioni con concentrazioni senza unità possono essere aggiunti a questo elenco, come l'aggiunta di un farmaco o trattamento molecola piccola.
   1. Raccontare le campioni di cellule se le concentrazioni variano in modo significativo entro i conteggi degli stessi campioni (sezione 4).
      NOTA: Per calcolare diluizioni per ogni tcontò-campioni, CCC utilizza automaticamente la formula C ₁ V ₁ = C ₂ V _2.
3. Utilizzare lo scenario di semina 15.000 cellule per 200 ml in 30 pozzetti di una 96-pozzetti + 1 extra:
   1. Impostare la casella di testo a destra dell'etichetta C2 a 15.000 e la concentrazione volumetrica casella di testo a 200, cambiando l'unità casella combinata adiacente 'microlitri'.
      NOTA: Il plugin in ultima analisi, calcolare la concentrazione di cellule / ml.
   2. Assicurarsi che la casella combinata volume è selezionato V2 (volume finale) e nella casella di testo a destra digitare 6200 (200 pl x (30 + 1)), selezionando 'microlitri' nella casella combinata unità di volume.
4. Fare clic su 'Calcola diluizione' per aggiungere la diluizione attualmente inserito nella casella in basso a sinistra lista.
   NOTA: per ogni diluizione aggiunta, sarà risolto per ciascun campione e visualizzato nel diagramma ad albero a destra. Fare doppio clic su ogni voce di espandersi.
5. Facendo clic su tegli pulsante 'Salva' sotto il pulsante 'Sample Viewer' per scrivere su file tutti i dati del campione e diluizioni.
6. NOTA: questi dati possono essere recuperati in qualsiasi momento facendo clic su 'Carica' e selezionando il file salvato.

6. Migrazione e Invasion (contatore)

1. Eseguire i saggi di migrazione e l'invasione usando il metodo standard camera di Boyden ^7-9.
2. Dopo che le cellule sono migrate / invaso, rimuovere con attenzione i media all'interno dell'inserto capovolgendo e delicatamente toccando. Stoppino via qualsiasi supporto eccesso aderito al fondo della membrana toccando il bordo di un tovagliolo di carta.
   NOTA: Non toccare la membrana stessa per l'asciugamano, questo può staccare le cellule aderito.
3. Fissare e macchiare le cellule come riportato ^7-9 in un 24-pozzetti impostato con ogni riga contenente ~ 500 ml di una soluzione diversa, ad esempio, fissativo, Stain 1, 2 Stain e acqua bidistillata (DDH ₂ O). Riempire un secondo piatto con PBS 1x to posizionare gli inserti in prima del taglio.
4. Lavare gli inserti mettendoli in pozzi pieni di DDH ₂ O e riempire l'inserto con DDH ₂ O. Scaricare l'acqua prima di tampone via le cellule per inversione.
5. Utilizzare un applicatore di cotone pulito per rimuovere le cellule non-migrati / un-invaso dalla parte superiore della membrana avendo cura di non danneggiare la membrana. Essere approfondita intorno ai bordi della membrana.
6. Tagliare la membrana utilizzando un rasoio o un bisturi e con attenzione trasferire la membrana (in basso rivolta verso l'alto) su un vetrino pulito.
7. Aggiungere una piccola goccia di soluzione di montaggio sotto e sopra della membrana e coprire con un sottile vetrino.
   NOTA: Evitare di inglobare bolle all'interno della soluzione di montaggio per preservare la precisione dei conti.

7. dissezione Campo di applicazione e Camera Setup

1. Accendere la sorgente luminosa del microscopio e della fotocamera.
   NOTA: consultare il manuale del microscopio per le istruzioni dettagliate.
2. spiritohin software, impostare le impostazioni di cattura l'immagine del microscopio ai valori predefiniti.
   NOTA: Se è presente una funzione di media, si consiglia un valore di quattro. Questo è un buon compromesso tra il grado di compensazione e acquisizione dell'immagine tempo. Allo stesso modo, un piccolo grado di nitidezza dell'immagine può aumentare la fedeltà.
   1. Set 'luminosità', 'contrasto', e 'la saturazione' al 100% e 'gamma' e 'guadagno' a 1,0.
      NOTA: A seconda del software, 'luminosità' e 'contrasto' possono default un valore di 0% invece del 100%.
   2. Set di visualizzazione (in tempo reale) e la risoluzione di cattura ai valori massimi (1.600 x 1.200 px e 2.592 x 1.944 px, rispettivamente).
      NOTA: Risoluzione display può essere regolato come richiesto se la frequenza di aggiornamento è troppo lento. risoluzioni più basse renderà più difficile mettere a fuoco con precisione, ma di aumentare la frequenza di aggiornamento.
3. Per la fase del campo di applicazione dissezione, utilizzare un solido bianco background; un fondo nero o vetro è insufficiente.
4. Utilizzare la fonte di luce sopra stadi, preferibilmente da due luci flessibili del LED a destra ea sinistra del palco.
   NOTA: A seguito stadi sorgente di luce illuminerà i pori all'interno della migrazione saggio membrana che possono influenzare negativamente la precisione dei conteggi successivi.
5. Posizionare un vetrino membrana test di migrazione completato sul palco. Guardando l'immagine in tempo reale visualizzato dal software a regolare l'ingrandimento con la manopola di regolazione zoom in modo che i bordi di una sola membrana sono solo all'interno del campo visivo della telecamera.
   NOTA: Posizionare la diapositiva su una lastra di vetro sovrastano il bianco fase sfondo rende più facile da manovrare il vetrino per l'imaging.
6. Regolare le posizioni di luce sorgente (7.6.1) e tempi di esposizione per riprodurre il più fedelmente possibile l'immagine ideale della Figura 2A. A seconda della luminosità, tempi di esposizione di 5-60 ms dovrebbe essere sufficiente.
   NOTA:L'obiettivo è di produrre un'immagine con poco colore di sfondo come possibile e una membrana illuminata uniformemente senza ridurre fedeltà di immagine, cioè, sovraesposizione portando ad una perdita di cellule visibili.
   1. Posizionare le sorgenti luminose a sinistra ea destra ad un angolo basso rispetto alla slitta. Ciò contribuirà a rimuovere sfondo macchia e le aberrazioni cromatiche. Cercate di mantenere ogni fonte di luce di fronte all'altro.
      NOTA: Durante la manovra ogni fonte di luce in posizione, porgere l'altra fuori. Questo aiuta a centrare la zona di illuminazione sulla membrana stessa più facilmente e con precisione.
7. Rimuovere il vetrino e bilanciamento del bianco l'immagine utilizzando un solo clic nel software microscopio.
   NOTA: Il microscopio è calibrato. Salvare il maggior numero possibile di impostazioni per un utilizzo futuro e prendere atto delle posizioni sorgente luminosa e intensità.

8. Acquisizione di immagini e flatfield

1. All'interno del software, impostareil percorso della cartella di cattura, e la cattura un'immagine per membrana. Nome le immagini seguendo il modello generale: Nome - ###, ad esempio, il controllo - 001.tif, controllo - 002.tif, test di droga - 001.tif, e così via.
   NOTA: Per ottenere i migliori risultati di immagini, salvare il tipo di file immagine come TIFF rispetto ad altri formati lossy, come jpeg.
   NOTA: Le immagini non seguono il modello generale sarà ancora essere contati, ma non saranno soggetti a raggruppamento automatico e fielding piatta.
   1. Se la correzione flatfield si desidera, per ogni diapositiva trovare un'area vuota e prendere una immagine in bianco seguendo la convenzione di denominazione: Nome - Blank.
      NOTA: A vuoto è un'area della diapositiva che non contiene la membrana e rappresenta la retroilluminazione.
   2. Immediatamente prima di imaging, appiattire ogni membrana applicando una pressione sul vetrino e rimuovere il maggior numero di bolle più possibile.
2. In ImageJ, andare al Plugin e aprire il plugin TC; ad esempio, Plugin> Analizza> & #39; Transwell contatore '.
3. All'interno di TC, fare clic sul pulsante 'flatfield' e osservare la finestra di dialogo Scegli directory. Selezionare la cartella dove sono state salvate le immagini della membrana.
   NOTA: Solo le immagini salvate con il modello generale di cui sopra verrà flatfield automaticamente corretto e salvato in una nuova cartella denominata flatfield all'interno della cartella scelta. Vedere Figura 2B per un esempio di un'immagine flatfield corretta.

9. Impostazioni di configurazione

1. Aprire l'immagine membrana un test di migrazione in ImageJ ( 'File'> 'Apri') e selezionare Immagine> Regola> 'Soglia colori ...'. Osservare la finestra Soglia colore per regolare quali colori saranno filtrati dell'immagine.
   1. Nella parte inferiore della finestra, impostare il metodo Soglia di 'Shanbhag', colore Soglia di 'White', e lo spazio colore per 'RGB' (rosso verde blu); Sfondo scuro deselezionare se selezionati.
   2. Regolare la parte superiorecursori cliccando e trascinando i marcatori a 0 e gli slider inferiore a 255 (lasciare i cursori di fondo a 255). Assicurarsi che l'immagine è completamente bianca.
2. Regolare i migliori cursori verde e rosso fino a quando solo i nuclei sono visibili.
   NOTA: Le impostazioni selezionate varierà interamente dalla macchia cella utilizzata. Vedere la figura 2C.
3. Nel plug-TC, inserire i valori RGB dei migliori cursori in 'RGB' Soglia caselle di testo le impostazioni di configurazione associati. Fare clic sul pulsante 'Aggiungi / Modifica' e sovrascrivere la configurazione.
   1. Lasciare la dimensione valori intervallo inferiore e superiore ad 1 - Infinity.
4. All'interno del pannello di impostazioni di configurazione, cliccare su 'Salva' di scrivere le impostazioni sul disco rigido.

10. Immagini di conteggio e di calibrazione

1. Aprire il plugin TC (8.2) e cliccare su 'Conte Cartella' e osservare la finestra di dialogo Scegli directory. Selezionare la cartella da contare unND aspettare che finisca.
2. Ogni campione contato viene automaticamente aggiunto alla tabella principale. colonne chiave sono 'Conte', 'Qualità', e 'Calibrare?'.
   NOTA: Il conte non calibrato è il numero di particelle per membrana all'interno della zona visualizzato nella colonna 'gamma Area'.
   NOTA: La qualità varia da circa -0.8 a 1.7; Q ≥ 0,5 è accettabile.
   1. Osservare un segno di spunta nella 'Calibrate?' colonna se l'immagine è in posizione di calibrazione in base alla sua somiglianza con le metriche ideali.
      NOTA: la qualità e la calibrazione può suggerire che le impostazioni correnti sono forse insufficienti. Se, dopo aver corretto 'Colore Thresholding' e 'Dimensioni Ranges' sono stati selezionati e la calibrazione è ancora suggerito, l'ispezione degli originali e contò immagini dovrebbero essere il fattore determinante finale di un conteggio valido.
3. Selezionare tutti i campioni nella tabella contrassegnato per la calibrazione.
   1. Fare clic destro in tegli tabella e selezionare Recount> 'dimensione suggerita'. Questo racconterà le immagini con una superficie di particelle minimo suggerito.
   2. fare nuovamente clic destro e selezionare 'Mostra Plot'. Osservare il grafico a dispersione frequenza delle aree delle particelle. L'immagine ideale avrà un grafico simile a una distribuzione normale lunga coda di destra, cioè, la curva a campana. Vedere la Figura 3B.
   3. Regolare la gamma di dimensioni inferiori, se richiesto, selezionando il campione, clic destro, e selezionando Recount> "Impostazioni manuali. Osservare la finestra delle impostazioni manuali. Inserire le impostazioni desiderate e fare clic su Conte per raccontare l'immagine con le nuove impostazioni.
4. Per regolare i conti manualmente, selezionare i campioni, a destra cliccando sul tavolo, e selezionare 'immagine aperta con i conteggi'. Osservare l'immagine originale con indicatori rossi che rappresentano ogni particella contati dal plugin.
   NOTA: Recount> 'Mostra contato immagine binaria' può essere utile per verificare quanto bene icellule ndividual vengono risolti dalla soglia colore.
   1. Per aggiungere un conteggio, tenere 'Ctrl' e click sinistro. Osservare un marcatore nella posizione del cursore che verrà aggiunto ai campioni conteggio totale. Per rimuovere un marcatore, fate clic destro sull'immagine. Il plugin rimuoverà il marcatore più vicino al cursore.
   2. Per rimuovere un gruppo di marcatori, utilizzare uno strumento di selezione in ImageJ per selezionare una regione di interesse (ROI). Tenendo 'Ctrl', fare clic destro sull'immagine e saranno rimossi tutti gli indicatori all'interno della ROI. Osservare il numero di cella nella colonna 'Conte'.

11. Risparmio / Apertura risultati ed esportazione in formato CSV

1. In TC, andare alla barra dei menu e fare clic su 'File'> 'Salva risultati'. Osservare la finestra di dialogo Risultati Salva. Scegliere un nome e la destinazione e cliccare su 'Salva'.
   1. Utilizzare 'File'> 'i risultati di Open' per caricare un file contenente tutti i dati visualizzati nella tabella principale, sapg la trama.
      NOTA: il file dei risultati consente di risparmiare le directory le immagini vengono salvate in Se le immagini originali vengono spostati dopo il salvataggio, l' 'immagine originale Open' e 'immagine aperta con conta "funzioni fallirà..
   2. Per ripristinare la directory delle immagini, selezionare i campioni, fare clic destro del tavolo, e selezionare 'Reset directory dell'immagine'. Osservare la finestra di dialogo Scegli directory. Selezionare la nuova cartella e se sono presenti le immagini, le directory verranno ripristinate. Re-salvare il file dei risultati.
2. Per salvare un file di valori separati da virgola (CSV), nella barra dei menu vai a 'File'> 'Esporta in .csv'. Questo produce un file con i campioni organizzati in gruppi statistici con la media contare e di errore standard della media; il suo layout è stato progettato per una rapida rappresentazione grafica nei programmi di grafici comuni.
   NOTA: I gruppi statistici sono basati sui gruppi creati all'interno TC.
   1. Se i campioni seguono il modello generale di denominazione, selezionare i campioni da grouped, fare clic destro e selezionare 'Auto raggruppamento'. Questo aggiunge campioni con lo stesso 'Nome' allo stesso gruppo. Utilizzando l'esempio di controllo - 1, di controllo - 2, trattamento - 1, Trattamento - 2: entrambi i controlli sarebbero stati aggiunti al gruppo 'di controllo' e trattamenti per 'trattamento'.
   2. Aggiungere campioni manualmente per gruppi con un doppio clic cellulare e digitando del campione 'Gruppo' nel nome del gruppo. Selezionare i campioni da aggiungere a questo gruppo, fare clic destro e selezionare 'Aggiungi gruppo'.

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Risultati

Calcolatrice cellulare Concentrazione

La figura 1 presenta il processo globale di calibrazione CCC e l'acquisizione di immagini numerabile. Figura 1A e 1B rappresentano l'immagine di calibrazione P-Square e calcolo della lunghezza del P-square in pixel. CCC determina concentrazione cellulare in un dato volume utilizzando la formula:

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Discussione

Passaggi critici, risoluzione dei problemi e limitazioni

La natura stessa di metodi computazionali automatizzati, in particolare quelle di analisi delle particelle, richiede la capacità matematiche per definire queste particelle. Di conseguenza, la precisione di entrambi Calcolo cellulare Concentrazione e contatore dosaggio migrazione majorly dipende fedeltà dell'immagine, cioè quanto strettamente l'immagine catturata assomiglia membrana campione cellulare o dosaggio migrazione. È q...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 - With L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3002702	Cell culturing media
Fetal bovian serum (FBS)	GIBCO BRL	P00015	Media suppliment
HTR8/SVneo trophoblast cell line	Cells were obtained from Dr. Charles Graham (Queen’s University, Kingston, Canada)		Software is designed to work with any cell line.
Trypsin	GIBCO BRL	27250-018	Prepared as 0.20% (w/v) in 10 µM EDTA 1x PBS
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
10 cm cell culture plates	SARSTEDT	833902	Any tissue culture treated plates will be suitable
Transwell Polyester Membrane Inserts - 8.0 µm Pore size	Costar 3422 ordered from Fisher Scientific	7200150	For 24-well plates; Pore size: 8.0 µm; 6.5 mm diameter; 0.33 cm2 growth area
HARLECO Hematology Stains and Reagents, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3	EMD Millipore and ordered from VWR	65044A, B, & C	Hemacolor stain set consists of three 500 ml (16.9 oz.) poly bottles & includes a methanol fixative (Solution 1), an eosin or acid stain (Solution 2), and a methylene blue or basic stain (Solution 3)
Cotton Tipped Applicator	Puritan Medical	806-WC
Single-edge industrial razor blades	VWR	55411 - 055	Thickness: 0.30 mm (0.012")
Microscope Slides - Precleaned/Plain	Fisher Scientific	12550A3	Dimentions: 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Fisherbrand Cover Glasses - Rectangles no. 1	Fisher Scientific	12-545E	Thickness: 0.13 to 0.17 mm; Size: 50 mm x 22 mm
Fisher Chemical Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500
Leica Stereo dissecting microscope	Leica Microsystems		The microsope is equipped with Leica microscope camera Model MC170 HD & camera software is Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Microscope parts:  LED3000 Spot Light Illumination Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Objective achromat 1.0X, WD=90 mm Model: MOB306 & Objective achromat 0.32X, WD=303 mm Model: MOB315, Video Objective 0.5X Model: MTU-293
Hemacytometer	Assistant Germany		0.100 mm Depth - 0.0025 mm2
Olympus inverted light microscope	Olympus Corporation	CKX41SF	The microsope is equipped with Lumenera Infinity 1-2 2.0 Megapixel CMOS Color Camera & camera software is Infinity analyze Version 6.5.2
Laminar flow cabinet 1300 Series A2	Thermo Scientific	Model: 1375	Any laminar flow cabinet for cell culture work will be suitable
Cell culture incubator	Thermo Scientific	Model: 370	Any cell culture incubator will be suitable - Cells were cultured under humidefied environment, 5% CO2, 37 °C
ImageJ	NIH	Version 1.50e	Minimum version required
Java Runtime Environment	Oracle	Version 1.8.0_66	Minimum version required