Zika Virus System infettiva coltura cellulare e la<em&gt; In Vitro</em&gt; Effetto profilattico di interferoni

Riepilogo

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Abstract

Zika Virus (ZIKV) è un patogeno emergente che è collegato a anomalie dello sviluppo fetale, come la microcefalia, difetti dell'occhio, e la crescita compromessa. ZIKV è un virus a RNA della famiglia Flaviviridae. ZIKV è trasmesso principalmente dalle zanzare, ma può anche essere diffuso da materna a trasmissione verticale del feto, così come il contatto sessuale. Fino ad oggi, non ci sono trattamenti o vaccini opzioni affidabili per proteggere quelli infettati dal virus. Lo sviluppo di un sistema di coltura cellulare riproducibile, efficace virus Zika infettiva è critico per studiare i meccanismi molecolari di replicazione ZIKV così come farmaci e vaccini sviluppo. A questo proposito, un protocollo che descrive una in vitro Zika sistema di coltura di cellule di mammifero basata virus per virale analisi produzione e la crescita è riportata qui. Dettagli sulla formazione di placche da virus Zika su un monostrato di cellule e saggio di placca per misurare titolo virale sono presentati. cinetica replica genoma viralee doppio filamento di RNA genomici intermedi replicatory sono determinati. Questa piattaforma coltura è stata utilizzata per lo schermo da una libreria di un piccolo gruppo di citochine conseguente identificazione di interferone-α (IFN-α), IFN-β e IFN-γ come inibitori potenti del Zika crescita virale. In sintesi, un infettiva sistema di coltura in vitro Zika virale e vari saggi virologici sono dimostrati in questo studio, che ha il potenziale per beneficiare notevolmente la comunità di ricerca nel chiarire ulteriormente i meccanismi di patogenesi virale e l'evoluzione della virulenza del virus. Antivirale IFN-alfa può essere ulteriormente valutata come un profilattico, profilattico post-esposizione, e opzione di trattamento per le infezioni da virus Zika in popolazioni ad alto rischio, comprese le donne in gravidanza infettate.

Introduzione

Zika Virus (ZIKV) è un importante patogeno umano associato con microcefalia e poveri gravidanza esiti ^1,4. ZIKV appartiene alla serie di flavivirus clinicamente rilevanti che possono causare difetti neurologici, come la dengue, West Nile, e virus encefalite di St. Louis. La modalità principale di trasmissione virale è dal vettore zanzara Aedes aegypti, e, inoltre, la trasmissione sessuale è stata riportata anche ^5,6. ZIKV è diventata un importante problema di salute globale a causa della espansione della distribuzione geografica della zanzara vettore e la sua forte correlazione con difetti alla nascita. ZIKV è stato isolato nel 1947 da una scimmia Rhesus sentinella nel bosco Zika, l'Uganda e il primo caso umano è stato segnalato nel 1952 ^7,8. Gli individui che si infettano con ZIKV presente con sintomi lievi come febbre, eruzioni cutanee, mal di testa, congiuntivite, dolori muscolari e / articolare. Le donne in gravidanza infettate possono trasmettere ZIKV al feto in via di sviluppo ^1. ZInfezione IKV è stata anche legata alla sindrome di Guillain-Barre, un nervo periferico demielinizzazione autoimmune disturbo ^9.

Il genoma virale Zika consiste in un senso positivo, molecola a singolo filamento di RNA che è di circa 10,8 chilobasi di lunghezza. La struttura del genoma è organizzato come 5'NCR-C-PRM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR, con le regioni non codificanti (NCR) che fiancheggia una regione codificante ^6. Una singola poliproteico (3.419 bis) è tradotto cioè co- e post-traduzionali spaccati in 10 piccoli peptidi. Sia il 5'NCR e strutture stem-loop 3'NCR RNA svolgono un ruolo critico nella inizio della traduzione del genoma virale e la replica. I componenti strutturali del genoma sono costituiti da proteine ​​capside, membrana, e la busta. Le proteine ​​non strutturali sono fondamentali per replicazione del genoma.

Attualmente, i ceppi virali Zika sono raggruppati in tre genotipi principali: West African, Dell'Africa orientale e asiatico ^6,10-13. E 'stato proposto che l'Oriente lignaggio africano diffuso in Africa occidentale e in Asia, dove poi ulteriormente evoluto ^12. Il genotipo asiatico è responsabile per le epidemie in corso in America. virus Zika può essere coltivato sia in zanzare e cellule di mammifero. Fibroblasti dermici primarie, cellule dendritiche immature, cellule progenitrici neurali corticali, e le cellule Vero sono suscettibili alle infezioni virali Zika ^10,14,15. Sia di tipo I e tipo II interferoni hanno dimostrato di limitare la crescita ZIKV nei fibroblasti cutanei ^15. Gli obiettivi di questo studio sono quelli di fornire un graduale, protocollo dettagliato per la produzione e il saggio del genotipo asiatico ZIKA ceppo virale PRVABC59 in un sistema di coltura cellulare di mammifero e per dimostrare l'utilità di questo sistema di coltura infettiva come piattaforma di sviluppo di droga. Questa risorsa ha il potenziale per beneficiare notevolmente la comunità di ricerca virale e neurologica Zika di chiarire ulteriormente imeccanismi di patogenesi ts virale e l'evoluzione della virulenza del virus.

Protocollo

Nota: Un profilo schematico del flusso di lavoro è presentato in Figura 1.

1. cellule

1. Utilizzare cellule Vero per la produzione di virus Zika e l'analisi del ciclo di replicazione virale.
2. Preparare mezzi completi crescita contenente 10% di siero fetale bovino (FBS), 2 mM L-glutammina, penicillina (100 unità / ml), streptomicina (100 unità / ml), e 10 mM HEPES.
3. Cellule Vero coltura con terreno di coltura completo specificato a 37 ° C con 5% di CO _2.

2. Zika Virus Produzione

1. Raccogliere le cellule Vero a densità cellulare 80% con 0,25% tripsina in T-75 pallone e contare le cellule.
   1. Aspirare il supporto dal pallone di coltura T-75 e sciacquare le cellule con 2 ml di tampone fosfato salino (PBS).
   2. Aggiungere 2 ml di 0,25% tripsina e incubare il matraccio a 37 ° C per 5 min.
   3. Aggiungere 8 ml di siero contenenti terreno di coltura per inattivare la tripsina. Pipettare su e giù per suscellule pend e trasferire le cellule ad una provetta da 15 ml.
   4. Rimuovere 10 ml di cellule e mescolare con la stessa quantità di 0,4% trypan blu. Caricare il mix preparato alla diapositiva camera di conteggio delle cellule e di ottenere cellule vitali conteggi si utilizza un contatore di cellule automatizzato.
2. Seme un totale di 7 milioni di cellule in un volume di 30 ml in un pallone T-160.
3. Il giorno successivo, preparare una molteplicità appropriata di infezione (0,01-0,1 MOI) di Zika inoculo virus in un terreno di coltura libero 10 ml di siero per bombola.
4. Rimuovere il supporto trascorso dal pallone T-160 e quindi aggiungere l'inoculo virale appena preparato (10 ml).
5. Incubare i flaconi inoculati nel 37 ° C con 5% di CO ₂ per 4-6 ore. Stendere l'inoculo inclinando leggermente i fiaschi di traverso ad ogni ora.
6. Al termine dell'incubazione, sostituire l'inoculo con mezzi calda siero integrato crescita (30 ml) in ciascun contenitore. Poi continuare la coltura virale per il prossimo 96 ore.
7. Verificare la progressione infection osservando la comparsa di placche virali sul monostrato cellulare utilizzando un microscopio a contrasto di fase e prendere immagini (Figura 2) come necessario al 40X e 200X ingrandimenti.

Figura 2:. Placche formate da virus Zika su un monostrato di cellule Vero immagini in campo chiaro di vari ingrandimenti mostrano Zika placche virali a 48 HPI. Si noti la presenza di foci di cellule arrotondate sul monostrato. (Scala bar = 50 micron) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

8. Harvest supernatanti di coltura cellulare al punto di tempo a 96 ore e centrifugare il surnatante a 300 xg per 10 minuti a 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari.
9. rimuovere con attenzione il surnatante, senza detriti pellet inquietante e trasferimento to provette da 15 ml. Ultracentrifugazione a 24.000 xg può essere eseguita per concentrare le particelle virali (opzionali).
10. Conservare i sovranatanti virali in più aliquote a -80 ° C.

3. Misurazione Zika Virus Titer dalla placca Assay

1. Cellule Vero naive Seed a 1 x 10 ⁵ cellule per pozzetto a 2 ml di volume, con un 12-pozzetti.
2. Il giorno seguente, preparare 10-diluizioni seriali di surnatanti virali raccolti dai pallone T-160 utilizzando supporti privo di siero. Rimuovere i supporti spesi da ciascun pozzetto e aggiungere 400 ml di inoculo preparato su cellule Vero in triplice copia.
3. Incubare i flaconi inoculati a 37 ° C con 5% di CO ₂ per 4-6 ore. Stendere l'inoculo inclinando leggermente la piastra di traverso ad ogni ora.
4. Al termine dell'incubazione, sostituire l'inoculo con mezzi di siero integrato (2 ml per pozzetto).
5. A 48 ore post-inoculazione, contare i fuochi virale utilizzando un contr fase diMicroscopio ast. Calcolare il titolo virale come unità formando la placca (PFU) per ml. Vedi Figura 3 per il saggio di placca.
6. Fissare e macchiare le cellule del 4% di formaldeide e la soluzione al cristalvioletto 0,1% preparate in etanolo al 20% per una chiara visualizzazione delle placche.

Assay 4. Zika virale Genome replica

1. Cellule Vero naive Seed a 1 x 10 ⁵ cellule per pozzetto in 2 volumi ml con un 12-pozzetti. Il giorno seguente, preparare inoculi virali (MOI di 0,01 e 0,1; 400 ml / pozzetto) di basso e alto titolo utilizzando siero media liberi in triplice copia. Per l'infezione finto, utilizzare il siero media liberi (400 ml / pozzetto) solo.
2. Ripetere i passaggi 3,2-3,4.
3. Nei punti di tempo 48 e 96 ore, raccogliere i campioni di RNA e immunocitochimica (ICC).
   1. Per i campioni di raccolta di RNA, rimuovere il supporto e poi aggiungere 400 ml di soluzione di lisi direttamente a ciascun bene e raccogliere i lisati.
   2. Per ICC, rimuovere il supporto e tgallina fissare le cellule aggiungendo 1 ml di metanolo a ciascun pozzetto e incubare la piastra a 4 ° C per 30 min.
   3. Dal lisato cellulare, isolare l'RNA totale utilizzando un kit di isolamento di RNA secondo le istruzioni del produttore. Quantificare l'RNA utilizzando uno spettrofotometro.
4. Eseguire due fasi di trascrizione inversa PCR quantitativa (RT-qPCR) per determinare il contenuto genoma ZIKV da RNA raccolto.
   1. Per invertire trascrivere l'RNA, prima impostare un mix di reazione 13 ml composta da 5 mg di RNA isolato, 1 ml di dNTP (10 mm), e 1 ml esamero casuale (250 ng) in un tubo di 0,2 ml. Incubare la provetta a 65 ° C per 5 minuti e poi posto in ghiaccio per un minuto. Successivamente, aggiungere 1 ml di trascrittasi inversa, 4 ml di tampone di sintesi 5x filone, 1 ml di 0,1 M ditiotreitolo, e 1 ml di RNasi inibitore alla miscela di reazione. Incubare la provetta per altri 5 minuti a 25 ° C, seguita da 60 minuti a 50 ° C e inactivmangiato la reazione mediante riscaldamento a 70 ° C per 15 min.
   2. Eseguire qPCR utilizzando 1 ml di cDNA risultante con 12,5 ml di colorante verde 2x eccellente mix contenenti DNA polimerasi e 1 ml di 10 mm singoli primer specifici per il virus Zika [Zika virus pan-genotipo primer (per: 5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 ' ; Rev: 5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 '), virus Zika genotipo asiatico primer deformazione PRVABC59 (5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3'; Rev: 5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 ')], o il virus dell'epatite C (JFH RTQ F: 5 'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3'), o cellulare GAPDH gene housekeeping (Per: 5'-CCACCTTTGACGCTGGG-3 '; Rev: 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3') in un volume di reazione di 25 microlitri.
   3. Eseguire la PCR utilizzando la condizione di esercizio 95 ° C per 15 sec e 60 ° C per 30 sec (40 cicli) in un sistema PCR in tempo reale.
   4. Utilizzare livello di espressione GAPDH sulla base di soglie ciclo value (Ct) per normalizzare la Zika misura genoma virale. Calcolare il valore delta Ct (ΔCt) di Zika genoma rispetto a quello della GAPDH e ottenere il valore 2 ^ΔCt. Quindi, calcolare la variazione volte prendendo il rapporto tra normalizzati Zika contenuti del genoma tra le cellule infetti e non infetti in punti all'ora indicata. Si veda la Figura 4 per i risultati di replica ZIKV genoma.
5. Eseguire ICC utilizzando le cellule metanolo fisso.
   1. Lavare le cellule fissate tre volte con PBS 1x e bloccare con ICC tampone bloccante (3% siero di capra, 3% BSA, 0,1% Triton-X 100 in PBS).
   2. Usa il mouse monoclonale anti-dsRNA anticorpi J2 (1 mg / ml) alla diluizione di 1: 100 in tampone di bloccaggio e incubare una notte a 4 ° C.
   3. Lavare le cellule con PBS 1x e aggiungere anticorpo secondario di capra anti-topo IgG-594 (1 mg / ml) ad una diluizione 1: 1.000 in tampone bloccante e incubare per un'ora a temperatura ambiente.
   4. Lavare le cellule con PBS 1x e colorare per i nuclei con colorante Hoechst eosservare le cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza ad ingrandimento 100X (Figura 4).

5. Screening citochine Biblioteca contro Zika infezione da virus

1. Seed cellule Vero naive a 1 x 10 ⁵ cellule per pozzetto utilizzando un 12-pozzetti. Una volta che le cellule sono fissati (6 ore post-semina), aggiungere ciascuna citochina a concentrazioni indicate in duplicati biologici (2 ml di volume / pozzetto). Includi veicolo (PBS) il controllo da solo.
2. A 12 ore dopo il trattamento, effettuare infezione virale Zika (MOI di 0,1 a 400 ml per pozzetto). Includere pozzetti di controllo negativo senza infezione (finto).
3. A 4 ore dopo l'infezione, sostituire l'inoculo virale con i media di citochine trattati (2 ml). Incubare le cellule a 37 ° C per ulteriori 44 ore.
4. A 48 ore dopo l'infezione, contare le placche virali utilizzando un microscopio a contrasto di fase e di acquisire immagini rappresentative di cellule infettate a 40X di ingrandimento (Figura 5).

Risultati

Un ceppo virale Zika (PRVABC59; GenBank numero di accesso KU501215) del genotipo asiatico è stato utilizzato in questo studio ^12. Cellule Vero a 80% di confluenza sono stati usati per indagare de novo Zika infezione virale. Per la produzione virale e la successiva caratterizzazione virologica, un passaggio precoce del virus (P3) Zika è stato impiegato. Sono state rilevate le placche virali il secondo giorno di infezione. Zika progenie virali rilasciate dalla cellula...

Discussione

Qui, un protocollo semplificato per la coltura dei virus Zika in vitro è presentato. Passaggi critici tra cui, individuando punti finali ottimali per espandere la cultura del virus, la misurazione titolo, e quantificare replicazione del genoma sono stati forniti. virus Zika è un patogeno umano, così, durante la manipolazione di agenti infettivi, le procedure di biosicurezza devono essere seguite scrupolosamente. Una linea cellulare di rene di scimmia, Vero, è stato utilizzato per dimostrare vari saggi virol...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Sigma Life Science	D5796
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red	Corning	25-054-C1
Trypan Blue Stain 0.4%	Life Technologies	T10282
Countess – Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	C10227
Countess-cell counting  chamber slides	ThermoFisher Scientific	C10283
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020
SUPERSCRIPT III RT	Life Technologies	18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX	Life Technologies	11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System	Thermo Fischer	4471088
RNase-Free DNase	Promega	M6101
Vero Cell Line	ATCC	CCL-81
Zika viral strain PRVABC59	Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
IL-6	Peprotech	200-06
IL-1 alpha	Peprotech	200-01A
TNF-alpha	Peprotech	300-01A
Interferon alpha A	R & D Systems	11100-1
Interferon beta	Peprotech	300-02BC
Interferon gamma	Peprotech	300-02
Centrifuge 5415R	Eppendorf	5415R
Centrifuge 5810R	Eppendorf	5810R
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