Visualizzare gli effetti di espettorato su biofilm di sviluppo utilizzando un modello Chambered coprioggetti

Riepilogo

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Abstract

I biofilm sono costituiti da gruppi di batteri racchiusi in una matrice di auto-secreto. Essi svolgono un ruolo importante nella contaminazione industriale e nello sviluppo e la persistenza di molte infezioni salute correlati. Uno dei biofilm più ben descritti e studiati nelle malattie umane avviene in infezione cronica polmonare dei pazienti affetti da fibrosi cistica. Studiando biofilm nel contesto dell'ospite, molti fattori possono influenzare la formazione e lo sviluppo del biofilm. Al fine di individuare come fattori dell'ospite possono influenzare la formazione di biofilm e sviluppo, abbiamo usato un metodo coprioggetti Chambered statica a crescere biofilm in presenza di fattori dell'ospite-derivati ​​in forma di surnatanti espettorato. I batteri sono seminate nelle camere e esposti a filtrati espettorato. Dopo 48 ore di crescita, biofilm sono macchiate di un biofilm kit commerciale viabilità prima di microscopia e analisi confocale. A seguito di acquisizione delle immagini, le proprietà biofilm possono essere valutati utilizzando piattaforme software differenti.Questo metodo ci permette di visualizzare le proprietà principali della crescita di biofilm in presenza di sostanze diverse, tra cui antibiotici.

Introduzione

biofilm batterici sono gruppi di microrganismi che sono attaccati l'uno all'altro e racchiuso in una matrice di auto-secreta. ^1,2 Classicamente, rappresentano i batteri fisicamente collegati a una superficie abiotico o biotico formata in condizioni di flusso. I biofilm hanno anche dimostrato di crescere in condizioni statiche (assenza di flusso) e distale da superfici, come ad esempio all'interfaccia aria-liquido di piscine termali o pellicole formate in provetta. Questi biofilm sono da tempo riconosciuti nell'ambiente e sono un grande danno per processi industriali, in quanto possono formare in serbatoi di acqua o in tubi, con conseguente biofouling, corrosione e blocchi. ^3,4

I biofilm sono anche critici in ambienti sanitari, in quanto è stato dimostrato essere coinvolti nelle infezioni correlate al catetere, infezioni polmonari nei pazienti affetti da fibrosi cistica, così come in numerose altre infezioni. ^5,6 Una delle caratteristiche di infezioni biofilm è la desgualcita sensibilità dei batteri agli antibiotici e compromessa rinvio del sistema immunitario innato. ^7-9 Il più studiati, scenari clinicamente rilevanti che coinvolgono infezione biofilm-based si verifica in pazienti affetti da fibrosi cistica (FC), che sono cronicamente infettati con Pseudomonas aeruginosa biofilm. P. aeruginosa può subire una serie di modifiche durante la creazione di infezione cronica che lo rendono molto difficile da trattare. ^10,11 I biofilm possono differenziale attivare l'immunità innata e guidare l'infiammazione. ^12-14 Poiché queste infezioni portano ad un aumento della morbilità e mortalità nei pazienti con FC, è fondamentale per capire i fattori che possono influenzare lo sviluppo del biofilm in questo contesto.

Un recente studio suggerisce che ospitano-fattori critici nella formazione di P. aeruginosa aggregati biofilm. ¹⁵ Questi biofilm contribuiscono alla ridotta sensibilità agli antibiotici e meccanismi di difesa dell'ospite. il PreseSNO di fattori dell'ospite-derivati, come elastasi neutrofila, così come i prodotti secreti da microrganismi presenti nel polmone CF, hanno il potenziale di modulare notevolmente la formazione di biofilm e sviluppo. ¹⁶ Inoltre, biofilm interagiscono con l'host di modulare l'espressione di numerosi percorsi e avviare l'infiammazione. Mentre i metodi high throughput, quali il test cristalvioletto standard possono fornire alcune informazioni per quanto riguarda il processo di biofilm, visualizzazione del biofilm in risposta a questi fattori fornire informazioni più approfondite.

In questo manoscritto si descrive un metodo per l'utilizzo di fattori dalla nell'espettorato di pazienti con FC per studiare lo sviluppo di biofilm in vitro. Questo metodo consente la visualizzazione rapida dei biofilm esposti a espettorato contenente fattori host utilizzando un kit di biofilm redditività commerciale. Questa tecnica può essere utilizzata per identificare visivamente i cambiamenti che si verificano durante la crescita di biofilm in presenza di exogenonoi prodotti, e rappresenta un metodo migliore per analizzare i cambiamenti nello sviluppo del biofilm in varie condizioni.

Protocollo

Si noti che la ricerca Consiglio di etica (REB) è necessario per raccogliere e conservare campioni di espettorato da soggetti umani. Questi studi sono stati approvati dal Hospital for Sick Children REB # 1.000.019,444 mila.

1. preparazione dei campioni dell'espettorato CF

1. Raccogliere campione di espettorato dai pazienti durante le visite di routine alla clinica fibrosi cistica e tenere in ghiaccio.
2. Trasporto del campione di espettorato sul ghiaccio entro la prima ora di raccolta, al laboratorio di ricerca, di sottoporsi a trattamento.

2. dell'espettorato Processing

1. Registrare il volume del campione di espettorato ottenuti. Aggiungere tampone fosfato salino (PBS) per 2 volte il volume del campione (ad esempio, 2 parti di PBS, 1 parte di campione).
2. Mescolare il campione bene con una pipetta di trasferimento. Vortex il campione sul valore massimo per 1 minuto per miscelare completamente.
3. Aliquota 1 ml della miscela sopra nel numero provette da 1,5 ml microcentrifuga appropriati e spin down a 5.000 xg per20 min a 4 ° C.
4. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e scartare il pellet.
5. Filtro sterilizzare il surnatante attraverso un filtro di 0,22 micron e raccogliere in una provetta pulita.
   NOTA: La sterilità del filtrato viene testato da placcatura su LB agar e inoculando mezzi liquidi.
6. Conservare il surnatante dell'espettorato a -80 ° C per un uso futuro.
   NOTA: L'espettorato da più pazienti possono anche essere raggruppati dopo la filtrazione.
7. Prima dell'uso, diluire espettorato filtrato 1/10 v / v (100 ml di espettorato, 900 l di media) a supporto desiderato.
   NOTA: Qui, è stato utilizzato il brodo lisogenia standard (LB) media.

3. Metodo Chambered coprioggetti per la formazione di biofilm

1. Crescere isolato batterico di interesse overnight a supporto desiderato a 37 ° C con agitazione (200 rpm).
   Nota: sono stati utilizzati una serie di diversi batteri, tra isolati clinici Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,Complesso Burkholderia cepacia e xylosoxidans Achromobacter. Scelta dei supporti dipende dalle tensioni e le condizioni di interesse, ma i media LB possono essere utilizzati per gli esperimenti iniziali.
2. Dalla cultura overnight, inserire 40 ml di coltura in 4 ml di mezzi freschi e crescere per 3-4 ore a 37 ° C con agitazione (200 rpm) per ottenere una coltura con una densità ottica a 600 nm (OD ₆₀₀₎ di circa 0,5 -0.6.
3. Diluire la cultura dal punto 3.2 a 1/5 nel supporto desiderato con il 10% espettorato filtrato o senza filtrato espettorato (come controllo). Altro concentrazione di espettorato filtrato può essere testato (cioè, 50% o 100%).
4. Utilizzare 200 ml di diluizione per seminare pozzi di camere di diapositive.
5. Permettere ai batteri di attaccare per 4 ore a 37 ° C senza agitazione.
6. Dopo 4 ore, rimuovere il supporto e lavare delicatamente il biofilm con mezzi freschi 1x. Sostituire con 200 ml di mezzi freschi.
   NOTA: Per studiare gli effetti della sputo sul biofilm, i fresh media dovrebbero contenere espettorato surnatante.
7. Consentire biofilm di crescere per quantità desiderata di tempo a 37 ° C senza agitazione, sostituirà supporti ogni 12 ore, senza lavaggio fino al momento per microscopia.
   NOTA: Per studiare l'effetto dei sovranatanti di espettorato su biofilm sensibilità agli antibiotici, gli antibiotici vengono aggiunti ai media dopo 24 ore di crescita di biofilm e sono mantenute nella media fino a quando la colorazione e l'imaging di biofilm.

4. colorazione biofilm e Microscopia confocale

1. Dopo il tempo di crescita desiderato (24-48 hr funziona meglio), rimuovere i supporti da pozzi da camera e lavare delicatamente ciascuna camera due volte con 300 ml di PBS sterile.
2. Preparare la miscela di colorazione per biofilm mescolando 1 ml di ciascun colorante (fornito nel kit fattibilità) per ogni ml di soluzione necessaria. Fai la tintura in acqua o mezzi soluzione.
   NOTA: L'acqua è consigliato dal produttore.
3. Aggiungere 200 ul di miscela colorante in ciascun pozzetto della covergla chamberedss ed incubare a temperatura ambiente, al buio per 45 min.
4. Rimuovere miscela colorazione dalle camere e lavare bene ogni con 300 ml di PBS sterile. Rimuovere PBS e sostituirlo con acqua dolce o media.
5. Procedere con la visualizzazione di biofilm mediante microscopia confocale.

5. Visualizzazione biofilm con Microscopia confocale

1. Leggi biofilm macchiati in camere immediatamente dopo la colorazione (entro 1 ora). Minimizzare ritardo nella visualizzazione delle diapositive colorando 1 a 2 camere 8 pozzetti alla volta.
2. Eseguire l'imaging utilizzando microscopio confocale con i laser per l'eccitazione e di filtro set per l'acquisizione.
   NOTA: Qui, il disco di sistema confocale di filatura con i laser Borealis spettrali (Verde: 491nm, colore rosso: 561 nm) sono stati utilizzati per l'eccitazione. filtro per le emissioni set di 515/40 e 624/40 sono stati usati per visualizzare le macchie dal kit biofilm viabilità.
3. Prendere le immagini utilizzando un obiettivo 25X acqua sul microscopio confocale con la macchina fotografica.
4. Usa Z-Stack per modellare il biofilm. Prendere immagini ogni 0,5-1 micron a partire dal primo piano di messa a fuoco per l'ultimo fotogramma di messa a fuoco del biofilm (in genere si estende 30-80 micron per 48 biofilm hr)
5. Prendere 3-5 immagini da ogni pozzetto.
   NOTA: Così per un 8 coprioggetti ben camerata, 24-40 immagini saranno generate.
6. Salvare le immagini per l'analisi.
   NOTA: Le immagini devono essere salvati come file OME-TIFF per essere analizzati utilizzando COMSTAT ^18,19. Istruzioni per l'analisi delle immagini biofilm possono essere trovati a http://www.comstat.dk/. Una volta che le immagini vengono importate, parametri come spessore medio, biomassa e la copertura di superficie per ogni canale (rosso e verde) possono essere analizzati.

Risultati

Il disegno complessivo di questo esperimento è rappresentata in figura 1. L'uso di questo protocollo fornisce un metodo conveniente per visualizzare le variazioni di biofilm coltivate per diversi periodi di tempo (ad esempio, 24, 48 o 72 hr). È importante sottolineare che i segnali esogeni, quali espettorato filtrati, possono essere aggiunti per visualizzare i cambiamenti nello sviluppo biofilm. Come si vede nella figura 2, la presenza del...

Discussione

I metodi qui descritti consentono la visualizzazione dei biofilm batterici cresciute in presenza di prodotti esogeni. Non sorprendentemente, la produzione dei exoproducts è di importanza quando si utilizza questo tipo di sistema. Per esempio, ditiotreitolo (DTT), è spesso usato su campioni di espettorato umani per aiutare a liquefare i campioni. Tuttavia, l'effetto di DTT solo può diminuire sviluppo biofilm e vitalità (dati non mostrati). Quindi, controlli appropriati per tutte le condizioni sono necessarie. Ino...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well	Thermo Sicher Scientific	155409
Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit	Thermo Fisher Scientific	L10316
Blood agar plates	Thermo Fisher Scientific	R10215	Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation
COMSTAT	Availble software online		COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Standard media for overnight gowth/biofilm growth
Millex-GV Syringe Filters	Millipore	SLGV013SL	Filtering of sputum supernants
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)	Oxoid	BR0014G	Washing of biofilm chambers after media removal
Zeiss AxioVert 200M	Carl Zeiss
Hamamatsu C9100-13 EM-CCD	QS Technologies Inc.
Spectral Borealis	Qs Technologies Inc.
Perkin Elmer Volocity	QS Technologies Inc.		Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf