Vena interposizione Modello: un modello adatto per studiare Bypass Graft pervietà

Riepilogo

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

Abstract

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

Introduzione

malattie coronarica e loro complicanze sono tra le principali cause di morte in tutto il mondo. strategie terapeutiche attuali si concentrano su ristabilendo il flusso di sangue, sia dilatando nave ridotto o con la creazione di un bypass. Bypass coronarico (CABG) utilizzando autografts vena è stato descritto nel 1968 ed è stato affinato nel corso degli anni. A parte la rivascolarizzazione della discendente anteriore dell'arteria coronaria, safena condotti vena sono più comunemente utilizzati ^1. Tuttavia, pervietà dell'innesto rimane il tallone d'Achille di innesti di vena safena (SVG). Un anno dopo l'intervento chirurgico, pervietà dell'innesto è 85%, scendendo al 61% dopo dieci anni ^2,3. Svelare i meccanismi fisiopatologici e le cause della perdita di pervietà SVG è quindi un compito importante.

Questo video dimostra una vena modello di interposizione di ratto per studiare perdita del trapianto vena. Gli obiettivi generali di questo metodo sono per esplorare la patobiologico sottostantee processi -physiological durante la progressione della malattia e di sviluppare un modello adatto per la droga o test opzione terapeutica. Con il trapianto della vena epigastrica superficiale nel sistema arterioso, questo modello imita da vicino la situazione clinica di bypass coronarico. trauma chirurgico, ischemia, e lo stress di parete sono importanti trigger di alterazioni vascolari patologiche e sono imitati nel modello descritto.

modelli e diverse specie sono a disposizione per studiare la perdita di pervietà della vena del trapianto. Grandi modelli animali, come maiali, pecore ^{4 5 6,} cani e scimmie ^7, assomigliano nave umana e strutture anatomiche e consentono quindi di strategie terapeutiche complesse, come stenting bypass o di nuove tecniche chirurgiche, da testare ^8. Tuttavia, sono necessari speciali abitazioni, attrezzature e personale. Inoltre, i costi elevati e la necessità di un anestesista aggiuntivo durante la chirurgia impediscono loro applicazione più ampio. Smtutti gli animali, inclusi ratti, sono facili da maneggiare, non richiedono apposito alloggiamento, e hanno costi gestibili. Rispetto ai modelli murini ^9,10, modelli di ratto hanno il vantaggio di una migliore operatività e quindi meno variabilità nel risultato. I ratti sono fisiologicamente e geneticamente più simili agli esseri umani che topi ^11,12. Inoltre, la maggior parte dei topi wild-type si sviluppano solo myointima limitata ^13, che rendono modelli murini inclini a errori di tipo II. L'istologia delle principali vene mouse, come la vena cava inferiore, costituito solo da pochi strati di cellule e rende difficile valutazione precoce ^13. Un ulteriore inconveniente è la piccola quantità di tessuto disponibili per successive analisi dopo il recupero innesto.

Il modello descritto in questo video è riproducibile, economico e di facile esecuzione, e può essere stabilito in modo rapido e affidabile. È particolarmente adatto per valutare costosi agenti terapeutici sperimentali, come vettori viraliper la terapia genica, in modo economico.

Protocollo

Animali hanno ricevuto cura umana nel rispetto della guida dei principi di animali da laboratorio, preparati dall'Istituto di Laboratorio risorse animali e pubblicati dal National Institutes of Health. Tutti i protocolli di animali sono stati approvati dalle autorità locali competenti ( "Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, Hansestadt (Ufficio per la salute e la tutela dei consumatori) di Amburgo").

1. Animal Care

1. Ottenere ratti ratti Lewis (AES / CRL) e Rosa / luciferasi-AES ratti transgenici peso di 300-350 g presso l'Istituto di animali da laboratorio.
2. Mantenere i ratti in condizioni convenzionali in armadi ventilati e dar loro da mangiare chow ratto normale e autoclavato ad libitum acqua.
3. Eseguire un trapianto di trapianto utilizzando i / luciferasi-AES ratti transgenici Rosa come donatori e le singenici topi AES / CRL i destinatari.

2. Preparazione del Rat Donor

1. Utilizzare un Inductcamera di ionizzazione ad anestetizzare un ratto con isoflurano (2,5-3%).
2. Posizionare il topo sul dorso e mantenere la anestesia con una mascherina a protezione della bocca e del naso. Verificare la presenza di sufficiente profondità dell'anestesia pizzicando le zampe posteriori e verificando l'assenza di riflessi. Applicare un po 'vet unguento per gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
3. Stendere le zampe posteriori e fissare la loro posizione usando del nastro.
4. Radere i capelli inguinale con un trimmer capelli e disinfettare l'intera area utilizzando iodopovidone seguito dal 80% di etanolo. Ripetere la fase di disinfezione due volte.
   NOTA: l'area chirurgica, garza, e strumenti chirurgici devono essere sterilizzati. Mantenere un campo sterile durante tutta la procedura e l'usura monouso, guanti chirurgici sterili, maschere e cappucci.
5. Sotto un microscopio, eseguire una incisione verticale lungo le inguinale Linea. Utilizzare due pinze per separare delicatamente i tessuti sottocutanei ed esporre la vena epigastrica superficiale dalla sua origin sulla vena femorale. isolare con cura la vena epigastrica superficiale, dai tessuti circostanti.
6. Interrompere il flusso di sangue nella vena epigastrica superficiale, utilizzando due morsetti micro.
7. Raccolto un segmento di circa 0,5-1 cm vena sollevando attentamente la vena isolato con una pinza e taglio attraverso il vaso con microscissors. Lasciare le fascette micro sul ceppo recipiente per prevenire la perdita di sangue. Posizionare il pezzo rimosso della vena sulla garza sterile. posizionare accuratamente un ago 30 G all'interno un'estremità della vena raccolto e lavare il vaso con eparina (50 unità / ml).
   NOTA: Maneggiare la vena con cura ed evitare danni durante il sollevamento, il taglio, e vampate di calore. Assicurarsi di lavare l'innesto con la giusta quantità di eparina.
8. Tenere il segmento nave in 1% lidocaina in ghiaccio fino al trapianto nel ratto destinatario di prevenire un spasmo dei vasi.
9. Euthanize ratto donatore aumentando l'anestesia per 5% isoflurano. Dopo 2-3 minuti, open dell'addome lungo la linea alba, tagliare attraverso il diaframma, e rimuovere il cuore per interrompere la circolazione.

3. Preparazione del Topo destinatario

1. Anestetizzare e fissare il ratto destinatario nello stesso modo come il topo donatore.
2. Shave lato mediale delle gambe con un trimmer capelli e disinfettare tre volte utilizzando iodopovidone e l'80% di etanolo.
3. Monitorare la profondità dell'anestesia e assicurarsi che sia sufficiente verificando l'assenza di riflessi quando pizzicare i piedi posteriori.
4. Eseguire un'incisione mediana femorale dal ginocchio alla piega inguinale. Sotto un microscopio, utilizzare 2 pinze per separare l'arteria femorale che lo circonda.
5. Utilizzare pinze micro per fermare il flusso di sangue. Posizionare il morsetto prossimale prima, seguita dalla pinza distale.
6. Tagliare un breve segmento dell'arteria femorale serrato con microscissors ed eliminarla. Accorciare il moncone arteriosa restante con microscissors, creando un gap che è1-2 mm superiore al trapianto vena. Lavare il moncone arteriosa con eparina con un ago 30 G.
   NOTA: Se l'avventizia sporge leggermente oltre il ceppo recipiente, utilizzare pinze per tirare leggermente sopra l'estremità della nave e rimuovere un pezzo.
7. Posizionare la vena raccolto dal punto 2.8 tra i ceppi arteriosi e regolare la lunghezza in modo che si adatti opportunamente nella fessura. Notare la direzione della vena.
8. Eseguire la anastomosi prossimale prima utilizzando una sutura 10-0 prolene. Condurre singoli punti nell'ordine indicato (Figura 1D). Iniziare con una sutura su ciascun lato laterale prima di aggiungere altri tre suture sul lato ventrale. Successivamente, posizionare tre punti sul lato dorsale della nave per completare l'anastomosi.
9. Collegare i vasi distali con l'innesto con la stessa tecnica come per l'anastomosi prossimale descritto al punto 3.8. Anche in questo caso, iniziare con una sutura su ogni lato laterale e quindi inserire tre punti di sutura sul sid ventraleee lato dorsale.
10. Caricare due siringhe da 1 ml con componente colla di fibrina 1 e 2. sollevare con attenzione l'innesto con una pinza e scendono circa 100 ml di fibrina componente colla 1 sotto l'innesto, seguita dalla componente 2.
    NOTA: Assicurarsi che i componenti 1 e 2 siano applicati in un rapporto 1: 1.
11. Posizionare l'innesto nella sua posizione e rilasciare ulteriori 100 ml di componenti 1 e 2 su di trapianto. Assicurarsi che la colla copre sia l'innesto e l'anastomosi per prevenire insufficienza anastomotico e sovradistensione del trapianto vena.
12. Aprire con cautela il morsetto distale, seguito dal prossimale.
13. Conferma un intervento chirurgico di successo controllando un impulso visibile nella vena trapiantato e arteria distale dell'innesto.
14. Rimuovere la colla eccessiva, che impedisce la chiusura della pelle. Utilizzare pinze per sollevare la colla curata e rimuovere l'eccesso con microscissors. Chiudere gli strati della pelle con 5-0 punti di sutura prolene.
15. Iniettare 4-5 mg / kg per via sottocutanea Carprofen prima di consentire il ratto di svegliarsi. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Mantenere l'animale in una sola gabbia fino a quando non è completamente recuperato.
16. Aggiungere Metamizolo per l'acqua potabile (50 mg Metamizolo per 100 ml) come antidolorifici per i successivi 3 giorni e monitorare l'animale al giorno.

4. Duplex ecografia

NOTA: Utilizzare ecografia duxplex di visualizzare il flusso di sangue in maniera non invasiva nei ratti ^14.

1. Anaesthetize un topo in una camera di induzione (isoflurano 2%). Posizionare il topo sul dorso e mantenere l'anestesia con una mascherina a protezione del naso.
2. Utilizzare tosatrici e crema depilatoria per rimuovere i capelli intorno alla zona della coscia.
3. Applicare gel ultrasuoni per la coscia. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria. Acquisire le immagini ecografia duplex utilizzando un trasduttore 400 MS (frequenza centrale: 30 MHz) con un frame rate di 230-400 fotogrammi / sec.

5. istopatologia

NOTA: Raccolta e macchia la nave con la colorazione tricromica di Masson per l'analisi morfometrica ^15.

1. Fissare la nave raccolti in 4% paraformaldeide notte e disidratare in concentrazioni crescenti di etanolo. Incorpora il campione in paraffina e tagliatela a 5 micron fette spesse utilizzando un microtomo.
   NOTA: Paraformaldeide è tossico e deve essere maneggiato con particolare cura.
2. Deparaffinare le diapositive prima di colorazione con tricromica soluzione colorante. Disidratare i vetrini colorati, eliminarli con xilene, e montarli in mezzo di montaggio. Dopo l'essiccazione le diapositive, visualizzare i campioni con un microscopio.

6. bioluminescenza Imaging (BLI)

NOTA: L'innesto post-operatorio è stato rintracciato nel corso del tempo in vivo misurando il segnale bioluminescente ¹6.

1. Sciogliere 1 g di sale di potassio D-Luciferin in 22 ml di PBS e iniettare per via intraperitoneale nel ratto (375 mg / kg di peso corporeo). Attendere 15 min per la luciferina circolazione nell'animale.
2. Posizionare il topo in un sistema bioluminescente quantificazione tempo reale e accedere al segnale di bioluminescenza.

Risultati

Il modello di interposizione di ratto vena è adatto per studiare lo sviluppo di myointima iperplasia e insufficienza venosa graft. Animali recuperare bene da un intervento chirurgico e mostrano ottime condizioni fisiche post-operatorio. La Figura 1 mostra i passi chirurgici chiave. Dopo l'incisione cutanea lungo le inguinale Linea, la vena superficiale epigastrica e l'arteria femorale sono identificati (Figura 1A). La raccolta del trapianto deve essere effettuata con attenzione...

Discussione

Questo video dimostra una vena modello di interposizione di ratto per indagare perdita del trapianto vena e per consentire l'esplorazione dei processi patologici sottostanti e la sperimentazione di nuovi farmaci o opzioni terapeutiche.

L'anestesia è un aspetto cruciale delle procedure chirurgiche. Si raccomanda un sistema per anestesia per inalazione continua, in quanto questo è un metodo semplice e sicuro, in particolare durante operazioni prolungate. Questo può essere di grande ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat LEW/Crl	Charles River	Stock number 004
Rat LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor- 1 luc)11Jmsk	Institute of laboratory animals, Kyoto University, Japan	NBPR rat number 0299	http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/
PFA 4%	Electron Microscopy Sciences	#157135S	20%
hair clipper	WAHL	8786-451A ARCO SE
Forene	AbbVie	PZN 10182054 Art.Nr.: B506	Isoflurane
microsurgical clamp	Fine Science Tools	18055-04	Micro-Serrefine - 4 mm
clamp applicator	Fine Science Tools	18056-14
hair removal creme	Rufin cosmetic	27618
Povidone-Iodine	Betadine Purdue Pharma	NDC:67618-152
10-0 Ethilon suture	Ethicon	2814G
5-0 prolene suture	Ethicon	EH7229H
Rimadyl	Pfizer	400684.00.00	Carprofen
Novaminsulfon	Ratiopharm	PZN 03530402	Metamizole
Heparin	Rotexmedica	PZN: 3862340	25.000 I.E./ ml
Xylocain 1%	AstraZeneca	PZN: 1137907	Lidocain
EVICEL	J&J Med.Ethicon Biosur	PZN 7349697 Art. Nr.:EVK01DE	fibrin glue
NaCl 0.9%	B.Braun	PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160
Vevo 770 high-resolution in vivo micro-imaging system	VisualSonics		duplex sonography
Ecogel 100 ultrasound gel	Eco-med	30GB
D-Luciferin Firefly, potassium salt	Biosynth	L-8220
PBS pH 7.4	Gibco	10010023
Xenogen Ivis 200	Perkin Elmer		bioluminescence imaging
Weigerts iron hematoxylin Kit	Merck	1.15973.0002	Trichrome staining
Resorcine-Fuchsine Weigert	Waldeck	2.00E-30	Trichrome staining
Acid Fuchsin	Sigma-Aldrich	F8129-25G	Trichrome staining
Ponceau S solution	Serva Electrophoresis	33427	Trichrome staining
Azophloxin	Waldeck	1B-103	Trichrome staining
Molybdatophosphoric acid hydrate	Merck	1.00532.0100	Trichrome staining
Orange G	Waldeck	1B-221	Trichrome staining
Light Green SF	Waldeck	1B-211	Trichrome staining
Vitro-Clud	Langenbrinck	04-0001
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	537020
37% HCl	Sigma-Aldrich	H1758
Xylene	Th. Geyer	3410
Paraffin	Leica biosystems	REF 39602004
Ethanol absolute	Th. Geyer	2246
Ethanol 96%	Th. Geyer	2295
Ethanol 70%	Th. Geyer	2270
Slide Rack	Ted Pella	21057
Staining dish	Ted Pella	21075
Bepanthen Eye and Nose ointment	Bayer	1578675	Eye ointment