Un protocollo ottimizzato per elettroforetica Mobility Shift Assay Utilizzando oligonucleotidi infrarosso colorante fluorescente etichettati

Riepilogo

Descriviamo qui un protocollo ottimizzato di saggi fluorescenti elettroforetiche Mobility Shift (Femsa) utilizzando purificati SOX-2 proteine ​​insieme con colorante fluorescente marcato sonde di DNA a infrarossi come un caso di studio per affrontare un'importante questione biologica.

Abstract

Elettroforetiche saggi Mobility Shift (EMSA) sono uno strumento fondamentale per caratterizzare le interazioni tra proteine ​​e le loro sequenze di DNA bersaglio. La radioattività è stato il metodo predominante di etichettatura DNA in EMSAs. Tuttavia, recenti progressi nella coloranti fluorescenti e metodi di scansione hanno spinto l'uso di marcatura fluorescente di DNA come alternativa alla radioattività per i vantaggi di maneggevolezza, risparmiando tempo, riducendo i costi e migliorare la sicurezza. Abbiamo recentemente utilizzato EMSA fluorescente (Femsa) per affrontare con successo un importante questione biologica. La nostra analisi FEMSA fornisce una visione meccanicistica in l'effetto di una mutazione missenso, G73E, nel HMG fattore di trascrizione altamente conservata SOX-2 on olfattiva diversificazione tipo neurone. Abbiamo scoperto che mutante SOX-2 proteina ^G73E altera il DNA specifica attività di legame, causando in tal modo olfattiva trasformazione neurone identità. Qui, vi presentiamo un ottimizzato e conveniente step-by-step di protocolloper Femsa utilizzando fluorescenti infrarossi oligonucleotidi dye-marcato contenenti le LIM-4 / SOX-2 siti di destinazione adiacenti e purificati SOX-2 proteine (WT e mutanti SOX-2 proteine ^G73E) come un esempio biologico.

Introduzione

EMSAs sono utilizzati per analizzare interazioni tra DNA e proteine utilizzando nativo SDS-PAGE (PAGINA) per risolvere una miscela di una proteina di interesse e una sonda di DNA marcata contenente potenziali siti bersaglio della proteina ^1. Una sonda DNA legato con proteine ​​migrerà più lento rispetto a una sonda di DNA libero, ed è quindi ritardato nella sua migrazione attraverso una matrice di poliacrilammide. Radiomarcatura di DNA da ³² P è stato il metodo predominante per il rilevamento in EMSAs. Anche se l'applicazione di radiomarcatura in ricerca biochimica è stato vantaggioso, i metodi di etichettatura DNA alternativa con sensibilità paragonabile vengono impiegati a causa dei rischi per la salute e la sicurezza connessi con la gestione di radioattività. Questi metodi alternativi includono coniugazione del DNA con biotina ² o digossigenina (DIG) ³ (entrambi i quali sono poi rilevati dai sistemi chemiluminescenza), SYBR colorazione verde del gel PAGE ^4,o il rilevamento diretto di coniugati colorante DNA fluorescente attraverso la scansione del ^5,6 gel.

I gel risolti di EMSAs utilizzando sonde di DNA marcati radioattivamente richiedono l'elaborazione postrun attraverso film autoradiografia o un sistema phosphorimager di rilevare i segnali radioattivi ^1,7. Gel di EMSAs utilizzando biotin- ² o DIG-coniugati sonde ³ di DNA devono essere elaborati e trasferiti su una membrana adatta e poi rilevati da chemiluminescenza ^6. SYBR colorazione verde del gel richiede postrun colorazione del gel e uno scanner a fluorescenza ^4. Dal momento che sono necessari fasi di lavorazione gel postrun per EMSAs che utilizzano queste tecniche di etichettatura di DNA, il gel può essere risolto solo una volta analizzati. Al contrario, sonde di DNA marcate con fluorofori possono essere rilevati direttamente nel gel all'interno delle lastre di vetro da uno scanner. Pertanto, le interazioni proteina-DNA possono essere monitorati e analizzati più volte in diversi momenti durante la corsa, cheriduce significativamente i tempi ei costi. I coniugati colorante DNA fluorescente che sono stati utilizzati per EMSAs includono Cy3 ^{6,8, 6,8} Cy5, fluoresceina ^9, e coloranti fluorescenti infrarossi ^4-6.

Regolazione trascrizionale richiede interazioni proteina-DNA di fattori di trascrizione e dei loro geni bersaglio. Il coordinamento di queste interazioni genera diversi tipi di cellule da un progenitore comune durante lo sviluppo degli animali. Uno schermo genetica avanti imparziale identificato una mutazione missense, G73E, nel altamente conservato dominio HMG di legame al DNA del Caenorhabditis elegans fattore di trascrizione SOX-2. I risultati mutazione in una trasformazione dell'identità cellulare dei neuroni olfattivi AWB in AWC neuroni olfattivi a livello molecolare, morfologico e funzionale ^5,10. SOX-2 regola in maniera differenziale la differenziazione terminale dei neuroni AWB e AWC interagendo con fattori socio di trascrizione dipendenti dal contesto e rispettivoSiti bersaglio DNA ^5,10. SOX-2 partner con LIM-4 (LHX) in terminale AWB differenziamento neuronale, mentre SOX-2 partner con CEH-36 (OTX / OTD) in terminale AWC differenziamento neuronale. Saggi di luciferasi mostrano che SOX-2 e mutante SOX-2 proteine ^G73E avere interazioni cooperative con cofattori trascrizionali LIM-4 e CEH-36 per attivare un promotore espresso nei neuroni AWB e AWC. Tuttavia, SOX-2 e mutante SOX-2 ^G73E visualizzate le proprietà di attivazione differenziale del promotore. Per studiare le basi molecolari del DNA differenziali attività vincolanti SOX-2 e SOX-2 ^G73E, fEMSAs sono stati eseguiti con queste proteine e le loro potenziali siti bersaglio.

In primo luogo, un approccio bioinformatica è stato preso per identificare il DNA biologicamente rilevante sequenze di legame all'interno della regione promotrice 1 kb usati nel saggio luciferasi. Dal momento che più potenziali SOX-2 siti di legame erano presenti in tutto il promotore, ci siamo concentratiil predetto SOX-2 siti di legame adiacenti putativo CEH-36 o LIM-4 siti di legame e evolutivamente conservati tra le varie specie di nematodi. Queste sequenze sono stati cancellati o mutati, e successivamente testati in vivo per la loro attività di esprimere GFP transgeni giornalista nei neuroni AWB o AWC. Grazie a questo approccio, abbiamo identificato potenziali LIM-4 / SOX-2 e CEH-36-2 SOX siti bersaglio adiacenti / che sono specificamente richiesti per l'espressione di GFP in AWB e AWC neuroni, rispettivamente ^5. Abbiamo studiato le potenziali differenze nel legame al DNA di SOX-2 e SOX-2 ^G73E utilizzando FEMSA con le identificati LIM-4 / SOX-2 e CEH-36 / SOX-2 siti bersaglio adiacenti. La nostra analisi ha mostrato che EMSA SOX-2 ^G73E non vincola la sonda di DNA che contiene le LIM-4 / SOX-2 siti di destinazione adiacenti (necessari per l'espressione genica in AWB) nel modo più efficiente WT SOX-2 ha fatto. Tuttavia, SOX-2 e SOX-2 ^G73E avevano alcuna differenza nel legame della sonda di DNA che contiene il CEH-36 / SOX-2 unsito di destinazione djacent (necessaria per l'espressione genica in AWC) ^5,10. Il nostro FEMSA analizza fornire la comprensione meccanicistica della natura del ^G73E mutazione SOX-2 in interessano specifica attività di legame al DNA per l'identità delle cellule trasformazione fenotipo AWB-to-AWC. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato di FEMSA utilizzando 6xHis-SOX-2 purificati o 6xHis-SOX-2 ^G73E insieme a fluorescenza a raggi infrarossi sonde di DNA dye-marcato contenenti le LIM-4 / SOX-2 siti di destinazione adiacenti come un caso di studio per affrontare un'importante questione biologica.

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Protocollo

NOTA: EMSAs utilizzando sonde di DNA fluorescente o altre forme di DNA marcato condividono gli stessi protocolli per la preparazione di proteine o estratto cellulare, la proteina-DNA reazione di legame, e la preparazione del gel PAGE e in esecuzione (Figura 1A). Le principali differenze sono procedure DNA di etichettatura, fasi di lavorazione gel post-visione e metodi di rilevamento.

1. Gel di Preparazione

1. Preparare 5% gel di poliacrilammide nativo contenente 0,5x TBE (45 mM Tris-borato, 1 mM EDTA) e il 2,5% glicerolo, utilizzando un mini sistema di gel di proteine ​​(8,3 cm di larghezza x 7.3 cm di spessore di lunghezza x 0,75 mm).
   1. Per preparare 30 mL di soluzione di gel per 4 gel, mescolare 5 ml di 30% acrilamide / Bis (37,5: 1), 3 mL di 5x TBE (0,45 M Tris-borato, 10 mM EDTA), 1,5 mL di 50% glicerolo, 300 ml di 10% persolfato di ammonio, 15 ml di TEMED, e 20,2 ml di DDH ₂ O accuratamente.
      NOTA: L'acrilamide è nocivo e tossico, gestire gli opportuni dispositivi di protezione individuale.
2. Cast immediatamente la soluzione di gel. Dopo la polimerizzazione, avvolgere i gel nella pellicola trasparente pre-bagnato con 0,5x TBE e conservarli a 4 ° C.

2. Preparazione di sonde a raggi infrarossi colorante fluorescente etichettati

NOTA: Mantenere gli oligonucleotidi coloranti fluorescenti etichettati infrarosso lontano dalla luce il più possibile durante la preparazione, lo stoccaggio, ed esperimenti.

1. Creare e ordinare oligonucleotidi.
   1. Disegno lungo oligonucleotide per ~ 51-mers.
      NOTA: La lunga sequenza di oligonucleotidi della sonda LIM-4 / SOX-2 è TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC. oligonucleotidi lunghi non richiedono PAGE o purificazione HPLC.
   2. Progettare oligonucleotidi brevi complementari per ~ 14-mers con fluorescenza a raggi infrarossi modifica colorante al 'capolinea 5 (5'Dye) e una temperatura di fusione superiore a 37 ° C.
      NOTA: La breve sequenza di oligonucleotide della LIM-4 / SOX-2 sonda è 5'Dye-GGGAGAAGATTTTG. La scala minima sintesi di oligonucleotidi brevi 5'Dye-etichettati è 100 nm. Pertanto, gli oligonucleotidi richiedono purificazione HPLC.
2. oligonucleotidi Risospendere in 1x tampone Tris-EDTA (TE: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) alla concentrazione finale di 100 mM.
3. Ricottura Short (5'Dye) e oligonucleotidi lunghi.
   1. Mescolare 0,6 ml di 5'Dye-Short oligo (100 mM), 1,2 ml di oligo Long (100 mM) e 28,2 ml di cloruro di sodio-Tris-EDTA (STE: 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) in una provetta da 1,5 ml.
   2. Posizionare il tubo in acqua bollente per 5 min. Spegnere la fonte di calore e lasciare che l'acqua con le oligos ricotto raffreddare O / N al buio.
4. Compilare sbalzi di ricotto 5'Dye corta / oligonucleotidi lunghi con polimerasi Klenow DNA 5 'effettuare doppie sonde a DNA bloccati.
   1. Preparare la reazione mescolando30 ml di ricotto brevi lunghi oligo / con tag 5'Dye, 8,5 ml di 10x Klenow tampone, 1,7 ml di 10 mM dNTP, 1,7 ml di Klenow (3 '-> 5' eso) (5 U / mL), e 43,1 ml di DDH ₂ O in un tubo di 0,2 ml PCR.
   2. Incubare 60 minuti a 37 ° C in una macchina PCR.
   3. Aggiungere 3,4 ml di 0,5 M EDTA per bloccare la reazione e inattivare a caldo a 75 ° C per 20 minuti in una macchina PCR.
5. Diluire sonde compilati (0,7 micron) a STE per concentrazione finale di 0,1 micron.
6. oligo conservare a -20 ° C al buio fino al momento dell'uso. Oligonucleotidi possono essere conservati fino a un anno in questa condizione.
   NOTA: Per generare sonde di DNA con siti di legame mutanti, le versioni mutanti di lunghe oligonucleotidi sono ricotto con oligonucleotidi brevi 5'Dye-etichettati, seguita da fill-in di 5 'strapiombi con Klenow. È stato dimostrato che la sonda con un filamento marcato con un fluorescente infrarossodye ha solo il 30% dell'intensità della sonda con entrambi i filamenti etichettati con il colorante. Se l'intensità del segnale deve essere rafforzata, lunghe oligos di entrambi i filamenti sono etichettati con coloranti fluorescenti infrarossi al 5 'Termini e ricotta per rendere fluorescenti infrarossi sonde dye-etichettati.

3. Preparazione di adenoide / freddo Sonde (concorrenti)

Nota: oligonucleotidi lunghi di sequenze complementari (lunghe e LongR) sono stati ricotto per rendere le sonde senza etichetta per l'analisi della concorrenza con fluorescenti infrarossi sonde dye-etichettati.

1. Mescolare 20 ml di 100 mM lunghi, 20 ml di 100 mM LongR oligonucleotidi, e 60 ml di STE in una provetta da 1,5 ml.
2. Posizionare il tubo in acqua bollente per 5 minuti, spegnere la fonte di calore e lasciare che l'acqua con le oligos ricotto raffreddare durante la notte.

4. reazione di legame e di elettroforesi

1. Preparare 1 ml di tampone di legame 5x mescolando 50 microlitri60; di 1 M Tris-HCl, pH 7.5; 10 ml di 5 M NaCl; 200 ml di 1 M KCl, 5 ml di 1 M MgCl _2, 10 ml di 0,5 M EDTA, pH 8,0; 5 ml di 1 M DTT; 25 ml di 10 mg / ml BSA, e 695 ml di DDH ₂ O.
   NOTA: Il 5x Binding Buffer può essere aliquotati e conservati a -20 ° C. Un altro punto da considerare è che i diversi fattori di trascrizione avranno diverse modifiche al tampone di legame.
2. A destra prima di impostare le reazioni di legame, pre-eseguire il gel di poliacrilammide nativo 5% a 0,5x TBE + 2,5% glicerolo per rimuovere tutte le tracce di ammonio persolfato a 80 V per il 30 - 60 min, o fino a quando la corrente non è più varia nel tempo.
3. Impostare la reazione di legame in volume finale di 20 microlitri.
   1. Mescolare 4 ml di tampone di legame 5x 80 - 200 ng purificata proteina A (in 50% glicerolo, cioè, SOX-2), 1 ml di 0,1 pM sonda Dye-coniugato (conc finaleentration: 5 Nm), e DDH ₂ O.
   2. Opzionale: Quando sono richieste concorrenti della sonda fredda, aggiungere diverse concentrazioni (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, etc.) di sonde fredde.
   3. Opzionale: Quando (cioè, SOX-2 e LIM-4) viene testato l'interazione tra le proteine A e B, Aggiungere 80 - 200 ng purificata proteina B (in 50% glicerolo, cioè, LIM-4).
   4. Opzionale: Quando si utilizza la preparazione estratto nucleare e legame specifico di proteina A deve essere convalidata, aggiungere anticorpo specifico per la proteina A (cioè, anti-6xHis, anti-FLAG, ecc).
   5. Incubare a R / T in buio per 15 min.
4. Caricare tutta la reazione di legame sul gel ed eseguire il gel a 10 V / cm a distanza desiderata.

5. Imaging

NOTA: Il gel è stato scansionato direttamente nelle lastre di vetro con un sistema di imaging a raggi infrarossi avanzata. Pertanto, il gel può essere risolto ulteriormente e scansione ripetutamente (Figure 1C e 2). Un sistema di imaging a fluorescenza vicino infrarosso principalmente per Western blot è stato testato anche per la scansione del gel, ma solo il sistema di imaging ad infrarossi è in grado di eseguire la scansione del gel con buona risoluzione. La metodologia descritta è specifico per un particolare software di imaging a raggi infrarossi, anche se altri pacchetti software possono essere utilizzati.

1. Pulire il letto dello scanner con DDH ₂ O e asciugare bene prima della scansione. Asciugare le lastre di vetro del gel e posizionare le piastre contenenti il ​​gel sul piano dello scanner.
2. Aprire il software di imaging a raggi infrarossi e passare alla scheda 'Acquire'. Quando la piastra sottile (1 mm) è collocato sul piano dello scanner, utilizzare le impostazioni di canale: 700, Intensità: Auto, Risoluzione: 169 micron, Qualità: media, e Focus compensati: 1.5 mm. Quando la piastra spessa (3 mm) è collocato sul piano dello scanner, utilizzare le impostazioni di canale: 700, Intensità: Auto, Risoluzione: 84 micron, Qualità: media, e Focus offset: 3,5 mm. compensati fuoco dipende dallaspessore della lastra di vetro.
3. Selezionare l'area che il gel occupa sullo scanner. Fare clic su 'Start' per avviare la scansione.
4. Ripetere elettroforesi e scansione in aggiunta, se necessario.

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Risultati

Arancio G loading dye (6x: 0,12 g arancione G in 100 ml 30% glicerolo) possono essere aggiunti alla reazione di legame prima del caricamento per visualizzare il progresso della elettroforesi. Altri coloranti di carico tra cui blu bromofenolo saranno rilevati durante la scansione e quindi interferire con l'analisi delle immagini (Figura 1B).

In alcuni casi di EMSAs, soprattutto se si utilizza la preparazion...

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Discussione

fEMSAs sono uno strumento efficace per studiare le interazioni proteina-DNA, e sono una alternativa alla marcatura radioattiva del DNA. Coloranti fluorescenti come coloranti infrarossi sono disponibili in commercio, e forniscono un metodo più sicuro e più ecologico rispetto all'etichettatura DNA radioattivo. EMSAs utilizzando fluorescenti infrarossi oligonucleotidi dye-marcato non richiedono fasi di lavorazione gel postrun, e quindi risparmiare tempo e costi rispetto ad altre tecniche di marcatura del DNA. Il temp...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	Bio-Rad	1610158	Acrylamide is harmful and toxic.
6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8)	ThermoFisher	MA1-21315
Anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165-.2MG
Bovine Serum Albumin (BSA) molecular biology grade	New England Biolabs	B9000S
5'IRDye700-labeled DNA Oligos	Integrated DNA Technologies	Custom DNA oligo	These are referred to as "5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos" in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled-DNA oligonucleotides. Requires minimum 100 μM scale synthesis and HPLC purification.
Klenow Fragment (3'-->5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
LightShif Poly (dI-dC)	ThermoFisher	20148E
Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell	Bio-Rad	1658000FC	This is referred to as a 'mini protein gel system' in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25 cm x 25 cm in size.
Odyssey CLx Infrared Imaging System	LI-COR Biotechnology	Odyssey CLx Infrared Imagng System	This is referred to as an 'advanced infrared imaging system' in the manuscript.
Odyssey Fc Imaging System	LI-COR Biotechnology	Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System	This is referred as a 'near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots' in the manuscript.
Image Studio software (version 4.0)	LI-COR Biotechnology	Image Studio software	This is referred to as a 'particular imaging software' in the manuscript.
Orange G	Sigma-Aldrich	O3756-25G
6x Orange loading dye			0.25% Orange G; 30% Glycerol
0.5x TBE			45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA
1x TE			10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
1x STE			100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
5x Binding Buffer			50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 μg/mL BSA