Un protocollo per l'utilizzo di trasferimento di energia per risonanza (FRET) biosensori -force per misurare le forze meccaniche in tutto il complesso LINC nucleare

Riepilogo

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Abstract

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

Introduzione

Sensibile alla Forza, sensori FRET geneticamente codificati recente sono emersi come uno strumento importante per misurare forze di trazione basati in cellule vive, permettono di approfondire come le forze meccaniche vengono applicate attraverso proteine ^{1, 2, 3, 4.} Con questi strumenti, i ricercatori possono immagine in modo non invasivo le forze intracellulare nelle cellule viventi utilizzano microscopi a fluorescenza convenzionali. Questi sensori sono costituiti da una coppia FRET (proteine fluorescenti donatore e accettore, più frequentemente un donatore e accettore blu giallo) separati da un peptide elastico ^3. Contrariamente a C- o codifica N-terminale, questo sensore è inserito in un sito interno di una proteina per misurare la forza meccanica trasmessa attraverso la proteina, comportandosi come un estensimetro molecolare. Aumento della tensione meccanica di tutti i risultati dei sensori in un aumento della distanza tra il FRET-pl'aria, con conseguente diminuzione FRET ^3. Come risultato, il FRET è inversamente proporzionale alla forza di trazione.

Questi sensori fluorescenti basati sono stati sviluppati per proteine adesione focale (vinculin ³ e talin ^4), proteine del citoscheletro (α-actinina ^5), e proteine di giunzione cellula-cellula (E-caderina ^{6, 7,} VE-caderina ^8, e PECAM ^8). Il linker elastico più utilizzato e ben caratterizzato in questi biosensori è noto come TSmod e consiste in una sequenza ripetitiva di 40 amminoacidi, (GPGGA) _8, che sono stati ottenuti dalla flagelliform proteina seta di ragno. TSmod ha dimostrato di comportarsi come un elastico nano-molla lineare, con FRET reattività per 1 a 5 pN della forza di trazione ^3. Diverse lunghezze di flagelliform possono essere utilizzati per modificare la dinamica range di TSmod FRET-forza sensibilità ^9. Oltre a flagelliform, spettrina ripete ⁵ e villin testata peptide (noto come HP35) ⁴ sono stati usati come i peptidi elastici tra FRET coppie in simili forza biosensori ^4. Infine, un recente rapporto ha mostrato che TSmod può anche essere utilizzato per rilevare forze di compressione ^10.

Abbiamo recentemente sviluppato un sensore di forza per il linker del nucleo-citoscheletro (LINC) complesso proteico Nesprin2G utilizzando TSmod inserito in una proteina troncata Nesprin2G precedentemente sviluppato noto come mini-Nesprin2G (Figura 2C), che si comporta in modo simile a endogena Nesprin-2G ^11. Il complesso LINC contiene più proteine ​​che portano dall'esterno verso l'interno del nucleo, che collega il citoscheletro citoplasmatica alla lamina nucleare. Nesprin-2G è vincolante una proteina strutturale sia allaactina citoscheletro nel citoplasma e alle proteine ​​SUN nello spazio perinucleare. Utilizzando il nostro biosensore, siamo stati in grado di dimostrare che Nesprin-2G è soggetto a tensioni actomiosina-dipendente NIH3T3 fibroblasti ^2. Questa è stata la prima volta che la forza è stata misurata direttamente attraverso una proteina nel complesso LINC nucleare, ed è destinato a diventare uno strumento importante per comprendere il ruolo della forza sul nucleo in mechanobiology.

Il protocollo che segue una metodologia dettagliata di come utilizzare il sensore di forza Nesprin-2G, compresa l'espressione del sensore di tensione Nesprin (Nesprin-TS) in cellule di mammifero, nonché l'acquisizione e l'analisi di immagini FRET su cellule che esprimono Nesprin- TS. Utilizzando un microscopio confocale invertito equipaggiato con un rivelatore spettrale, una descrizione di come misurare emissioni sensibilizzate FRET utilizzando unmixing spettrale e di imaging raziometrico FRET è disponibile. Le immagini raziometriche uscita possono essere usati per fare relativa quaconfronti forza ntitative. Mentre questo protocollo è focalizzata sull'espressione di Nesprin-TS in fibroblasti, è facilmente adattabile ad altre cellule di mammifero, entrambe le linee cellulari e cellule primarie. Inoltre, questo protocollo in cui riguarda l'acquisizione delle immagini e analisi FRET può essere facilmente adattato ad altri biosensori forza FRET-based che sono stati sviluppati per altre proteine.

Protocollo

1. Ottenere Nesprin-2G sensore DNA e di altri DNA plasmidico

1. Ottenere Nesprin-2G TS (sensore di tensione) controllo, Nesprin-2G HL (senza testa), mTFP1, venere, e TSmod da una fonte commerciale. Propagare tutti i plasmidi di DNA e purificare utilizzando ceppi standard di E. coli, come DH5-α, come descritto in precedenza ^{12, 13.}

2. Le cellule trasfezione con Nesprin-2G e altri plasmidi DNA

1. Coltivare fibroblasti NIH 3T3 cellule al 70-90% di confluenza in un piatto di coltura cellulare 6 pozzetti in un incubatore standard di coltura cellulare con la temperatura (37 ° C) e regolazione CO ₂ (5%). Per mezzo di crescita cellulare, utilizzare Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino.
2. In una cappa di coltura cellulare, rimuovere il terreno e risciacquare ciascun pozzetto con circa 1 ml di medium di cellule ridotto siero. Aggiungere 800 ml di media cella ridotto siero in ciascun pozzettoe posizionare la camera 6 pozzetti in incubatrice.
3. Pipettare 700 ml di mezzo di cellule ridotto siero in una provetta da 1,5 ml con 35 ml di soluzione di veicolo lipidico per formare il "lipomix". Mescolare pipettando. Etichettare la provetta con una "L"
4. Raccogliere sei provette da 1,5 mL e li etichetta 1 a 6. Pipettare 100 ml di mezzo di cellule ridotto siero in ciascuna provetta.
   1. Utilizzando la concentrazione di DNA plasmidico dal passaggio 1 pipetta 2 pg di Nesprin 2G-TS in tubi 1 e 2. Pipettare 2 ug di Nesprin-HL in tubi 3 e 4. Pipettare 1 ug mTFP nel tubo 5. Pipettare 1 pg di mVenus nel tubo 6. non riutilizzare i puntali delle pipette durante la dispensazione diversi tipi di DNA.
5. Pipetta 100 microlitri della lipomix dal tubo "L" in ogni provetta etichettata (1-6) e mescolare pipettando ripetutamente. Utilizzare una pipetta pulita per ogni provetta. Incubare per 10-20 minuti.
6. Aggiungere 200 microlitri da ogni provetta etichettata ad un pozzo nella camera 6 pozzetti con 70-90% confluentile cellule. Etichettare la parte superiore di ciascun pozzetto con il DNA corrispondenti aggiunto. Posizionare la camera 6 pozzetti in un incubatore per 4-6 h.
7. Aspirare il terreno e aggiungere 1-2 ml di mezzo di cellule ridotto siero risciacquo. Aspirare il mezzo cellule ridotta siero, aggiungere 2 ml di tripsina a ciascun pozzetto, e posizionare il piatto 6 pozzetti nell'incubatrice (5-15 min).
8. Mentre le cellule si staccano nell'incubatrice, cappotto 6 fondo di vetro visualizzazione piatti con uno strato di fibronectina ad una concentrazione di 20 ug / ml disciolto in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Consentire i piatti per rivestire la superficie del cofano coltura cellulare (circa 20 minuti).
9. Neutralizzare la tripsina aggiungendo 2 mL di DMEM volta che le cellule sono staccati.
10. Trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in una provetta da centrifuga da 15 ml etichettati e centrifugare a 90 xg per 5 minuti in una centrifuga rotore oscillante. Aspirare il surnatante e risospendere ogni pellet cellulare in 1.000 ml di DMEM con pipetta di miscelazione.
11. Aspirare la miscela fibronectina dalpiatti di vetro e pipetta 1000 microlitri di ciascuna sospensione cellulare sulle stoviglie in vetro.
12. Dopo che le cellule si depositano sul fondo dei piatti di vetro (~ 15 min), aggiungere un altro 1 ml di DMEM + 10% FBS + 1% Pen-Strep ciascun pozzetto e posto nell'incubatrice cella. Permettono alle cellule per fissare e esprimere sensore per almeno 18-24 ore.
    NOTA: Le cellule sono transfettate utilizzando cationici reagenti di transfezione lipidi commerciali (vedere la tabella dei materiali). Alternativamente, linee cellulari stabili possono essere selezionati utilizzando un plasmide con un gene che conferisce resistenza ad una tossina (plasmidi pcDNA per Nesprin-TS e -HL sono disponibili su un sito repository DNA (vedere la tabella dei materiali) fornire cellule che esprimono resistenza geneticina ). Inoltre, metodi di infezione virale (lentivirus, retrovirus o adenovirus) possono essere utilizzati per esprimere il sensore in cellule che sono difficili da trasfettare.
13. Oltre a Nesprin-TS, trasfettare cellule aggiuntivi con l'Nesprin HL zero percontrollo CE, come descritto ai punti 2.1-2.12; TSmod può anche essere usato come controllo zero forza e deve presentare FRET simile a Nesprin-HL.
14. cellule trasfezione con mTFP1 e venus per generare impronte spettrali (vedere fase 4).
    NOTA: mTFP1 e venus tipicamente esprimono a livelli superiori Nesprin-TS, e, come tale, può essere necessario transfettate per raggiungere livelli di espressione simili minori quantità di DNA.

3. Verificare Trasfezione efficienza

1. Approssimativamente 18-24 ore dopo aver completato la trasfezione, utilizzare un microscopio a fluorescenza invertito per esaminare l'efficienza di trasfezione confrontando il numero di cellule fluorescenti al numero totale di cellule in vista (di solito 5-30%).
   1. Utilizzare un microscopio a fluorescenza equipaggiato con una frequenza di eccitazione vicino 462 nm (mTFP1) o 525 nm (venere) ed un filtro di emissione centrato vicino 492 nm (mTFP1) o 525 nm (venere).
      NOTA: In alternativa, GFP set di filtri catturerà una combinazione di mTFP1 e vele emissioni di Nus e permetterà la conferma della efficienza di trasfezione.
2. Immagine cellule vive entro 48 ore dopo la trasfezione.
   1. In alternativa, fissare le cellule in 4% paraformaldeide in PBS (con calcio e magnesio) per 5 min, conservare in PBS, e visualizzazione dopo 48 h ^8.
      NOTA: Al di là di 48 ore, la qualità del segnale e la forza decade. Fissa le cellule preserva il loro stato, compreso il FRET espressi ^8; Tuttavia, le cellule devono essere esposte solo in PBS, come mezzo di fissaggio può influire FRET ^14. Cellule fisse possono essere confrontati solo ad altre cellule fisse, come ci può essere un cambiamento di espressione.
      Attenzione: Paraformaldeide è tossico. Indossare dispositivi di protezione adeguati (DPI).

4. Acquisizione spettrale impronte digitali di mTFP1 e Venere Fluorofori per spettrale unmixing

1. In una cappa di coltura cellulare, sostituire il mezzo cella con l'imaging medium (HEPES-buffered) supplementato con 10% siero bovino fetale.
2. Porre le capsule visualizzazione in (37 ° C) fase di microscopio confocale a temperatura controllata.
3. Porre la capsula di visualizzazione in vetro con cellule mTFP1 transfettate oltre l'obiettivo dell'olio a 60X ingrandimenti, con un'apertura numerica di 1,4.
   NOTA: L'olio viene utilizzato su un microscopio a scansione laser sull'obiettivo 60X per assomigliare da vicino l'indice di rifrazione del substrato di vetro. L'olio è posto sulla parte superiore della lente dell'obiettivo e viene in contatto diretto con il vetro coprioggetto.
4. Localizzare mTFP1 cellule che esprimono con una sorgente di eccitazione 458 nm ed un filtro passa-banda di emissione centrato a 500 nm.
5. Con una cella fluorescente nel campo visivo, selezionare la modalità di rilevamento spettrale ( "Modo Lambda" nel software utilizzato qui) e catturare l'immagine spettrale (Figura 3-1); includere tutte le frequenze oltre 458 nm utilizzando incrementi di 10 nm (Figura 3-3). Selezionare un fl luminosoent regione (ROI) sulla cella (raggio 20 pixel).
   NOTA: La forma spettrale della mTFP1 esprimono ROI dovrebbe rimanere relativamente costante attraverso la cella. Se la forma varia considerevolmente, ri-regolare il laser e ottenere impostazioni per migliorare il rapporto segnale-rumore.
6. Aggiungere il ROI fluorescente dire, l'intensità normalizzata al database spettrale facendo clic su "salva spettri al database."
7. Ottimizzare la potenza del laser e di ottenere tale che un buon rapporto segnale-rumore è raggiunto. Impostazioni varieranno per diverse apparecchiature. Uso non fluorescenti, le cellule non transfettate come riferimento sfondo, aumentare il guadagno e la potenza finché le cellule sono luminose, ma non oltre la gamma dinamica del rivelatore (punto di saturazione). le cellule di sfondo non dovrebbero avere la fluorescenza rilevabile dopo una media di.
8. Ripetere la procedura per le cellule venus-trasfettate con le seguenti eccezioni:
   1. Assicurarsi che la frequenza di eccitazione è a 515 nm e che il filtro passa-banda è centered vicino a 530 nm quando localizzare le cellule venus-esprimono.
   2. Nel "Modo Spectral", utilizzare una frequenza di eccitazione di 515 nm invece di 458 nm.

5. Acquisire immagini non miscelati

1. Attivare la modalità di cattura per "spettrale unmixing."
2. Aggiungere le impronte spettrali di venere e mTFP1 nei canali unmixing (Figura 3, ALT-2).
3. Impostare il laser di eccitazione ad una fonte di argon 458 nm.
4. Porre la capsula visualizzazione Nesprin-TS sopra dell'obiettivo olio 60X.
5. Dopo aver focalizzato su una cella fluorescente con espressione sufficientemente chiara, regolare la potenza del laser guadagno e per ottimizzare il rapporto segnale-rumore.
   NOTA: Poiché l'efficienza FRET di Nesprin-TS è vicina al 20%, l'immagine mescolate venere dovrebbe essere sostanzialmente dimmer dell'immagine mTFP1 mescolate rispetto. Una volta che un livello di potenza e guadagno accettabile sono stati determinati iterativamente, questi parametri devono rimanere costanti per tutte le immagini captured.
6. Acquisire un minimo di 15-20 immagini di cellule Nesprin-TS con una luminosità relativamente simili, evitando un'eccessiva saturazione pixel (tutti i pixel saturi vengono rimossi durante l'elaborazione dell'immagine).
7. Ripetere il processo di cattura dell'immagine con cellule Nesprin-HL, utilizzando parametri di imaging identici.

Elaborazione 6. immagine e Rapporto Image Analysis

1. Utilizzando il software open-source ImageJ (FIJI) (http://fiji.sc/), le immagini in formato nativo aperti con BioFormats Reader.
2. Pre-elaborare le immagini e calcolano le immagini rapporto utilizzando protocolli stabiliti in precedenza ^15.

Risultati

Seguendo il protocollo di cui sopra, il DNA plasmidico è stato acquisito dal repository DNA e trasformato in cellule di E. coli. E. coli che esprimono il DNA sensore sono stati selezionati da LB / piastre ampicillina e amplificati in un brodo LB liquido. Seguendo l'amplificazione dei vettori, plasmidi di DNA sono stati purificati in tampone TRIS-EDTA utilizzando uno standard, disponibile in commercio Kit di isolamento del DNA. Utilizzando uno spettrofotometro, DNA ...

Discussione

Procedimento e dimostrazione di cellule vive di tensione meccanica di tutti Nesprin-2G, una proteina nel complesso LINC nucleare, è stata illustrata sopra. Prima di questo lavoro, varie tecniche, come micropipetta aspirazione, magnetico-tallone citometria, e microscopica laser ablazione, sono stati utilizzati per applicare tensione sul nucleo cellulare e per misurare le proprietà materiali sfusi ^{16, 17, 18.} Tutta...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nesprin-TS DNA	Addgene	68127	Retrieve from https://www.addgene.org/68127/
Nesprin-HL DNA	Addgene	68128	Retrieve from https://www.addgene.org/68128/
mTFP1 DNA	Addgene	54613	Retrieve from https://www.addgene.org/54613/
mVenus DNA	Addgene	27793	Retrieve from https://www.addgene.org/27793/
TSmod DNA	Addgene	26021	Retrieve from https://www.addgene.org/26021/
Competent Cells	Bioline	BIO-85026
Liquid LB Media	ThermoFisher	10855001	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001
Solid LB Bacterial Culture Plates	Sigma-Aldrich	L5667	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en&region=US
Ampicillin	Sigma	A9518
Spectrophotometer	Biorad	273 BR 07335	SmartSpec Plus
quartz cuvette	Biorad	1702504	Cuvette for SmartSpec Plus
DNA isolation kit	Macherey-Nagel	740412.5	NucleoBond Xtra Midi Plus
6-well cell culture dish	Falcon-Corning	353046	Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish
Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media	Gibco	11995-065	DMEM(1x)
Bovine Serum	Life Technologies	16170-078
reduced serum cell media	Gibco	31985-070	Reduced Serum Medium, "optimem"
Lipid Carrier Solution	invitrogen	11668-019	Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000"
1.5 mL sterile plastic tube	Denville	c2170
Trypsin	Gibco	25200-056	0.25% Trypsin-EDTA (1x)
glass-bottom microscope viewing dish	In Vitro Scientific	D35-20-1.5-N	35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass
Fibronectin	ThermoFisher	33016015	fibronectin human protein, plasma
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
15 mL sterile centrifuge tube	Greiner bio-one	188261
swinging rotor centrifuge	Thermo electron	Centra CL2	Swinging rotor thermo electron 236
cell culture biosafety hood	Forma Scientific	1284
climate controlled cell culture incubator	ThermoFisher	3596
inverted LED widefield fluorescent microscope	Life technologies	EVOS FL
Clear HEPES buffered imaging media	Molecular Probes	A14291DJ
Fetal bovine Serum	Life technologies	10437-028
Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources	Zeiss	LSM 710-w/spectral META detector
Outgrowth Media	Newengland Biolabs	B9020s
NIH 3T3 Fibroblasts	ATCC	CRL-1658