Condrogenico Differenziazione induzione di cellule staminali derivate da tessuto adiposo per gravità centrifuga

Riepilogo

Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.

Abstract

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes differentiated from stem cells using cytokines. Unfortunately, cytokine-induced chondrogenic differentiation is costly, time-consuming, and associated with a high risk of contamination during in vitro differentiation. However, biomechanical stimuli also serve as crucial regulatory factors for chondrogenesis. For example, mechanical stress can induce chondrogenic differentiation of stem cells, suggesting a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. In this study, we demonstrated that centrifugal gravity (CG, 2,400 × g), a mechanical stress easily applied by centrifugation, induced the upregulation of sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in adipose-derived stem cells (ASCs), causing them to express chondrogenic phenotypes. The centrifuged ASCs expressed higher levels of chondrogenic differentiation markers, such as aggrecan (ACAN), collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), and collagen type 1 (COL1), but lower levels of collagen type 10 (COL10), a marker of hypertrophic chondrocytes. In addition, chondrogenic aggregate formation, a prerequisite for chondrogenesis, was observed in centrifuged ASCs.

Introduzione

Difetti di cartilagine articolare non guariscono naturalmente. Di conseguenza, trapianto di cellule staminali è stata proposta come un approccio promettente per la riparazione della cartilagine compromessa. Tuttavia, questo metodo richiede sia l'acquisizione di un numero sufficiente di cellule staminali e l'induzione di queste cellule a subire differenziazione condrogenico. Il midollo osseo (BM) è stato ampiamente utilizzato come fonte di cellule staminali, ma l'isolamento delle cellule da BM ha due principali svantaggi: invasività e di rendimento insufficiente. A causa della sua facilità di acquisizione, tessuto adiposo è fonte preferibile di cellule staminali. Studi precedenti hanno dimostrato la fattibilità di isolare cellule staminali dal tessuto adiposo e indurre la differenziazione condrogenica in queste cellule con citochine, come TGF-β1 ^{1, 2.} Questi metodi sono efficaci ma costosi.

Come un più basso costo alle citochine, stress meccanico può essere utilizzato perindurre la differenziazione condrogenico. Carico meccanico gioca un ruolo fondamentale nel mantenimento della salute della cartilagine articolare ^3, e può indurre fenotipi condrogeniche in varie cellule. Ad esempio, la pressione idrostatica induce fenotipi condrogeniche in cellule progenitrici derivate dal sinovio attraverso la via MAP chinasi / JNK ^4, e la compressione meccanica induce condrogenesi nelle cellule staminali mesenchimali umane (MSC) per upregulating geni chondrocytic ^5. Inoltre, shear stress contribuisce alla espressione della matrice extracellulare chondrogenesis legati (ECM) di MSC umani ^6. Gravità centrifugo (CG), uno stress meccanico facilmente applicata e controllata generato per centrifugazione, può indurre l'espressione genica differenziale in cellule ^7. Ad esempio, nelle cellule di carcinoma epiteliale polmonare, l'espressione di interleuchina (IL) -1 ter è upregulated per centrifugazione ^8. Therefore, come sollecitazioni meccaniche sperimentalmente inducibile, CG può essere utilizzato per indurre l'espressione genica in cellule staminali chondrocytic. Tuttavia, non è chiaro se CG può indurre la differenziazione delle cellule staminali condrogenica.

In questo studio, abbiamo scoperto che CG ha indotto la upregulation di SOX9, un regolatore maestro di condrogenesi, in ASC umani, causando la sovraespressione di geni chondrocytic. Inoltre, abbiamo confrontato gli effetti di CG su chondrogenesis con quelli di TGF-β1, il fattore di crescita più comunemente utilizzati per indurre in vitro condrogenesi nelle cellule staminali.

Protocollo

Questo protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università Cattolica di Corea (KC16EAME0162) ed eseguito secondo le direttive NIH. Tutti i tessuti sono stati ottenuti con il consenso informato scritto.

1. centrifuga carico gravitazionale e la cultura Pellet

1. coltura cellulare e la raccolta
   1. ASC Culture (P2-P3, vedere elenco dei materiali) in Modified medio-basso livello di glucosio Eagle Dulbecco (DMEM-LG) supplementato con siero 10% fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina (P / S) a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente 5% di CO _2.
   2. Quando le cellule raggiungono 80% di confluenza, scartare il mezzo e lavare le cellule con 5 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS).
   3. Aggiungere 1 ml di PBS contenente 1 mM EDTA e incubare per 2 minuti a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente 5% di CO _2.
   4. Toccare la piastra di coltura delicatamente, aggiungere 4 ml di terreno fresco, trasferire le cellule aun tubo da 15 ml conica e centrifugare le cellule a 250 xg per 2 minuti a temperatura ambiente (RT).
2. carico gravitazionale centrifuga
   1. Dopo la centrifugazione (fase 1.1.4), rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet e risospendere il pellet in 10 ml di DMEM-LG con il 10% FBS. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
   2. Per CG caricamento, trasferire 2,5 × 10 ⁵ cellule in una nuova provetta conica da 15 ml e centrifugare a 2400 g per 15 min.
3. cultura pellet
   1. Subito dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e aggiungere 500 ml di mezzo di differenziazione condrogenico definito (CDM, DMEM ad alto glucosio integrato con 1% FBS, 1% ITS + Premix, 100 nM desametasone, soluzione di aminoacidi 1x MEM non essenziali, 50 mcg / mL L-prolina, e l'1% di penicillina / streptomicina). Aggiungere 50 mg / mL di preparati di acido L-ascorbico 2-fosfato ad ogni cambio medio. Come controllo positivo, indurre differentiati condrogenichesu cellule non centrifugati con l'aggiunta di CDM contenente 10 ng / mL TGF-β1.
   2. Posizionare i tubi liberamente innevate contenenti il pellet in una posizione in piedi e incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO _2.
   3. Modificare il medium a giorni alterni per 3 settimane.
4. cultura Micromass
   1. Immediatamente dopo la centrifugazione (fase 1.2.2; 2.400 × g per 15 min), aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di CDM.
   2. Per formare un Micromass, posizionare le cellule risospese nel centro di un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti.
   3. Dopo 2 h, aggiungere con attenzione 1 mL di CDM al pozzo, pipettaggio contro la parete della piastra di non perturbare il Micromass. Come controllo positivo, eseguire una cultura Micromass con le cellule non centrifugati con l'aggiunta di CDM contenente 10 ng / mL TGF-β1.
   4. Incubare la Micromass a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente 5% di CO _2.
   5. Modificare l'ev medioery altro giorno per 3 settimane.

2. trascrittasi inversa-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) per rilevare trascrizionale upregulation di condrogenico differenziazione marcatori

1. Il giorno 14, utilizzare una pipetta per trasferire i pellets sferoidali in una nuova provetta da 1,5 ml e lavarli in PBS 1x.
2. Estrarre l'RNA totale da pellet che utilizzano il guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio metodo di estrazione ^9.
3. Sintetizzare cDNA da 2 mg di RNA totale mediante trascrittasi inversa secondo il protocollo del produttore (incubare a 42 ° C per 1 ora e quindi inattivare l'enzima a 70 ° C per 5 min).
4. Eseguire la PCR con primer specifici per i marcatori di differenziazione condrogeniche ^10.

3. La colorazione per rilevare la sovraespressione di condrogenico differenziazione Marker Proteine

1. pellet cellulari paraffina-embedding
   1. Il giorno 21,utilizzare una pipetta per raccogliere le palline sferoide e lavarli con PBS 1x.
   2. Fissare il pellet sferoidali per immersione in paraformaldeide al 4% per 24 ore.
      Attenzione: Paraformaldeide è altamente tossico. Evitare il contatto con gli occhi, la pelle o le mucose. Ridurre al minimo l'esposizione e evitare l'inalazione durante la preparazione. Indossare dispositivi di protezione adeguati.
   3. Eliminare il fissativo e lavare il pellet di cellule con acqua deionizzata (DW).
   4. Mettere uno strato di garza sulla cassetta e trasferire i pellet fisse con una pipetta. Coprire il pellet piegando la garza e chiudere il coperchio della cassetta.
   5. Disidratare il pellet.
      1. Immergere il pellet in 70% di etanolo (EtOH) per 5 minuti a temperatura ambiente.
      2. Immergere il pellet in 80% EtOH per 5 minuti a RT.
      3. Immergere il pellet in 95% EtOH per 5 minuti a RT.
      4. Immergere i pellets in 100% EtOH per 5 minuti a RT. Ripetere due volte.
      5. Immergere i pellets in 100% xilene per 15 minuti a RT. Ripetere twiCE.
   6. Incorporare i pellet cellulari fissati in paraffina a 56 ° C in uno stampo; il pellet possono essere incorporati in paraffina utilizzando sistemi di lavorazione dei tessuti specializzati automatizzati.
   7. Tagliare 5 sezioni micron di spessore dal pellet cellulare in paraffina utilizzando un microtomo rotativo.
   8. Float sezioni nel 50% EtOH e poi trasferirli in un bagno d'acqua a 50 ° C utilizzando una diapositiva.
   9. Posizionare le sezioni galleggianti su vetrini.
2. Safranina O e Alcian colorazione blu
   1. Reidratare il sezioni di paraffina.
      1. Immergere i vetrini in xilene per 15 min. Ripetere due volte.
      2. Immergere i vetrini in 100% EtOH per 5 min. Ripetere due volte.
      3. Immergere i vetrini in 90% EtOH per 5 min.
      4. Immergere i vetrini in 80% EtOH per 5 min.
      5. Immergere i vetrini in 70% EtOH per 5 minuti, e poi lavare in PBS 1x.
   2. Macchiare le sezioni reidratati con soluzione di safranina O 1% e il 3% blu Alcian per30 minuti.
   3. Eliminare la soluzione colorante e lavare le sezioni con DW.
   4. Macchiare le sezioni con soluzione ematossilina / eosina (di contrasto) per 1 min.
   5. Eliminare la soluzione colorante e lavare le sezioni con DW.
   6. Mettere una goccia di mezzo di montaggio sul vetrino dopo aver rimosso l'acqua residua. posizionare con cura il vetrino (cellule rivolto verso il basso) sul vetrino che contiene il mezzo di montaggio.
   7. Lasciare i vetrini si asciughino per 2-3 ore a temperatura ambiente.
   8. Acquisire immagini utilizzando un microscopio in campo chiaro (microscopio verticale automatizzato, 50X e 200X).
3. test di immunofluorescenza
   1. Reidratare sezioni come descritto nella sezione 3.2.1.
   2. Immergere i vetrini in tampone citrato di sodio (10 mM sodio citrato, 0,05% Tween 20, pH 6,0), e quindi di mantenere ad una temperatura sub-bollente per 10 minuti usando un forno a microonde.
   3. Raffreddare i vetrini per 20 minuti a temperatura ambiente e poi lavarle con acqua del rubinetto.
   4. Incubare i vetrini a 3%H ₂ O ₂ (in 1x PBS) per 15 minuti, e poi lavare con acqua corrente per 15 minuti ^11.
   5. Bloccare i vetrini con tampone di bloccaggio (10% di siero normale di capra in PBS) per 1 ora.
   6. Aspirare la soluzione di saturazione, e quindi applicare un anticorpo primario diluito con 5% di siero normale di capra sulle diapositive.
   7. Incubare i vetrini notte a 4 ° C.
   8. Lavare i vetrini tre volte in 1x PBS per 5 minuti ciascuna.
   9. Incubare i vetrini in anticorpo secondario coniugato a un fluorocromo diluito con 5% di siero normale di capra per 1 ora a temperatura ambiente al buio.
   10. Lavare i vetrini tre volte in PBS 1x per 5 minuti ciascuna al buio.
   11. Incubare i vetrini con DAPI (1 mg / ml) per 10 minuti, e poi lavarli due volte in 1x PBS per 5 minuti ciascuna.
   12. Mettere una goccia di mezzo di montaggio sul vetrino dopo aver rimosso l'acqua residua. posizionare con cura il vetrino (cellule rivolto verso il basso) sul supporto di montaggio.
   13. Lasciare i vetrini si asciughino per 2-3h al buio a temperatura ambiente.
   14. Visualizza le diapositive utilizzando microscopia a fluorescenza (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm; 60X e 200X ingrandimento) ^12.

Risultati

gravità centrifuga induce la sovraespressione di marcatori di differenziazione condrogeniche in cellule staminali derivate da tessuto adiposo.

Per determinare il grado di forza di gravità centrifuga atta ad indurre la differenziazione condrogenico, ASC sono state stimolate con diversi gradi di CG (0, 300, 600, 1200, e 2400 xg) per 15 min. Dopo la stimolazione, le ASC sono stati ri-seminate su piastre di coltura e coltivate p...

Discussione

Lo stato stemness delle cellule è molto importante per la sovraespressione CG-indotta SOX9. Nel nostro studio, espressione SOX9 potrebbe essere indotta da CG ASC precoce passaggio (2-3), ma non in ASC dopo-passaggio. E 'stato riportato che, durante la coltivazione, ASC contengono cellule CD34 + fino a 3 passaggi ^16. ASC tendono a perdere l'espressione di CD34 come le cellule sono diversi passaggi, con conseguente bassa risposta al CG.

Con forza di gravità ce...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
100 mm Dish	TPP	93100
60 mm Dish	TPP	93060
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
ASC Culture Media Materials
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM Low glucose	Life Technologies	11885-084	growth base media
Penicilin Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333	1%
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044	10%
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
Chondrogenic Differentiation Media Materials
DMEM High glucose	Life Technologies	11995	chondrogenic differentiation base media
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Life Technologies	11140-050
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D2915	100 nM
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333	1%
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044	1%
Ascorbate-2-phosphate	Sigma Aldrich	A8960	50 μg/mL
L-proline	Sigma Aldrich	P5607	50 μg/mL
ITS	BD	354352	1%
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	10 ng/mL
Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Tween 20	BIOSESANG	T1027
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-Collagen II antibody	abcam	ab34712	1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate	Molecular Probe	A-11037	1:200
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10x TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1 kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Human adipose-derived stem cells (ASCs)	Catholic MASTER Cells