Ingegneria fattori artificiali per manipolare in modo specifico l'alternanza di splicing nelle cellule umane

Riepilogo

Questa relazione descrive un metodo bioingegneria per progettare e costruire nuovi fattori artificiali splicing (ASF) che specificamente modulano la giunzione di geni bersaglio in cellule di mammifero. Questo metodo può essere ulteriormente ampliata per progettare vari fattori artificiali di manipolare altri aspetti del metabolismo dell'RNA.

Abstract

Il trattamento della maggior parte RNA eucariotici è mediata da RNA Binding Proteins (RBPs) con configurazioni modulari, tra cui un modulo di riconoscimento di RNA, che si lega specificamente al bersaglio pre-mRNA e un dominio effettore. In precedenza, abbiamo preso vantaggio della modalità di legame dell'RNA unica del dominio PUF in pumilio umano 1 per generare un ponteggio programmabile vincolante RNA, che è stato utilizzato per progettare vari RBPs artificiali per manipolare il metabolismo dell'RNA. Qui, un protocollo dettagliato è descritto per costruire fattori di splicing Engineered (ESFS) che sono specificamente progettati per modulare lo splicing alternativo di geni bersaglio. Il protocollo comprende come progettare e costruire un ponteggio PUF personalizzato per uno specifico bersaglio RNA, come costruire un plasmide di espressione FSE fondendo un designer dominio PUF e un dominio effettore, e come utilizzare ESFS per manipolare lo splicing di geni bersaglio. Nei risultati rappresentativi di questo metodo, abbiamo anche descritto i saggi comuniDelle attività di ESF che utilizzano reporter di splicing, l'applicazione di ESF nelle cellule umane colte e l'effetto successivo di cambiamenti di splicing. Seguendo i protocolli dettagliati in questa relazione, è possibile progettare e generare ESF per la regolazione di diversi tipi di Splicing Alternativo (AS), fornendo una nuova strategia per studiare la regolazione di splicing e la funzione di diverse isoforme di splicing. Inoltre, fondendo diversi domini funzionali con un dominio PUF progettato, i ricercatori possono progettare fattori artificiali che mirano a specificare gli RNA per manipolare varie fasi di elaborazione RNA.

Introduzione

La maggior parte dei geni umani subiscono splicing alternativo (AS) per produrre molteplici isoforme con attività distinte, che ha notevolmente aumentato la complessità di codifica del genoma ^{1, 2.} AS fornisce un meccanismo importante per regolare la funzione del gene, ed è strettamente regolata attraverso percorsi diversi in diverse fasi cellulari e dello sviluppo ^{3, 4.} Perché splicing misregulation è una comune causa di malattie umane ^{5, 6, 7, 8,} il targeting regolamentazione splicing sta diventando un percorso terapeutico attraente.

Secondo un modello semplificato di regolazione di splicing, AS è controllata principalmente mediante splicing Regulatory cis -Elementi (SRE) in pre-mRNA che funziona come enhancers splicing o silenziatori di esoni alternativi. thEse SRE specificamente reclutano vari fattori proteici trans- attivi ( cioè fattori di splicing) che promuovono o sopprimono la reazione di splicing ^{3 , 9} . La maggior parte dei fattori di splicing trans- attivi dispongono di domini specifici di sequenza RNA specifici di sequenza per riconoscere i loro obiettivi e domini effettivi per controllare la splicing. Gli esempi più noti sono i membri della famiglia di proteine ​​ricca di serina / arginina (SR) che contengono N-terminali RNA Recognition Motifs (RRMs) che legano gli enzimi di splicing esoni e domini RS-terminali RS che promuovono l'inclusione di esone ¹⁰ . Al contrario, hnRNP A1 si lega ai silenziatori esogeni di splicing attraverso i domini RRM e inibisce l'inclusione di esone attraverso un dominio C-terminale ricco di glicina ¹¹ . Utilizzando tali configurazioni modulari, i ricercatori dovrebbero essere in grado di progettare fattori di splicing artificiali combinando un determinato dominio RNA-binding (RBD) con differenti effecDomini che attivano o inibiscono lo splicing.

La chiave di un tale progetto è quella di utilizzare un RBD che riconosca determinati target con specificità di legame di RNA programmabile, che è analogo al modo di legame del DNA del dominio TALE. Tuttavia, la maggior parte dei fattori naturali di splicing contengono domini RRM o K Homology (KH), che riconoscono elementi di RNA corti con debole affinità e quindi non dispongono di un "codice" di riconoscimento di proteine ​​RNA predittivo ¹² . Il RBD delle proteine ​​di ripetizione PUF ( ovvero il dominio PUF) ha una modalità di riconoscimento RNA unico, consentendo la ridefinizione dei domini PUF per riconoscere in modo specifico diversi target RNA ^{13 , 14} . Il dominio PUF canonico contiene otto ripetizioni di tre α-eliche, ciascuno riconoscendo una singola base in un target RNA a 8 nt. Le catene laterali di amminoacidi in determinate posizioni della seconda elica a forma di legami idrogeno specifici con il bordo di Watson-CrickBase RNA, che determina la specificità di binding di RNA di ogni ripetizione ( Figura 1A ). Il codice per il riconoscimento base di RNA della ripetizione del PUF è sorprendentemente semplice ( Figura 1A ), consentendo la generazione di domini PUF che riconoscono qualsiasi possibile combinazione di 8 basi (riesaminate da Wei e Wang ¹⁵ ).

Questo principio di progettazione modulare consente la generazione di un Fattore di Splicing Engineered (ESF) costituito da un dominio PUF personalizzato e da un dominio di modulazione di splicing ( cioè un dominio SR o un dominio ricco di Gly). Questi ESF possono funzionare come attivatori di splicing o come inibitori per controllare vari tipi di eventi di splicing e si sono dimostrati utili come strumenti per manipolare la splicing di geni endogeni legati alla malattia umana ^{16 , 17} . Ad esempio, abbiamo costruito ESF di tipo PUF-Gly per alterare in modo specifico la splicing del gene Bcl-x, Convertendo la lunga isoforma anti-apoptotica (Bcl-xL) per il pro-apoptotica breve isoforma (Bcl-XS). Spostando il rapporto tra la Bcl-x isoforma era sufficiente per sensibilizzare varie cellule tumorali a più farmaci chemioterapici anti-cancro ^16, suggerendo che questi fattori artificiali possono essere utili come potenziali reagenti terapeutici.

Oltre a controllare splicing con noti domini effettori splicing (ad esempio, un RS o Gly-ricca dominio), i fattori ingegnerizzati PUF possono anche essere utilizzati per esaminare le attività dei nuovi fattori di splicing. Ad esempio, utilizzando questo approccio, abbiamo dimostrato che il dominio C-terminale di diverse proteine SR può attivare o inibire splicing quando associa alle regioni differenti ¹⁸ pre-mRNA, che il motivo ricco-alanina di RBM4 può inibire splicing ^19, e che il motivo ricco di prolina di DAZAP1 può migliorare splicing ^{20, 21 <}/ Sup>. Questi nuovi domini funzionali possono essere usati per costruire altri tipi di fattori artificiali per perfezionare splicing.

Protocollo

1. Costruzione di un impianto PUF con specificità di legame RNA personalizzato mediante sovrapposizione di PCR

1. Progettare una serie di primer di PCR contenenti le sequenze PUF che riconoscono in modo specifico diversi nucleotidi di RNA in ciascuna posizione ¹² (vedere la Tabella 1 per le sequenze di primer e vedere la Figura 1A per il codice di riconoscimento RNA: PUF). Per ogni ripetizione PUF, progettare quattro diversi primer per riconoscere una base diversa in ogni posizione.
   NOTA: Questi primer verranno utilizzati in una serie di quattro round di reazioni PCR per generare frammenti PUF che vengono uniti ( Figura 1 B ).
2. Selezionare il sito di riconoscimento del gene target vicino al sito di splice alternativo.
   NOTA: Questo sito può essere deciso dall'utente e di solito viene scelto entro 10 - 50 nt dai siti di splice alternativi.
3. Round 1: Genera sequenze di codificaPer 4 ripetizioni PUF, frammenti di ponti universali e frammenti di cappuccio.
   1. Utilizzare il sito di destinazione per definire il codice di riconoscimento per ogni ripetizione del PUF personalizzato. Selezionare l'insieme dei primer PCR per le ripetizioni PUF 1 - 8. Eseguire quattro round consecutivi di PCR per produrre un dominio PUF personalizzato, come descritto di seguito ( Figura 1 B ).
   2. Nel primo ciclo di PCR, impostare miscele di reazione PCR standard (contenenti 2,5 μL di tampone 10 volte, 0,5 μL di dNTP da 10 mM, 0,5 μL di 10 μM in avanti e reverse primer, 50 ng del templato DNA (cDNA umano o vettore di espressione Del dominio di WT PUF) e 0,5 U di DNA ad alta fedeltà polimerasi in un volume finale di 25 μL).
      NOTA: Queste reazioni produrranno sequenze di DNA corrispondenti a ogni ripetizione di PUF, a frammenti di ponti universali e a due frammenti di cappuccio con diversi siti di restrizione ( Figura 1 B ). Un breve elenco di modelli, primer, Prodotti di PCR generati e utilizzati in questa fase sono mostrati nella Tabella 2.
   3. Impostare il programma PCR come segue: 5 min a 95 ° C; 28 cicli di 30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C e 15 s a 72 ° C; e 5 min di incubazione a 72 ° C. Utilizzare ad alta fedeltà DNA polimerasi per ridurre al minimo mutazioni puntiformi durante la PCR.
4. Round 2: Generare sequenze codificanti per R1 / R2 / R3 / R4 (R1 - 4) e R5 / R6 / R7 / R8 (R5 - 8).
   1. Separare i prodotti di PCR ottenuti nello stadio 1.3.3 mediante elettroforesi con gel di agarosio 1,5% (25 min ad una tensione costante di 120 V). Gel-purificare tutti i prodotti delle dimensioni previste utilizzando un kit di purificazione gel. Usare una miscela diversa di questi prodotti, come il modello nei seguenti cicli di PCR.
      NOTA: Mescolare i tre prodotti di PCR in circa un rapporto 1: 1: 1. Di solito non hanno bisogno di essere quantificati, fino a quando l'intensità di ogni prodotto simile nel gel.
   2. Miscela circa 5% dei prodotti di PCR purificati come tempiatto nel successivo ciclo di PCR. In alternativa, quantificare i prodotti di PCR purificato usando uno spettrofotometro UV-Vis e utilizzando 15 ng di ciascun prodotto PCR nella miscela modello.
   3. Utilizzare prodotti PCR purificati R1 / R2, R3 / R4, e ponti 2/3 modelli come misti e R1-F e R4-R come inneschi. Impostare la reazione PCR come descritto al punto 1.3 avere sovrapposizione prodotto di PCR R1 - 4.
   4. Utilizzare prodotti PCR purificati R5 / R6, R7 / R8 e Ponte 6-7 come modelli miste e R5-F e R8-R come primer avere sovrapposizione PCR prodotto R5-8 (Figura 1 B). Impostare il programma PCR come segue: 5 min a 95 ° C; 28 cicli di 30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C e 30 s a 72 ° C; e 5 min a 72 ° C. Gel-purificare R1-4 e R5-8.
5. Round 3: Generare sequenze codificanti per R1 / R2 / R3 / R4 / R5 / R6 / R7 / R8 (R1 - 8 senza tappi).
   1. Nel terzo ciclo di PCR, utilizzando il purificato R1-4, R5-8 e Ponte 4/5 modelli come misti e R1-F eR8-R come inneschi, impostare la reazione PCR come descritto al punto 1.3 avere sovrapposizione PCR prodotto R1-8 senza tappi.
   2. Impostare il programma PCR come segue: 5 min a 95 ° C; 28 cicli di 30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C e 55 s a 72 ° C; e 5 min a 72 ° C. Gel-purificare il R1-8 senza tappi.
6. Round 4: Generare sequenze codificanti per i domini PUF complete.
   1. Nell'ultimo ciclo di PCR, utilizzando il purificato R1-8 senza tappi e tappi 5'-end e 3'-end come modelli miste e Cap-F e Cap-R come inneschi, impostare la reazione di PCR come descritto nella fase 1.3 per ottenere i domini finali mutati PUF.
   2. Impostare il programma PCR come segue: 5 min a 95 ° C; 28 cicli di 30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C, e 1 minuto a 72 ° C; e 5 min a 72 ° C.
   3. Gel-purificare i prodotti di PCR dei domini finali PUF riprogrammate. Utilizzare questi prodotti per la costruzione del plasmide di espressione FSE nei passaggi successivi. SequENCE il costrutto finale per verificare le sequenze di domini riprogrammati PUF.
      NOTA: Cap-F codifica NLS (PPKKKRKV) tra BamH I e Xba I siti Cap-R codifica un codone di stop e il sito Sal I (siti di restrizione sono stati progettati per la costruzione di vettori di espressione delle ES, Figura 1 C).

2. Costruzione di un modulo funzionale di ESFS

1. Due strategie sono comunemente usati per clonare moduli funzionali di ESFS (domini RS o domini Gly-ricchi): per amplificare questi domini mediante PCR utilizzando cDNA umana totale come modello (passo 2.2) o per sintetizzare direttamente i frammenti di DNA che codificano per diverse RS o domini Gly-ricchi (passo 2,3).
2. Utilizzare PCR per clonare RS domini da residui 123 - 238 di 9G8 (NP001026854), residui 180-272 di SRP40 (NP008856) o di residui 117 - 221 di SC35 (NP003007). Clonare domini Gly-ricchi da residui 195-320 di hnRNP A1 (NP_002127), residuoS 203 - 353 di hnRNP A2 (NP112533), o residui 211 - 378 di hnRNP A3 (NP919223).
   1. Utilizzare lo strumento di progettazione del primer NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) o Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) per progettare primer per Clonare domini RS o domini ricchi di Gly (modulo funzionale di ESF).
      NOTA: Il primer in avanti contiene un tag FLAG N-terminale dopo il sito Nhe I. Il primer inverso contiene un sito BamH I per la clonazione in vettori di espressione ( Figura 1 C ).
   2. Impostare la reazione standard PCR, come descritto nel punto 1.3, per amplificare i domini ricchi di RS o Gly. Impostare il programma PCR come segue: 5 min a 95 ° C; 28 cicli di 30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C e 30 s a 72 ° C; E 5 min a 72 ° C.
3. Domini di Clone RS o domini ricchi di Gly attraverso la sintesi diretta del DNA. Invece di generare prodotti PCR che codificano per i domini effector nel passaggio 2.2, syntheUn oligonucleotide che codifica un dominio RS a breve frammento (RSRSRSRSRSRS) o un dominio ricco di Gly (GYGGGGPGYGNQGGGYGGG) utilizzando una fonte commerciale di oligonucleotidi di DNA.

3. Costruzione di Plasmidi Espressivi ESF

1. Costruire i plasmidi di espressione ESF utilizzando qualsiasi vettore di espressione.
   NOTA: In origine è stata usata una struttura di espressione pGL-Gly-MS2 (un dono del Dr. R. Breathnach dell'Istituto de Biologie-CHR ¹¹ ) che codifica dal N- al C-terminale, un epitopo FLAG, un Gly -grande dominio di hnRNP A1 e la proteina del cappotto MS2. Di conseguenza, questo esempio di construct viene utilizzato come esempio nel passaggio successivo.
   NOTA: Possono essere utilizzati anche altri vettori di espressione con più siti di clonazione e vengono applicati i passaggi standard di clonazione per unire i frammenti insieme.
2. Digest 1,5 μg dei plasmidi di espressione (pGL-Gly-MS2) menzionati nel punto 3.1 per rimuovere il frammento proteico della cappotta MS2. Utilizza il restrictionEndonucleasi BamH I e Sal I per 1 ora a 37 ° C. Digestare il modulo di riconoscimento di ESF (codificare un NLS e domini PUF riprogrammati, generati nel passaggio 1.5) con BamH I e Sal I nella stessa condizione.
3. Aggiungere un colorante di carica da 5x alle reazioni di digestione di restrizione e lentamente elettroforesi il volume totale con un gel agarosio dell'1,5% contenente una gel di DNA per 40 minuti a 120 V. Gel-purificare i prodotti digeriti.
4. Preparare 10 μL di reazioni di legatura con un modulo di riconoscimento purificato degli inserti ESF e del DNA vettore di espressione in un rapporto 3: 1, 1 μL di ligasi del DNA e 1 μl di tampone di ligation di 10 volte. Incubare le reazioni di legame durante la notte a 4 ° C; Il costrutto risultante esprime un ESF tipo Gly-PUF (pGL-Gly-PUF) sotto il controllo di un promotore CMV ( Figura 1 C ).
5. Rimuovere il frammento che codifica il dominio ricco di FLAG / Gly con digestione Nhe I e BamH I per 1 ora a 37 ° C. Sostituirlo con un frammento che codifica il dominio RS (generato nel passo 2.2, digerito anche da Nhe I e BamH I); il costrutto risultante esprime un RS-PUF-FSE (Figura 1 C).

4. Costruzione del splicing Reporter

1. Sintetizzare oligonucleotidi contenenti sequenze candidate (cioè sequenze bersaglio di domini PUF) affiancato da Xho I e Apa I siti o siti Xho I e EcoR I. Ricuocere gli oligonucleotidi per 5 min a 55 ° C per ottenere inserti doppio filamento contenenti i siti di riconoscimento di domini PUF fiancheggiate dalle estremità coesive di Xho I e Apa I o siti Xho I e EcoR I.
2. Partire da un precedentemente descritto splicing giornalista modulare ^22, pGZ3, che contiene due esoni GFP separati da un esone prova (esone 12 della IGF2BP1 umano, Ensembl ID ENSG00000159217) ei suoi intronetti fiancheggiati.
   NOTA: L'esone di prova è stato progettato con siti Xho I e Apa I, che possono essere usati per inserire oligonucleotidi sintetizzati contenenti le sequenze candidate (sequenze di bersaglio di domini PUF). Questo reporter modulare di splicing (pGZ3) è fornito attraverso il plasmide repository Add-gene.
3. Digestare il reporter base pGZ3 (preparato al punto 4.2) con endonucleasi di restrizione Xho I e Apa I per 1 h a 37 ° C.
4. Gel-purifica i prodotti digeriti come descritto al punto 3.3.
5. Preparare 10 μL di reazioni di legatura con gli inserti a doppio filamento generati al punto 4.1 e il digestato vettore pGZ3 generato al punto 4.4 in un rapporto molare 3: 1, 1 μL di ligasi DNA e 1 μl di tampone di legatura 10 volte. Incubare le reazioni di legame durante la notte a 4 ° C per ottenere il vettore reporter di splicing di costruzione pGZ3.
6. Inserire gli inserti a doppia flangia generati nel passaggio 4.1 nel precedentereporter pubblicati, pez-1B (con Xho I e EcoR I siti) e pez-2F (con Xho I e Apa I siti) ^23, per ottenere la concorrente 5' giornalista ss e la competizione 3' giornalista ss, come descritto ai punti 4.3-4.5.
   NOTA: Entrambi i tipi di giornalisti splicing saranno disponibili tramite Add-gene.

5. Costruzione di vettori di espressione lentivirali per FSE

1. Impostare la reazione PCR standard come descritto al punto 1.3 per amplificare le ESFS integrali dei vettori di espressione originali (PGL-Gly-PUF o PGL-RS-PUF) con primers contenenti siti Mlu I / Spe I. Impostare il programma PCR come segue: 5 min a 95 ° C; 28 cicli di 30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C, e 1,5 min a 72 ° C; e 5 min a 72 ° C.
2. Attraverso una reazione di digestione, purificazione su gel, e la reazione di ligazione, integrare i ESFS nel vettore di espressione lentivirale, pWPXLd, tra l'Mlu I / Spe I siti, come descritto nei passaggi 3.2-3.4.
3. Utilizzare il metodo standard di precipitazione del fosfato di calcio, come riportato in precedenza ²⁴ , per generare lentivirus mediante co-transfezione delle cellule HEK293T mediante imballaggio dei vettori psPAX2 e pMD2.G con pWPXLd-Gly-PUF (Bcl-x), pWPXLd-Gly-PUF Wt) (come controllo di specificità) o pWPXLd-GFP (mock).
   1. Seme 5x10 ⁶ cellule HEK293T in piatti da 10 cm e coltivare le cellule durante la notte in 10 ml di Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) integrato con 10% Fetal Bovine Serum (FBS) per piatto in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% CO ₂ . Eseguire la trasfezione quando le cellule sono confluenti 70 - 90%.
   2. Preparare la miscela plasmidica aggiungendo i tre plasmidi (7,5 μg del vettore di imballaggio, psPAX2, 2,5 μg di pMD2.G e 10 μg di pWPXLd-Gly-PUF (Bcl-x), pWPXLd-Gly-PUF (wt) , O pWPXLd-GFP) in un tubo da 2 mL.
   3. Aggiungere 560 μL di 0,25 M CaCl2 e 560 microlitri di soluzione 2x BBS al tubo 2 mL. Mescolare delicatamente diverse volte e incubare per 15 minuti a RT per preparare la miscela di trasfezione.
   4. Aggiungere tutte le miscele di trasfezione ai piatti 10 cm. Agitare i piatti delicatamente e incubare una notte a 3% di CO ₂ e 37 ° C.
   5. Rimuovere il mezzo, aggiungere 10 ml di DMEM fresco con 2% FBS per ogni piatto, e incubare a 10% di CO ₂ e 37 ° CO / N.
   6. Raccogliere il primo surnatante dai piatti. Aggiungere 10 ml di DMEM fresco con 2% FBS ad ogni piatto. Incubare le stoviglie O / N a 10% di CO ₂ e 37 ° C. Conservare il surnatante a 4 ° C.
   7. Raccogliere il secondo surnatante dai piatti. Piscina La surnatante dai primi e secondi raccolti. Deselezionare il surnatante di detriti cellulari filtrandola attraverso un filtro 0,4 micron. Utilizzare il surnatante eliminato direttamente o conservarlo a -80 ° C.
4. Determinare il titolo del lentivirus infettando HEK2Cellule 93T con diluizioni seriali della preparazione virale, come precedentemente riferito ^25.

6. In particolare modulante Inclusione Exon e l'alternativa L'utilizzo di siti di splicing con ESFS

1. Seed 2 x10 ⁵ cellule HEK293T in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Coltivare le cellule durante la notte in 500 ml di DMEM supplementato con 10% FBS in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% CO _2.
2. Mescolare il reagente di trasfezione liposomiale capovolgendo delicatamente i flaconi prima dell'uso. Diluire 2 ml di reagente di trasfezione liposomiale in 50 microlitri di siero di media ridotta. Mescolare delicatamente e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
3. Diluire 0,04 ug di PGL-Gly-PUF vettori di espressione e 0,2 pg di pGZ3 plasmidi reporter in 50 ml di mezzo ridotta siero in una provetta sterile. Diluire 0,4 pg di PGL-RS-PUF vettori di espressione e 0,2 pg di pGZ3 plasmidi reporter in 50 ml di mezzo di siero ridotta in un tubo sterile. D0,4 μg di vettori di espressione pGL-RS-PUF e 0,2 μg di plasmidi reporter pEZ-1B o pEZ-2F in 50 μl di mezzo serico ridotto in un tubo sterile.
4. Dopo 5 minuti di incubazione a RT, mescolare delicatamente il reagente di transfezione liposomiale diluito preparato nel passaggio 6.2 con i plasmidi diluiti preparati nella fase 6.3. Incubare la miscela per 20 minuti a RT.
5. Aggiungere tutte le miscele di trasfezione contenenti i vettori di espressione e il reagente di trasfezione preparati al punto 6.4 a ciascun pozzetto e incubare per almeno 12 h in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% CO ₂ .
6. Dopo 12 h in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% CO ₂ , scartare il mezzo da ogni pozzetto e lavare con 500 μl di soluzione salina (PBS) tamponata di fosfato.
7. Scartare il PBS e aggiungere a ciascun pozzetto 200 μl di tripsina. Incubare la piastra in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di CO ₂ per 5 min. Aggiungere 1 ml del mezzo per fermare la digestion e trasferire le cellule ad una sterile 1,5 mL provetta.
8. Centrifugare le provette per 3 min a 5.000 xg ed eliminare il mezzo. Aggiungere 0,5 ml di tampone di estrazione dell'RNA per provetta per lisare le cellule pipettando ripetitivo. Incubare i campioni omogeneizzati per 5 min.
9. Per ogni campione tampone trattato estrazione di RNA, aggiungere 0,1 ml di cloroformio in 0,5 ml di tampone di estrazione dell'RNA. Capovolgere le provette per 15 s e incubare per 3 minuti a temperatura ambiente.
10. Centrifugare le provette per 15 min a 12.000 xg e 4 ° C. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta. Aggiungere 0,25 ml di isopropanolo per 0,5 mL di tampone di estrazione dell'RNA utilizzati per l'omogeneizzazione iniziale.
11. Mescolare nel vortex e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Centrifugare le provette a 12,000 xg per 10 min a 4 ° C. Dopo centrifugazione, il precipitato di RNA è solitamente visibile sul fondo della provetta.
12. Scartare il surnatante e lavare il pellet di RNA con 0,5 mL di etanolo al 75% per 0,5 mL di tampone di estrazione dell'RNA.
13. Vortice vigorosamente e centrifugare a 7500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e asciugare il pellet di RNA. Sciogliere l'RNA in 50 ml di acqua RNasi-free.
14. Aggiungere 2 ml di 5U / ml DNasi I, 7 ml di tampone 10x, e 11 ml di H ₂ O per ogni soluzione di 50 microlitri di RNA. Incubare le provette a 37 ° C per 1 h. riscaldarle a 70 ° C per 15 minuti per inattivare il DNasi.
15. Per ciascun campione, aggiungere i seguenti componenti a un 0,2 mL tubo priva di nucleasi: 1 ml di 50 mM oligo dT, 5 ml di 400 ng / ml di RNA (2 mg), 1 ml di 10 mM dNTP, e 3 ml di H ₂ O. Eseguire il contrario PCR.
    1. Riscaldare la miscela a 65 ° C per 5 minuti e incubare su ghiaccio per almeno 2 minuti per impedire la riforma della struttura secondaria. Aggiungere i seguenti componenti allo stesso tubo: 4 ml di tampone 5x primo filamento, 1 ml di 0,1 M DTT, 1 ml di 200 U / mL trascrittasi inversa, e 4 ml di H _{2 <}/ Sub> O. Mescolare pipettando delicatamente su e giù e incubare a 50 ° C per 60 min. Arrestare la reazione riscaldandola a 70 ° C per 15 minuti.
16. Per ogni campione aggiungere i seguenti componenti ad un tubo PCR per completare il PCR con corpo: 2,5 μL di tampone PCR 10 volte, 0,5 μL di 10 mM dNTP mix, 1 μL di 10 μM primer in avanti, 1 μL di 10 μM Primer inverso, 0,25 μl di 5 U / μL Taq DNA polimerasi, 0,5 μL di 25 nM Cy5-dCTP e 2 μL del cDNA preparato nella fase 6.15.
    1. Scaldare la reazione a 94 ° C per 2 min per denaturare le molecole, eseguire 25 cicli di PCR (94 ° C per 30 s, 60 ° C 30 s e 72 ° C 30 s), mantenere la reazione a 72 ° C per 7 minuti, quindi lasciarlo a una presa di 4 ° C.
17. Risolvere i prodotti PCR mediante elettroforesi attraverso un gel di poliacrilamide al 10% con una base di 1x Tris, un acido borico e un tampone EDTA (TBE). Eseguire una scansione utilizzando uno scanner a fluorescenza. Misurare laQuantità di ciascuna isoforma di splicing usando un software di densitometria.

7. Utilizzare ESF per modulare l'espansione endogena Bcl-x e misurare i suoi effetti sull'apoptosi

1. Piastra 2 x 10 ⁵ cellule HeLa ad ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Crescere le cellule durante la notte in 500 μL di DMEM integrato con 10% di FBS in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO ₂ .
2. Dopo 12 h, transfettare le cellule con 2 μg di pGL-Gly-PUF (WT) o 0,2 μg, 1 μg e 2 μg di pGL-Gly-PUF (531) (un dominio PUF riprogrammato che riconosce Bcl- MRNA con elevata affinità, vedi Figura 2 A ).
3. 24 h più tardi, raccogliere le cellule. 1/3 delle cellule sono per l'isolamento RNA e l'analisi PCR (passaggi 6.8-6.17) e 2/3 sono per l'isolamento proteico.
4. Per l'analisi di blot di Western, bollite i pellet di cellule totali in 2X Sodio Dodecil Solfato-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) tampone di carico per 10 min, E quindi risolvere le proteine ​​in un gel SDS-PAGE del 12%. Trasferire le proteine ​​su una membrana di nitrocellulosa.
5. Bloccare la membrana con 5% di latte per 1 h alla RT e incubare la membrana O / N con anticorpi primari Caspase-3 (1: 1,000), PARP (1: 1,000) o beta-actina (1: 5000) 5% latte) a 4 ° C.
6. Lavare la membrana con PBS contenente 0,1% di Tween 20 (PBS-T) per 5 minuti a RT in un agitatore a dondolo. Incubare la membrana con anticorpi legati alla HRP (1: 5.000, diluiti in latte al 5%) per 1 h a RT.
7. Lavare la membrana con PBS-T 3x a RT, quindi sviluppare la membrana usando reagenti ECL Western blotting detection.
8. Aggiungere 250 μL di poli-L-lisina (PLL) sui coperchi, incubarli per 15 minuti a RT e sfiatare il liquido. Lavare le copertine di vetro rivestite con PLL con PBS 3x per 5 minuti ciascuna. Per il dosaggio di immunofluorescenza che misura l'apoptosi, sementi 5 x 10 ⁵ cellule HeLa su copertine di vetro rivestite in poli-lisina in una piastra a 6 pozzetti. Transfetto pGL-Gly-PUF (WT) o PGL-Gly-PUF (531) plasmidi nelle cellule HeLa utilizzando un reagente liposomiale trasfezione (vedi i punti 6.1 - 6.5).
9. 24 ore dopo la trasfezione, le cellule fissare sul coprioggetto con 1 ml di 4% paraformaldeide (PFA) in PBS 1x per 20 minuti a RT. ATTENZIONE: PFA è tossico; maneggiare con cura in una cappa aspirante.
10. lavare delicatamente le cellule sui coprioggetto aggiungendo 2 mL di PBS 1x. incubare per 5 min. Rimuovere il PBS con pipette. Ripetere il lavaggio 3x.
11. Permeabilize le cellule con 0,2% Triton X-100 in PBS 1x per 10 minuti, e poi lavarli 3x con PBS 1x.
12. Bloccare le cellule con 3% albumina di siero bovino (BSA) in PBS 1x per 10 minuti e lavarli 3x con PBS 1x.
13. Diluire l'anticorpo FLAG 1: 1.000 in 3% BSA / PBS e dispensare 30 microlitri di anticorpo FLAG diluito su un foglio parafilm.
14. Estrarre il vetrino con le cellule, asciugare con cura il buffer in eccesso con salviette di laboratorio, e metterlo a testa in giù (cell-side down) sui 30 microlitri anti-FLAG sOlution. Incubare per 1 h a RT.
15. Aggiungere circa 500 μl di 1x PBS al lato della copertura incubata con l'anticorpo primario fino a che la copertura non si piega in cima alla soluzione. Rimetterlo nella piastra a 6 pozzetti con 1x PBS nei pozzetti.
16. Lavare 3x con 1x PBS per 5 minuti ciascuno.
17. Diluire l'anticorpo anti-mouse secondario (1: 500) in 3% BSA / PBS; Ancora, utilizzare 30 μL per ogni copertina. Mettere la copertina rivolta verso l'alto sulla soluzione anticorpale secondaria e incubarla per 15 minuti a RT.
18. Rimuovere la copertura dal parafilm, come descritto nel punto 7.15. Metterlo nella piastra a 6 pozzetti e lavare con 1x PBS 3x per 5 minuti ciascuno.
19. Montare le copertine con supporto di montaggio (con DAPI), rimuovere il mezzo eccessivo e sigillare il bordo con unghie.
20. Visualizzare le celle utilizzando un microscopio a fluorescenza (a 100X ingrandimento) e fotografarli utilizzando una fotocamera digitale.
    NOTA: L'espressione del FSE è visualizzata dalla labels di fluorescenzad anticorpo secondario contro il tag FLAG, e la frammentazione nucleare viene visualizzato per mezzo colorazione DAPI.

8. Misurare l'apoptosi di diverse cellule tumorali che esprimono FSE

1. Raggruppati 2 x 10 ⁶ cellule HeLa, MDA-MB-231 cellule e cellule A549 in piastre da 60 mm, con 4 ml di DMEM supplementato con 10% FBS in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO ₂ per rilevare apoptosi con propidio ioduro (PI) colorazione.
2. 24 ore più tardi, aggiornare la media e preparare il lentivirus, come riportato in precedenza ^24.
3. Diluire (WT), pWPXld-Gly-PUF (531), o pWPXld-GFP scorte-Gly-PUF pWPXld 10 x 10 ⁶ lentivirus in 4 ml di mezzo fresco per rendere il rapporto del virus al numero di celle pari a 5.
4. Cambiare il mezzo nelle piastre a 4 ml del mezzo contenente il virus preparata nella fase 8.3 e incubare le piastre in un incubatore a 37 ° C e 5% CO _2. 12 ore dopo l'infezione, cambiare il mezzo.
5. Dopo 24 ore di infezione, raccogliere e macchiare le cellule per 5 minuti in una soluzione di PBS contenente una concentrazione finale di 2 mg / mL PI.
6. Analizzare le cellule PI-colorate con un citometro a flusso, come descritto in precedenza ^16.

Risultati

Questo rapporto descrive il protocollo completo per la progettazione e la costruzione di ESF e reporter di splicing. Descrive anche l'ulteriore applicazione dei FSE nella manipolazione dell'AS dei geni endogeni ¹⁶ . Per illustrare i risultati tipici delle modifiche di splicing mediate da ESF, utilizziamo i dati del nostro lavoro precedente come esempio. I FSE con differenti domini funzionali possono essere utilizzati per promuovere o inibire l'inclusio...

Discussione

Questo rapporto fornisce una descrizione dettagliata per la progettazione e la costruzione di fattori di splicing artificiali che possono specificatamente manipolare splicing alternativo di un gene bersaglio. Questo metodo sfrutta la modalità di legame dell'RNA unico PUF ripete per produrre un ponteggio RNA-binding con specificità personalizzato. Può essere utilizzato per attivare o reprimere splicing.

Il passaggio critico in questo protocollo è la generazione del dominio PUF reprogr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer	New England Biolabs	M0530L
DNA ligase (T4 DNA ligase)	New England Biolabs	M0202L
Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000)	Invitrogen	11668-019
Reduced serum medium (Opti-MEM)	Gibco	31985-062
RNA extraction buffer (TRIzol Reagent)	ambion	15596018	TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling
PBS (1x)	Life Technologies	10010-031
SuperScript III Reverse Transcriptase (RT)	Invitrogen	18080044
Caspase-3 antibody	Cell Signaling Technology	9668
PARP antibody	Cell Signaling Technology	9542
Bcl-x antibody	BD Bioscience	610211
beta-actin antibody	Sigma-Aldrich	A5441
alpha-tubulin antibody	Sigma-Aldrich	T5168
FLAG antibody	Sigma-Aldrich	F4042
Nitrocellulose membrane	Amersham-Pharmacia	RPN203D
ECL Western Blotting detection reagents	Invitrogen	WP20005
Cy5-dCTP	GE Healthcare	PA55021
Fluorescence-activated Cell Sorter (FACS)	BD Bioscience	FACSCalibur
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	GE Healthcare	SH30243.01
Fetal Bovine Serum (FBS)	Invitrogen	26140079
Propidium iodide (PI)	Sigma	P4170
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A7638-5G
Triton-X100	Promega	H5142
Poly-L-Lysine	Sigma	P-4832	Filter-sterilize and store at 4 °C
Vector pWPXLd	Addgene	12258
Vector pMD2.G	Addgene	12259
Vector psPAX2	Addgene	12260
DNase I (RNase-free)	New England Biolabs	M0303S
Oligo(dT)18 Primer	Thermo Scientific	SO131
Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody)	Cell Signaling Technology	7076S