Generazione di derivate da monociti cellule dendritiche umane da sangue intero

Riepilogo

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Abstract

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity.

The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to naïve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Introduzione

Le cellule dendritiche (DC) sono le più importanti cellule specializzate che presentano l'antigene del nostro sistema immunitario. Immaturo DC (IDC) risiedono nella pelle o nei tessuti delle mucose e sono quindi tra le prime cellule immunitarie per interagire con gli agenti patogeni invasori. DC rappresentano il ponte tra l'innato e il sistema immunitario adattativo ^1, dal momento che possono attivare T e cellule B risposte dopo il rilevamento degli agenti patogeni. Inoltre, contribuiscono a risposte immunitarie pro-infiammatorie causa della secrezione di elevate quantità di citochine, come IL-1β, IL-6 e IL-12. DC attivare anche le cellule NK e attirare altre cellule immunitarie al sito di infezione da parte di chemiotassi.

DC può essere diviso in cellule immature dendritiche (IDC) e cellule dendritiche mature (MDC) ² sulla base della loro morfologia e funzione. Dopo il riconoscimento di antigeni estranei da uno dei molti recettori pattern recognition (ad esempio, recettori toll-like, tipo Clectine, o complemento recettori) abbondantemente espresso sulla superficie delle cellule, iDCs subiscono grandi cambiamenti e cominciano a maturare. Durante questo processo di maturazione, i recettori per la cattura di antigene sono down-regolati, mentre molecole essenziali per la presentazione dell'antigene sono regolate ^up-3. DC mature up-regolazione dei complesso maggiore di istocompatibilità I e II (MHC I e II), molecole co-stimolatorie come CD80 e CD86, che sono essenziali per la presentazione dell'antigene e l'attivazione dei linfociti T. Inoltre, l'espressione del recettore delle chemochine CCR7 sulla superficie cellulare viene indotta, che permette la migrazione delle DC dai tessuti periferici ai linfonodi. La migrazione è facilitata dalla "rolling" di DC lungo un ligando chemochina 19 (CCL19 / MIP-3b) e chemochine ligando 21 (CCL21 / SLC) gradiente ai linfonodi ^4-6.

Dopo la migrazione, MDCS presentano l'antigene processato per naïve cellule CD4 ⁺ e CD8 ^+, quindi initiating una risposta immunitaria adattativa contro l'invasore patogeno ^7. Questa interazione con le cellule T nei linfonodi è anche associato con la diffusione del virus ^8. Altri studi in vitro hanno rivelato che le cellule dendritiche catturare e trasferire l'HIV a cellule T e che questo risultati di trasmissione in una infezione vigorosa ^9-12 in modo efficiente. Questi esperimenti evidenziano che in vivo HIV sfrutta DC come navette dalla periferia ai linfonodi. Durante presentazione dell'antigene, DC secernono interleuchine chiave che determinano la differenziazione delle cellule T helper effettrici, e quindi il risultato della intera risposta immunitaria contro il microbo è determinata in questo interazione. Oltre a tipo 1 (Th1) e tipo 2 cellule (Th2) T effettrici, altri sottoinsiemi di cellule T CD4 ⁺ helper (ad esempio, il tipo 17 (Th17) e di tipo 22 (cellule Th22) T) sono state descritte, e la loro induzione e la funzione sono stati studiati a fondo. DC sono inoltre coinvolti inla generazione di cellule T regolatorie (Tregs) ^13,14. Queste cellule sono immunosoppressiva e possono fermare o down-regolare l'induzione o la proliferazione delle cellule T effettrici e sono quindi di fondamentale importanza per lo sviluppo di immunità e la tolleranza.

DC convenzionali umani (CDC) comprendono diversi sottoinsiemi di cellule con una origine mieloide (vale a dire, Cellule di Langerhans (LCS) e per via cutanea e DC interstiziali) o di origine linfoide (ad esempio, cellule dendritiche plasmacitoidi (pDCs)). Per gli esperimenti in vitro o strategie di vaccinazione DC, DC derivate da monociti sono abitualmente utilizzati come modello per DC dermici. Queste cellule mostrano somiglianze nella fisiologia, la morfologia e la funzione di cellule dendritiche mieloidi convenzionali. Esse sono generate mediante aggiunta di interleuchina 4 (IL-4) e granulociti-macrofagi fattore stimolante le colonie (GM-CSF) di monociti isolati da donatori sani ^12,15-18. Le cellule dendritiche possono anche essere isolati direttamente da cutanee o mucose biopsie, o può anche be sviluppato da cellule progenitrici ematopoietiche isolate da campioni di sangue del cordone ombelicale ottenuti ex utero CD34 ^+. Qui, si dimostra come i monociti sono isolati e stimolati dal sangue umano anti-coagulato dopo cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di arricchimento mediante centrifugazione in gradiente di densità. Dopo incubazione per 5 giorni, monociti umani in condizioni specifiche sono differenziati in iDCs e sono pronti per le procedure sperimentali in un ambiente non clinico.

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Protocollo

Etica dichiarazione: consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti donatori di sangue dall'Istituto Centrale per Blood Transfusion & Dipartimento immunologica, Innsbruck, Austria. L'uso di esemplari rimasti anonimi per scopi scientifici è stato approvato dal Comitato Etico della Medical University di Innsbruck.

1. Arricchimento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC)

1. Concentrazione di PBMC mediante centrifugazione.
   1. Aprire il pacchetto sangue e diviso in provette da centrifuga da 50 ml sterili secondo la quantità di sangue ricevuta.
   2. Se necessario, regolare il volume a 50 ml per ogni tubo con sterile Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (D-PBS).
   3. Porre i tubi in una centrifuga e girare a 400 xg per 15 min a temperatura ambiente (RT) senza freno.
   4. Disegnare lo strato superiore contenente plasma e piastrine con una sterile pipetta 10 ml sierologica, lasciando il boundary strato indisturbato.
      NOTA: Se plasma autologo invece di FCS è utilizzato per integrare il mezzo di coltura, il plasma deve essere raccolto e calore inattivato in questa fase.
   5. Raccogliere le cellule mononucleate (strati limite) da due 50 ml provette da centrifuga e trasferirli in una provetta sterile da 50 ml con una sterile 10 ml pipetta sierologica.
   6. Regolare il volume a 50 ml per ogni tubo con sterile D-PBS.
   7. Porre i tubi in una centrifuga e girare a 400 xg per 15 minuti a RT senza freno.
   8. Aspirare lo strato superiore contenente il plasma e piastrine utilizzando una pipetta sterile 10 ml sierologica, lasciando lo strato limite indisturbati.
   9. Raccogliere le cellule mononucleate (strati limite) dai tubi centrifuga da 50 ml e trasferirli in due provette sterili 50 ml di raccolta utilizzando una sterile 10 ml pipetta sierologica.
   10. Regolare il volume a 50 ml per ogni tubo con sterile D-PBS.
2. Separazionedi PBMC di centrifugazione in gradiente di densità (Figura 1).
   1. Preparare quattro 50 ml tubi e pipetta 15 ml di terreno gradiente di densità in ogni provetta.
   2. Prendere 25 ml di pool cellule / sangue dal tubo di raccolta (fase 1.1.10) e sovrapporre con attenzione il gradiente di densità media.
   3. Porre i tubi in una centrifuga e girare a 700 xg per 30 min a RT senza freno.
3. Raccolta e depurazione delle PBMC.
   1. Aspirare lo strato superiore contenente il plasma e piastrine utilizzando una pipetta sterile 10 ml sierologica, lasciando lo strato PBMC indisturbati.
   2. Raccogliere l'interfase PBMC da tutte le provette e in comune le cellule in due sterili provette da 50 ml con una sterile 25 ml pipetta sierologica.
   3. Regolare il volume a 50 ml per ogni tubo con sterile D-PBS. Porre i tubi in una centrifuga e girare a 400 xg per 15 min a 4 ° C con il freno.
   4. Aspirare il surnatante e risospendere ilcellule in sterili D-PBS. In comune le cellule da entrambi i tubi e regolare il volume a 50 ml con sterile D-PBS.
   5. Collocare le provette nella centrifuga e girare a 400 xg per 10 min a 4 ° C con freno.
   6. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in sterili D-PBS. Regolare il volume a 50 ml con sterile D-PBS e pipetta 50 microlitri di una provetta da 1,5 ml contenente 450 ml di D-PBS.
   7. Vortex la provetta da 1,5 ml vigorosamente e contare le cellule in una camera di Neubauer o qualsiasi altro strumento conteggio delle cellule.
   8. Porre i tubi 50 ml nella centrifuga e girare a 400 xg per 10 min a 4 ° C con freno.

2. Isolamento dei monociti da Anti-CD14 umani Particelle Magnetiche

1. Etichettatura di PBMC con particelle magnetiche.
   1. Regolare la concentrazione PBMC di 8 x 10 ⁷ cellule / ml utilizzando tampone di isolamento.
   2. Vortex le particelle magnetiche CD14 anti-umano thoroughly e aggiungere 50 ml di particelle per ogni 1 x 10 ⁷ PBMC.
   3. Mescolare la sospensione cellulare particella accuratamente ed incubare a temperatura ambiente per 30 min.
2. Separazione delle frazioni positive e negative.
   1. Regolare il volume fino a 12 ml utilizzando tampone di isolamento.
   2. Preparare sei tubi a fondo rotondo sterili e pipetta 2 ml di sospensione cellulare-particelle in ogni provetta.
   3. Porre immediatamente i tubi sul magnete. incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
   4. Mantenere i tubi sul magnete e con attenzione disegnare il sopranatante. Il surnatante contiene la frazione negativa.
   5. Rimuovere il tubo dal magnete e aggiungere 2 ml di tampone di isolamento.
   6. Delicatamente risospendere le cellule pipettando su e giù.
   7. Posizionare i tubi di nuovo sul magnete. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
   8. Mantenere i tubi sul magnete e con attenzione disegnare il sopranatante. Il surnatante contiene la frazione negativa.
   9. Rimuovere le provette dal magnete e aggiungere 2 ml di tampone di isolamento a ciascuna provetta. Delicatamente risospendere le cellule pipettando su e giù.
   10. Trasferire la frazione positiva ad una provetta sterile 50 ml e regolare il volume a 50 ml utilizzando sterile D-PBS.

3. La stimolazione dei monociti isolati con IL-4 e GM-CSF

1. Posizionare il tubo nella centrifuga e centrifugata a 400 xg per 10 min a 4 ° C con freno.
2. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 50 ml di D-PBS.
3. Pipettare 50 ml in una provetta da 1,5 ml contenente 450 ml di D-PBS. Vortex la provetta da 1,5 ml vigorosamente e contare le cellule in una camera di Neubauer o altro strumento conteggio delle cellule.
4. Posizionare il tubo 50 ml nella centrifuga e centrifugata a 400 xg per 10 min a 4 ° C con freno.
   NOTA: Se la frazione negativo, contenente linfociti del sangue periferico (PBL) è necessaria anche,, eseguire il lavaggio e il conteggio dei passi simili a ttubo della frazione positiva (punti 3.1-3.5).
5. Regolare la concentrazione cellulare a 1 x 10 ⁶ / ml con terreno di coltura pre-riscaldato (terreno RPMI 1640 supplementato con 10% soluzione inattivato al calore FBS e 1% L-Glutammina) e pipetta da 3 ml / pozzetto in piastre da 6 pozzetti.
   NOTA: Se si utilizza il plasma autologo inattivato al calore, sostituire il FCS 10% con il 1-5% di plasma autologo, a seconda del set-up sperimentale.
6. Stimolare i monociti con umana ricombinante IL-4 (250 U / ml) e ricombinante GM-CSF umano (1.000 U / ml) pipettando citochine direttamente nel mezzo di coltura. Incubare a 37 ° C e 5% CO _2.
7. Re-stimolare le cellule con IL-4 (250 U / ml) e GM-CSF (1000 U / ml) dopo 48 ore pipettando citochine direttamente nel mezzo di coltura.
   NOTA: Se ci sono segni di acidificazione mostrato dall'indicatore di pH nel mezzo, sostituire la metà della media con terreno di coltura pre-riscaldato.
8. Harvest immaturo cellule dendritiche il giorno 5 perdown-stream esperimenti pipettando le cellule coltivate su piastra da 6 pozzetti e in un tubo da centrifuga da 50 ml dopo pipettando mezzo di coltura su e giù alcune volte.
9. Contare le cellule e macchiare un campione di monociti isolati con anticorpi anti-umani contro CD11b, CD11c, e DC-SIGN / CD209, insieme con un colorante vitalità cellulare. Per evitare legame aspecifico degli anticorpi durante la colorazione della superficie, l'uso di recettore Fc bloccare reagenti o siero bovino albumina buffer (BSA) è altamente raccomandato.
10. Analizzare il campione utilizzando il colorante vitalità cellulare, secondo il protocollo del produttore, eseguendo citometria a flusso per valutare la purezza e la vitalità delle iDCs generati.

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Risultati

Dopo centrifugazione del sangue anti-coagulato con un cuscino di saccarosio, cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono arricchite in interfase sopra del mezzo gradiente di densità (Figura 1). Dopo che i PBMC sono disegnate fuori, analisi FACS viene eseguita per caratterizzare le diverse popolazioni di cellule all'interno delle PBMC utilizzando marcatori lignaggio (ad esempio, CD3 per i linfociti T, CD14 per i monociti, e CD19 per i linfociti B)...

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Discussione

Questo protocollo descrive la generazione di cellule dendritiche derivate da monociti (MDDCs) attraverso l'isolamento di monociti umani da sangue anti-coagulato utilizzando un saggio a base di nanoparticelle magnetiche. In questo protocollo, le fasi di centrifugazione sono eseguite a monte della procedura di isolamento cellulare, che porta ad un arricchimento della frazione PBMC. Sebbene le cellule sono persi durante la centrifugazione, di sovrapporre il contenuto di un pacchetto di sangue intero sul mezzo gradiente...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19	BD Biosciences	555415
APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e	BD Biosciences	551073
BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles	BD Biosciences	557769
BD Imagnet	BD Biosciences	552311
BSA (Albumin Fraction V)	Carl Roth	EG-Nr 2923225
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates	Costar	3506
Density gradient media: Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare Bio-Sciences	17-5442-03
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Falcon 10 ml Serological Pipet	Corning	357551
Falcon 25 ml Serological Pipet	Corning	357525
Falcon 50 ml High Clarity PP Centrifuge Tube	Corning	352070
Falcon Round-Bottom Tubes	Corning	352054
FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a	BD Biosciences	555339
Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent)	Tonbo biosciences	13-0870
GM-CSF	MACS Miltenyi Biotec	130-093-862
Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America)	Gibco	10500-064
Hettich Rotanta 460R	Hettich	---
IL-4 CC	PromoKine	C-61401
Isolation buffer: BD IMag Buffer (10x)	BD Biosciences	552362
L-Glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513
Microcentrifuge tubes, 1.5 ml, SuperSpin	VWR	211-0015
PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2	BD Biosciences	555398
PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46	BD Biosciences	551265
RPMI-1640 medium	Sigma-Aldrich	R0883
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020