Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale<em&gt; In Vitro</em

Riepilogo

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Abstract

Studi di proteine integrali di membrana in vitro sono spesso complicata dalla presenza di un dominio transmembrana idrofobico. A complicare ulteriormente questi studi, reintegrazione delle proteine ​​di membrana detergente-solubilizzato in liposomi è un processo stocastico in cui topologia di proteine ​​è impossibile da far rispettare. Questo articolo offre un metodo alternativo per queste tecniche impegnative che utilizza un ponteggio a base di liposomi. Protein solubilità è esaltata dalla delezione del dominio transmembrana, e questi amminoacidi sono sostituiti con un residuo tethering, ad esempio un His-tag. Questo tether interagisce con un gruppo di ancoraggio (Ni ²⁺ coordinato da acido nitrilotriacetico (NTA (Ni ²⁺⁾⁾ per His-tag proteine), che impone una topologia proteine uniforme sulla superficie del liposoma. Un esempio è presentato in cui l'interazione tra proteine ​​Dynamin legati 1 (DRP1) con una proteina integrale di membrana, mitocondriale fissione Factor (QFP), era investigated utilizzando questo metodo impalcatura liposomi. In questo lavoro, abbiamo dimostrato la capacità di QFP di reclutare in modo efficiente DRP1 solubile alla superficie dei liposomi, che ha stimolato la sua attività GTPasi. Inoltre, DRP1 era in grado di tubulate il modello di lipidi MFF-decorato in presenza di lipidi specifici. Questo esempio dimostra l'efficacia di liposomi impalcature utilizzando saggi strutturali e funzionali e mette in evidenza il ruolo del QFP nella regolazione dell'attività DRP1.

Introduzione

Studiare le interazioni proteina-proteina di membrana-prossimale è uno sforzo impegnativo a causa della difficoltà di ricapitolare l'ambiente nativo delle proteine integrali di membrana coinvolte ^1. Ciò è dovuto alla necessità di detersivo solubilizzazione e l'orientamento incoerente delle proteine ​​in proteoliposomi. Per evitare questi problemi, abbiamo utilizzato una strategia quale i domini solubili di proteine integrali di membrana sono espressi come proteine di fusione His-tag, e questi frammenti solubili sono ancorati liposomi ponteggio tramite interazioni con NTA (Ni ²⁺⁾ headgroups al lipide superficie. L'utilizzo di questi ponteggi, interazioni proteina-lipidi prossimale possono essere indagati in un intervallo di lipidi e proteine ​​composizioni.

Abbiamo effettivamente applicato questo metodo per studiare le interazioni critiche proteina-proteina che regolano il montaggio del complesso fissione mitocondriale ed esaminare le interazioni lipidi che modulano questo process ^2. Durante la fissione mitocondriale, una conservata proteina rimodellamento della membrana, chiamata Dynamin-related protein 1 (DRP1) ^3, viene reclutato per la superficie del mitocondriale esterna della membrana (OMM) in risposta a segnali cellulari che regolano l'omeostasi energetica, segnale apoptotico, e molti altri processi mitocondriali integrali. Questo grande, GTPase citosolica viene reclutato alla superficie dei mitocondri attraverso le interazioni con proteine OMM integrali ^{4 - 8.} Il ruolo di una tale proteina, mitocondriale fissione Factor (QFP), è stato difficile chiarire causa di una debole interazione evidente con DRP1 in vitro. Tuttavia, studi genetici hanno chiaramente dimostrato che QFP è essenziale per il successo ^7,8 fissione mitocondriale. Il metodo descritto in questo manoscritto è stato in grado di superare le carenze precedenti introducendo le interazioni lipidi simultanee che promuovono le interazioni DRP1-QFP. Nel complesso, questo nuovo metodo di analisi REVEAportato interazioni fondamentali che guidano il montaggio del complesso fissione mitocondriale e ha fornito una nuova fase per gli studi strutturali e funzionali in corso di questa macchina molecolare essenziale.

Fino ad oggi, l'esame delle interazioni tra DRP1 e QFP sono state complicate dalla flessibilità intrinseca del QFP ^9, l'eterogeneità dei polimeri DRP1 ^2,10, e la difficoltà di purificazione e di ricostituzione full-length QFP con un dominio transmembrana intatto ^11. Abbiamo affrontato queste sfide utilizzando liposomi NTA (Ni ²⁺⁾ ponteggio per ricostituire His-tag QFP manca il suo dominio transmembrana (MffΔTM-His _6). Questa strategia è stata vantaggioso perché MffΔTM era estremamente solubile quando sovra-espresso in E. coli, e questa proteina isolata è stato facilmente ricostituiti in liposomi patibolo. Quando legato a questi modelli di lipidi, MFF ha assunto un identico, rivolto verso l'esterno orientamento sulla superficie della membrana.Oltre a questi vantaggi, lipidi mitocondriali, come cardiolipina, sono stati aggiunti per stabilizzare QFP piegatura e di associazione con la membrana ^11. Cardiolipin interagisce anche con il dominio variabile della DRP1 ^2,12 che può stabilizzare questa regione disordinato e facilitare il montaggio della macchina fissione.

Questo metodo robusto è ampiamente applicabile per gli studi futuri che cercano di valutare le interazioni delle proteine ​​di membrana-prossimale. Attraverso l'uso di ulteriori interazioni tethering / affinità, la sofisticazione di questi studi ricostituzione membrana può essere migliorato per imitare ulteriori complessità trovato alla superficie delle membrane all'interno delle cellule. Allo stesso tempo, composizioni lipidiche possono essere modificati per imitare più accuratamente gli ambienti nativi di questi complessi macromolecolari. In sintesi, questo metodo fornisce un mezzo per esaminare i relativi contributi di proteine ​​e lipidi nel plasmare morfologie membrana a durante proc cellulare criticaesses.

Protocollo

1. Ponteggio liposomi Preparazione

NOTA: Idealmente, esperimenti iniziali dovrebbe usare un'impalcatura relativamente semplice e informe (composto da DOPC (1,2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine o PC) e DGS-NTA (Ni ²⁺⁾ (1,2-dioleoyl - sn -glycero-3 - [(N - (5-ammino-1-carbossipentil) acido imminodiacetico) succinil]. (nickel sale)) Edificio fuori di questi esperimenti, carica lipidi, flessibilità e curvatura può essere introdotto come singoli fattori con il potenziale per alterare le interazioni membrana-prossimale. Queste modifiche possono essere realizzati aggiungendo quantità definite di specifici componenti lipidici, inclusi fosfatidilserina o cardiolipina (CL), fosfatidiletanolammina (DOPE o PE), o galactosyl ceramide (β).

1. Combinare lipidi disciolti in cloroformio in una provetta di vetro pulito. Evaporare il solvente con azoto secco, mentre la rotazione del tubo per formare un sottile film lipidico. Rimuovere solvente residuo con una centrifugal evaporatore per 1 ora a 37 ° C.
   NOTA: Varie formulazioni di liposomi vengono utilizzati nei protocolli di seguito descritto: liposomi ponteggi (3,3 mol% DGS-NTA (Ni ²⁺⁾ / 96,7 mol% DOPC), liposomi ponteggi con cardiolipina (3,3 mol% DGS-NTA (Ni ²⁺⁾ / 10 mol% cardiolipina / 86,7 mol% DOPC), liposomi ponteggio flessibili con cardiolipina (3.3 mol% DGS-NTA (Ni ²⁺⁾ / 10% mol cardiolipina / 35 mol% DOPE / 51,7 mol% DOPC), e impalcatura arricchito liposomi (10 mol% DGS-NTA (Ni ²⁺⁾ / 15% mol cardiolipina / 35 mol% DOPE / 40 mol% DOPC).
2. Aggiungere tampone A (25 mM HEPES (4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic), 150 mM KCl, pH regolato a 7,5 con KOH) preriscaldato a 37 ° C in modo che la concentrazione di lipidi finale 1 - 2 mM. Incubare 30 minuti a 37 ° C con vortex occasionale per risospendere completamente la miscela lipidica (Figura 1a).
3. Trasferire in una provetta di plastica, porre il tubo in azoto liquido fino a completo congelamento (roughly 30 s), e posto in un bagno d'acqua C 37 ° fino a quando completamente scongelati (circa 1 - 2 min). Ripetere per un totale di 4 cicli di gelo-disgelo (Figura 1B).
4. Preparare un estrusore lipidico immergendo 4 supporti del filtro e un filtro di policarbonato in tampone e assemblare l'estrusore secondo le istruzioni del produttore. Estrudere la soluzione lipidica attraverso il filtro 21 volte. Utilizzare dolce, pressione costante per garantire una distribuzione di dimensione omogenea (Figura 1c).
   NOTA: Per tutti gli esperimenti descritti in questo protocollo, un filtro 1,0 micron in policarbonato è stato utilizzato per l'estrusione. Interazione DRP1 con lipidi anionici può essere osservata con una varietà di diametri di liposomi che variano da 50 nm a 400 nm ¹² o superiore ^13. Quindi, la dimensione del filtro di 1 micron è stato scelto per essere ideale sia GTPasi attività e per la microscopia elettronica. Se altri diametri di liposomi sono desiderati, preparazione dei giganti vescicole unilamellari ^14,15 (GUVs) o piccolo unilamellar vescicole ¹⁶ (SUV) può essere utilizzato. Diffusione della luce dinamica può essere utilizzato per valutare l'eterogeneità liposomi dimensioni ^13.
5. Conservare liposomi estrusi a 4 ° C e scartare dopo 3-5 d.

2. L'utilizzo di ponteggi liposomi per la Proteina Analisi Binding

1. Preparazione del campione
   1. Incubare His-tag MffΔTM (5 micron finale) con liposomi ponteggi (40 mol% PC / 35 mol% PE / 15 mol% CL / 10 mol% DGS-NTA (Ni ^2+); 50 um finale) per almeno 15 min a RT in tampone a + BME (25 mM HEPES, 150 mM KCl, 10 mM β-mercaptoetanolo (BME), pH regolato a 7,5 con KOH). Per un controllo QFP-libera, incubare liposomi con il suo tag-proteina di controllo (come la GFP) per legare e scudo esposto NTA (Ni ^2+).
      NOTA: MffΔTM è stato espresso e purificato come descritto in un precedente studio ^2. GFP è stato purificato in modo analogo, ma il passo di scambio ionico è stato omesso. BME è stato richiesto per questi experiments perché DRP1 è sensibile all'ossidazione, che possono modificare le sue proprietà di attività e di assemblaggio.
   2. Aggiungere DRP1 (2 mM finale) e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
      NOTA: DRP1 è stato espresso e purificato come descritto in un precedente studio ^2. Dopo incubazione con DRP1, l'effetto vincolante per deformazione della membrana nucleotide può essere studiata incubando un'altra ora con 2 mM MgCl ₂ e sia 1 mM GTP, 1 mM GMP-PCP, o tampone A + BME.
2. Negativo Stain microscopia elettronica a trasmissione (EM) Analisi
   1. Transfer 5 microlitri di campione ad un foglio di pellicola di laboratorio, e stabilire una griglia Cu / Rh carbonio rivestito sul campione. Incubare la griglia 1 min sul campione, cancellare via il liquido in eccesso su carta da filtro, e trasferire ad un calo del 2% acetato di uranile. Incubare 1 min, tamponare l'eccesso macchia sulla carta da filtro, e trasferire a una casella della griglia. Conservare sotto vuoto O / N per garantire la piena essiccazione.
   2. campioni di immagine utilizzando un microsc elettronico a trasmissioneope a 18.500 - 30,000X ingrandimento per osservare i cambiamenti ultrastrutturali di proteine e di liposomi morfologie ^17.
      Nota: le modifiche ultrastrutturali possono essere quantificati utilizzando immagine software di analisi, come ad esempio ImageJ ¹³ (http://imagej.nih.gov/ij/). decorazione di proteine ​​può essere misurata se confrontato con i modelli di lipidi nudi. Inoltre, i diametri dei segmenti tubolari possono essere misurati dalla porzione più esterna dei complessi ^13. Un'analisi più dettagliata può essere effettuata utilizzando crio-microscopia elettronica ^17. Questo metodo può essere usato per immagini complessi proteina-lipidi nativi in ​​solvente senza l'uso di coloranti metalli pesanti che rivestono il campione. In questo modo, le caratteristiche strutturali dettagliate non apparenti macchia negativo, inclusi i cambiamenti nella morfologia dei lipidi di fondo, possono essere esaminate e quantificati.

3. L'uso del ponteggio liposomi per enzimatica Assay

Nota: A colorisaggio GTPase metrica ¹⁸ è stato utilizzato per misurare la liberazione di fosfato tramite GTP idrolisi. Saggi GTPasi alternativi sono disponibili ¹⁹ e possono essere implementati in base alle esigenze.

1. Incubare His-tag MffΔTM (QFP), Fis1ΔTM (Fis1), o GFP (5 micron finale per tutti) con liposomi ponteggio (150 micron finali) per 15 minuti a temperatura ambiente in tampone A + BME (volume = 30 ml). Aggiungere DRP1 (500 nM finale) e incubare un ulteriore 15 minuti a temperatura ambiente (volume = 80 ml).
   NOTA: Fis1 è stato purificato in modo analogo a MFF ^2, ma la fase di cromatografia a scambio ionico è stato omesso. Lo scopo della sua tag-GFP è quello di proteggere il NTA (Ni ²⁺⁾ headgroups e prevenire le interazioni di carica non specifiche con altre proteine. Se nessun effetto si osserva in assenza di GFP, allora questo controllo può non essere necessaria. Alternativi proteine ​​bloccaggio (di dimensioni paragonabili alla proteina di interesse) possono essere usati pure, ma GFP permette la visualizzazione diretta delle interazioni con scafpiegare liposomi.
2. Tubi Trasferire un termociclatore impostato a 37 ° C, e avviare le reazioni di aggiunta di GTP e MgCl ₂ (1 mM e 2 mM finale, rispettivamente; volume = 120 ml).
3. A intervalli di tempo desiderati (cioè T = 5, 10, 20, 40, 60 min), trasferire 20 microlitri di reazione nei pozzetti della micropiastra contenente 5 ml di 0,5 M EDTA per chelare Mg ²⁺ e fermare la reazione.
4. Preparare una serie di standard di fosfato diluendo KH ₂ PO ₄ in tampone A + BME per calibrare i risultati. Un utile set di standard è 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5 e 0 pM. Aggiungere 20 ml di ciascuno per pozzetti contenenti 5 ml di 0,5 M EDTA.
5. Aggiungere 150 ml di malachite verde reagente (1 mm di malachite verde carbinolo, 10 mM ammonio molibdato tetraidrato, e 1 N HCl) in ogni pozzetto, e leggere OD ₆₅₀ 5 min dopo l'aggiunta.
   NOTA: GTP è acido labile e si idrolizzano in presenza di reagente verde malachite. Assicurarsi che tha il tempo tra l'aggiunta del reagente di malachite e la lettura è costante per garantire la riproducibilità dei risultati.
6. Generare una curva standard tracciando OD ₆₅₀ degli standard in funzione della concentrazione di fosfato. Utilizzare la regressione lineare per determinare la relazione tra OD ₆₅₀ e la concentrazione di fosfato in un campione.
7. Utilizzando la regressione lineare, convertire la OD ₆₅₀ dei campioni di reazione proteina mM fosfato. Determinare la velocità di generazione di fosfato per ciascuna miscela di reazione riportando concentrazione di fosfato in funzione del tempo, e convertire k _cat dividendo il tasso dalla concentrazione DRP1 (0,5 mM).
   NOTA: Solo la velocità lineare iniziale dovrebbe essere usato per determinare la velocità di generazione di fosfato, e un minimo di 3 punti di dati deve essere utilizzato. Se la velocità di reazione è sufficientemente rapida che i primi tre punti di dati non sono lineari (cioè la r ² del fit lineare è inferiore a 0,9) di un segnoNaturalmente tempo ificantly breve con almeno 3 punti di tempo deve essere eseguita.

Risultati

Mentre l'interazione tra DRP1 e QFP ha dimostrato di essere importante per fissione mitocondriale, questa interazione è stato difficile ricapitolare in vitro. Il nostro obiettivo era quello di emulare meglio l'ambiente cellulare in cui DRP1 e del QFP interagiscono. A tal fine, liposomi contenenti concentrazioni limitanti del NTA (Ni ²⁺⁾ headgroups sono stati preparati mediante reidratazione un film lipidico come descritto sopra. La soluzione lipidica inizialm...

Discussione

Questo protocollo offre un metodo per studiare le interazioni proteina-proteina che coinvolgono proteine ​​integrali di membrana. Utilizzando un ponteggio liposoma modulare, investigatori sono in grado di valutare l'attività di una o più proteine ​​in un ambiente lipidico-prossimale. Studi precedenti hanno dimostrato un metodo simile per gli enzimi del recettore della membrana plasmatica ^{24 - 26.} Abbiamo ampliato questo metodo per incorporare cofattori lipidici ed esplorare...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphatidylcholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids	850375
Phosphatidylethanolamine (DOPE)	Avanti Polar Lipids	850725
DGS-NTA(Ni2+)	Avanti Polar Lipids	790404
Bovine Heart Cardiolipin (CL)	Avanti Polar Lipids	840012
Chloroform	Acros Organics	268320010
Liposome Extruder	Avanti Polar Lipids	610023
Cu/Rh Negative Stain Grids	Ted Pella	79712
Microfuge Tube	Beckman	357448
GTP	Jena Biosciences	NU-1012
GMP-PCP	Sigma Aldrich	M3509
Microtiter Plate strips	Thermo Scientific	469949
EDTA	Acros Organics	40993-0010
Instant Blue Coomassie Dye	Expedeon	ISB1L
HEPES	Fisher Scientific	BP310
BME	Sigma Aldrich	M6250
KCl	Fisher Scientific	P330
KOH	Fisher Scientific	P250
Magnesium Chloride	Acros Organics	223211000
4 - 20% SDS-PAGE Gel	Bio Rad	456-1096
4x Laemmli Loading Dye	Bio Rad	161-0747
HCL	Fisher Scientific	A144S
Malachite Green Carbinol	Sigma Aldrich	229105
Ammonium Molybdate Tetrahydrate	Sigma Aldrich	A7302
Laboratory Film	Parafilm	PM-996
Uranyl Acetate	Polysciences	21447
Tecnai T12 100 keV Microscope	FEI
Optima MAX	Beckman
TLA-55 Rotor	Beckman
Refrigerated CentriVap Concentrator	Labconico
Mastercycler Pro Thermocycler	Eppendorf
VersaMax Microplate reader	Molecular Devices