Studiare mitocondriale Struttura e funzione in<em&gt; Drosophila</em&gt; ovaie

Riepilogo

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

Abstract

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Introduzione

I mitocondri sono classicamente descritti come la centrale elettrica cellulare, dal momento che sono le principali sedi di produzione di energia nelle cellule differenziate. Inoltre, i mitocondri hanno un ruolo fondamentale nel metabolismo, la generazione di calore, la modifica dei lipidi, calcio e redox omeostasi, l'orchestrazione dei processi di segnalazione cellulare, ecc ^1. I mitocondri anche svolgere un ruolo attivo nella induzione della morte cellulare ^2, nonché nella regolazione del ciclo cellulare ^3. Tale multifunzionalità pone le seguenti domande fondamentali: a) come fanno i mitocondri svolgono tutte queste funzioni contemporaneamente e b) ci sono piscine mitocondriali specifici o sottozone che sono specializzati per funzioni distinte? In questo contesto, è importante notare che i mitocondri multifunzionali sono dinamici nella forma, dimensioni, e la struttura all'interno delle singole cellule e che la forma a regime di mitocondri possono variare tra i tipi di cellule. Decenni di ricerca provenienti da varie laboratoriooratori suggeriscono che l'alterazione della forma mitocondriale, le dimensioni e la struttura, chiamati collettivamente dinamiche mitocondriali, è fondamentale per mantenere le varie funzioni mitocondriali _^4,5,6. Questi risultati sollevano la possibilità che i mitocondri possano compiere la loro multifunzionalità in virtù della loro dinamismo strutturale.

Ampi sforzi sono in corso per capire il rapporto struttura-funzione mitocondriale. La dinamicità della struttura mitocondriale viene mantenuta principalmente dalla loro capacità di subire eventi di fissione e fusione con l'altro. Fissione di grandi mitocondri li converte in elementi mitocondriali più piccoli, mentre la fusione tra due mitocondri piccoli li fonde in un elemento mitocondriale grande ^7. Inoltre, può verificarsi la fusione transitorio di due mitocondri per consentire la miscelazione del loro contenuto. La fissione e fusione eventi delle membrane mitocondriali interne ed esterne sono attentamente regolate da specificheific imposta di proteine. Il macchinario nucleo fissione è composto dynamin-related protein 1 (DRP1), che viene assunto dal citosol ai mitocondri dalla sua interazione con certa bona proteine mitocondriali fide (ad esempio, Fis1 o Mff1), mentre la funzione DRP1 può anche essere regolata altre proteine sulla superficie mitocondriale ^4. Anche se DRP1 opera sulla membrana esterna, la sua capacità di fissione impatto la membrana interna pure. L'orchestrazione della fissione delle membrane mitocondriali esterne ed interne non è ben compreso. D'altra parte, la fusione della membrana interna è regolata al centro dalle attività di OPA1, mentre mitofusins regolano la fusione della membrana esterna ^5. Il saldo dei fissione e fusione di contrasto eventi di mitocondri dettare la forma mitocondriale stato stazionario in una cella. Ad esempio, la repressione di fissione mitocondriale comporterebbe fusione completa e senza opposizione, mentre l'eccessiva attività dei mitocondril fissione comporterebbe la frammentazione dei mitocondri ^3.

Lo studio della relazione struttura-funzione mitocondriale coinvolge principalmente due approcci complementari: a) analisi dei fenotipi cellulari e organismal dopo la manipolazione genetica delle proteine ​​fissione / fusione mitocondriali e b) le valutazioni diretti di struttura e funzione mitocondriale. È interessante notare che le analisi genetiche non sempre rivelare la funzionalità diretta della molecola in questione (in questo caso, mitocondriale proteine ​​fissione / fusione), come i fenotipi possono sorgere a causa di effetti secondari. Pertanto, è di fondamentale importanza per sviluppare e utilizzare strumenti per studiare la struttura e la funzione mitocondriale direttamente. Qualsiasi valutazione della struttura dei mitocondri coinvolge vari strumenti di microscopia. L'uso della microscopia a fluorescenza delle cellule vive è notevolmente avanzato gli studi di dinamiche mitocondriali, dal momento che il dinamismo mitocondriale può essere controllato sia qualitativamente che Quantitätvamente utilizzando gli strumenti e le tecniche di microscopia a fluorescenza ⁸ appropriate. Strumenti microscopia a base di fluorescenza sono stati sviluppati per studiare la struttura e la funzione mitocondriale in tessuti Drosophila melanogaster vivi e fisse, chiarire il significato di dinamismo mitocondriale in vivo ^9. Questi e metodi relativi sono descritti qui, con l'obiettivo di studiare la struttura e la funzione mitocondriale nelle ovaie Drosophila.

L'ovaio Drosophila è composto da germinali e somatiche lignaggi, che derivano dalle rispettive cellule staminali adulte che si trovano nel germarium ^10,11. Sedici cellule germinali sinciziale (GCS) vengono incapsulati dalle cellule follicolari somatiche (FC) per formare singole camere d'uovo che emergono dalla germarium (Figura 1). Uno dei 16 CV ottenere impegna a diventare un ovocita, e il restante 15 CV svilupparsi in cellule infermiere che supportano la crescita della camera di ovociti, Facilitando la maturazione dell'uovo prima che venga deposto. La maggior parte degli FC subiscono 9 turni di divisioni mitotiche, prima di uscire dal ciclo cellulare mitotico a differenziarsi terminale in uno strato di cellule epiteliali modellato costituito da cellule anteriore follicolo (AFCS), cellule posteriore follicolo (PFC), e principali cellule del corpo (MBC) . Le camere di uova consecutivi sono collegati da cellule gambo, che si differenziano le cellule che sono anche derivati ​​da FC nelle prime fasi di sviluppo. Forma mitocondriale regolato dalla proteina DRP1 fissione mitocondriale è attivamente coinvolto nel processo di differenziazione durante il normale sviluppo del ovarico strato di FC Drosophila ^9,12. I metodi utilizzati in questi studi per identificare il coinvolgimento di DRP1 in Drosophila sviluppo strato di cellule del follicolo sono descritte qui.

Protocollo

1. Preparazione di Drosophila (gli strumenti necessari sono descritte nella Figura 2A)

1. Per qualsiasi degli esperimenti descritti, raccogliere Drosophila (mantenuta a temperatura ambiente, o 25 ° C) entro 5 giorni di eclosion e metterli in una fiala riempita di 5-7 ml di Drosophila cibo (vedi Materiali Tavolo), con non più di 25 mosche in ogni fiala; mantenere un rapporto femmine: maschi di 2: 1.
2. Cospargere una piccola quantità di lievito granulato per stimolare la produzione di uova di Drosophila. Eseguire manipolazione sperimentale entro 2 - 4 giorni.

2. La dissezione di Drosophila ovaie (gli strumenti necessari sono descritte nella Figura 2A)

1. Warm insetto dissezione di media (vedi Materiali tabella) a temperatura ambiente, 25 ° C. Riempire tre pozzi di un bambino di otto-ben piatto di vetro dissezione, con 200 ml di mezzo in ogni bene.
2. Anestetizzare Drosophila con CO _{2 inserendo l'ago della pistola soffiaggio sotto il tappo flacone. Disporli su un pad volo. Utilizzando un microscopio da dissezione, risolvere 5 femmine e metterli nel primo pozzo del piatto dissezione. Maneggiare un Drosophila in un momento in cui l'esecuzione di microscopia in tensione.}
3. Mentre guardando attraverso l'oculare del microscopio dissezione, separare il torace dall'addome con due coppie di pinze. Utilizzando le pinze, trasferire accuratamente l'addome al secondo pozzo del piatto.
4. Utilizzare una coppia di pinze per tenere l'addome alla fine posteriore, e lentamente spingere le ovaie out (insieme agli altri contenuti addominali) con l'altra coppia di pinze. Se questo tentativo non riuscire, rimuovere con attenzione l'esoscheletro addominale inserendo la pinza nella estremità anteriore per rilasciare le ovaie.
5. Utilizzando le pinze, tenere un ovaio individuo dalla fine posteriore opaca (vale a dire, le uova tuorlo-riempita, in fase avanzata) e spostarlo attentamente il terzo pozzo del piattoper giro ad elaborarlo per microscopia diretta (step 3) o per il fissaggio di eseguire immunostaining (passaggio 7).
6. prendere in giro con cautela la guaina protettiva intorno alle ovaie da spazzare un ago presa in giro con leggerezza dal posteriore alla estremità anteriore di ciascun ovaio, mentre tenendolo per l'estremità posteriore con un paio di pinze.
   NOTA: per ridurre al minimo i danni durante il prendere in giro, piegare la punta dell'ago e zoomare su ciascun ovaio, aumentando l'ingrandimento del microscopio (Figura 2A). Teasing dovrebbe essere sufficiente a rompere la guaina efficace, ma deve anche essere fatto con attenzione per preservare l'integrità dei ovarioli.

3. Preparazione per microscopia Live-tessuto

NOTA: Gli strumenti necessari sono descritte nella Figura 2A.

1. Prima di Drosophila dissezione, preparare polyl-Lisina camere rivestite. A tal fine, posizionare due gocce 20 microlitri di polyl-lisina (0,1 mg / mL) sul coverglass (14 mm, No. 0) di una piastra di Petri con fondo (35 mm) ad una ragionevole distanza l'uno dall'altro per evitare la fusione delle gocce. Far asciugare le piastre per 1 ora a 37 ° C e segnare i bordi della pellicola bianca polyl-lisina sul lato inferiore della piastra con un pennarello cancellabile.
   NOTA: Il polyl-lisina rivestite camere possono essere conservati a 4 ° C per una settimana. Se si utilizza una camera precedentemente rivestito, portarlo a temperatura ambiente prima di iniziare la dissezione Drosophila.
2. Impostare i parametri di scansione sul microscopio confocale per assicurarsi che il campione può essere ripreso immediatamente dopo il completamento della dissezione e di montaggio, come sotto.
3. Mettere una dissezionato e preso in giro dell'ovaio (dopo la fase 2 e macchiato, se necessario, seguendo passo 5) su una regione di polyl-lisina rivestite marcata e diffondere l'ovaio con l'ago presa in giro per separare i ovarioli. Mettere una goccia 10 ml di mezzo di dissezione insetto sulla parte superiore delle ovaie, avendo cura di coprire tha un'area complessiva di polyl-lisina-rivestito. Coprire la capsula di Petri.
4. Subito effettuare microscopia confocale del campione montato a temperatura ambiente.
   NOTA: Solo un Drosophila dovrebbe essere sezionato, trasformato, e ripreso in un momento. Inoltre, la microscopia non deve essere eseguita a 37 ° C, che simulare un ambiente shock termico per il tessuto Drosophila.

4. Perdita Fluorescence In Photobleaching (FLIP) Assay per valutare mitocondriale Matrix Continuità

NOTA: mitocondriale continuità matrice in una struttura mitocondriale fusa viene stabilita dopo la fusione completa delle membrane interna ed esterna mitocondriale seguenti una progressione attraverso i passaggi intermedi. Fissione dei mitocondri può seguire la stessa procedura, ma in senso inverso (Figura 3A). FLIP è un metodo semi-quantitativa microscopia a base time-lapse che può essere utilizzato per valutare la continuità mitocondriale matrice neldef stato fuso di ex vivo mitocondri (punti 3 e 4 nella figura 3A) in vivo ovaie Drosophila ^9. Il dosaggio FLIP viene eseguita come una piccola regione di interesse (ROI) dei mitocondri esprimono una molecola fluorescente nella matrice mitocondriale che viene fotodecolorate a intervalli regolari (FLIP ROI in Figura 3A). Come risultato, ogni regione circostante mitocondriale che è continua con la ROI FLIP (ROI sperimentale nella Figura 3A) perderà segnale dovuto allo scambio di molecole nella matrice mitocondriale continuo. Gli esperimenti FLIP dimostrato qui vengono eseguite su transgenici Drosophila esprimere mitoYFP, che contiene la sequenza di targeting mitocondriale del citocromo ossidasi subunità VIII umano contrassegnate con YFP di indirizzare alla matrice mitocondriale in una forma liberamente diffusibile. Un esperimento simile può anche essere eseguita con il transgene mito pUASP-mito-GFP, come riportato in precedenza ^{9. Un simile protocollo FLIP può essere utilizzato con una sonda mirato allo spazio inter-membrana mitocondriale per essere in grado di rilevare la continuità risultante dalla fusione del esterno, ma non le membrane mitocondriali interne (fase 2 nella Figura 3A).}

1. Aprire il software di acquisizione delle immagini sul microscopio confocale e impostare i parametri di scansione appropriati nella scheda "Acquisizione" (Tabella 1). Controllare la serie "Time", "imbianchimento", e "scatole Regioni" per aprire le singole schede. Mettere i valori dei parametri di acquisizione appropriati in ogni scheda (Tabella 1).
   NOTA: Il foro stenopeico dovrebbe essere lasciata aperta, in quanto questo esperimento è stato progettato per monitorare segnale complessivo da tutta la popolazione mitocondriale in singole cellule.
2. Utilizzare l'oculare di individuare rapidamente il campo di interesse per il tessuto vivo montato.
   NOTA: Selezionare le ovarioli che sono ben distribuiti sul vetro-bottomed piatto, dal momento che la microscopia confocale non può essere eseguita su ovarioli galleggianti.
3. Fare clic su "live" per acquisire una immagine dal vivo del campo selezionato di interesse. Fai clic su "stop" per interrompere la scansione diretta.
4. Se necessario, regolare i parametri di acquisizione in modo tale che il segnale fluorescente rilevata è al di sotto dei livelli di saturazione (indicati per l'assenza di pixel rossi quando l'opzione "indicatore di gamma" è selezionata), con lo sfondo definito come stabilito regolando i valori di offset.
5. Disegnare una piccola ROI utilizzando lo strumento di disegno Bézier dalla scheda "Regioni" per delimitare la zona di photobleaching sull'immagine acquisita attraverso la scansione diretta.
   NOTA: La dimensione della ROI dovrebbe essere di circa 20 - 50% del segnale di fluorescenza mitocondriale totale all'interno della cellula.
6. Eseguire l'acquisizione delle immagini cliccando su "start esperimento."
7. Quantificare l'intensità di fluorescenza utilizzando il proprietario o il software open-source (vedi MaterialiTabella). Registrare il segnale media del ROI in cui si rivolge lo sbiancamento ripetitivo (FLIP); la ROI dove sbiancamento non è stato eseguito nella stessa cella (Sperimentale); il ROI da un'altra cella greggio nello stesso campo di vista, per valutare lo sbiancamento generale durante il periodo di sperimentazione (sbianca); e il ROI sull'area sfondo (background). Sottrarre il segnale di fondo medio ottenuto dal segnale medio nell'altra ROI. Normalizzare il segnale fluorescente con il segnale iniziale pre-candeggina per la rispettiva cella.
8. Tracciare i dati normalizzati utilizzando qualsiasi software di tracciato standard.

5. La colorazione fluorescente live con mitocondriale Coloranti

NOTA: la struttura dei mitocondri stabilizzati e delle potenzialità possono essere valutati utilizzando coloranti che incorporano nei mitocondri in particolare in cellule vive e tessuti. Live ovaie Drosophila possono essere colorati ex vivo con mitocondriale fluorescentemacchie di visualizzare i mitocondri, per valutare le specie reattive dell'ossigeno mitocondriali (mito-ROS), e per valutare il potenziale mitocondriale per unità di massa. Questo può essere ottenuto mediante co-colorazione con l'estere mitocondriale potenziometrico colorante tetramethylrhodamine etile (TMRE) e una macchia mitocondriale vivo compatibili che rappresenta la massa mitocondriale (vedi Materiali Tavolo per i coloranti specifici).

1. Diluire lo stock delle macchie di insetto caldo sezionare medio alle concentrazioni di servizio definitivo: macchia mitocondriale, 250 Nm; TMRE, 50 Nm; e Mito-ROS macchia, 5 micron.
2. Dopo la dissezione e prendere in giro le ovaie seguente punto 2, inserire le ovaie in 200 ml di una particolare soluzione colorante in un pozzo di un piatto dissezione. li Incubare per 10 minuti con il piatto coperto da una scatola adatta avvolto con un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce. Lavare le ovaie colorati con spostandoli con cura con una pinza in 3 pozzi consecutivi contenentg mezzo senza macchia.
3. Per la co-colorazione con TMRE e la macchia mitocondriale globale compatibile, seguire il protocollo di cui sopra a macchia prima con TMRE e poi subito con la macchia mitocondriale complessiva (senza fasi di lavaggio in mezzo).
4. Montare le ovaie su un piatto fondo di vetro Polyl-lisina rivestito passo successivo 3 e prepararsi per la microscopia confocale con i parametri di scansione appropriati (Tabella 1), seguendo i passaggi 4,2-4,4.
   NOTA: Il segnale proveniente dai coloranti incorporati non durò quando si tenta di montare i campioni macchiati nel mezzo di montaggio.
5. Selezionare la casella Z-sezionamento per aprire la scheda. Girare la ruota attenzione verso la parte inferiore del campione mentre è in fase live-scansione e cliccare su "set prima" per definire il più in basso Z-sezione. Fare lo stesso mentre si muove la ruota attenzione verso l'altra direzione per definire la sezione più in alto.
6. Eseguire l'acquisizione delle immagini cliccando su "start esperimento."
7. Quantificare l'intensità della fluorescenza di fondo corretta dai ROI per il segnale di fondo e le singole celle (come al punto 4.7) e tracciare i dati utilizzando qualsiasi software di tracciato.

6. Generazione di DRP1 Null Mosaici

NOTA: La strategia clonale utilizzato qui introduce verdi proteina fluorescente (GFP) -negativi DRP1 cloni nulli sullo sfondo di un GFP-positive, fenotipicamente wild-type sfondo che è eterozigote genotipicamente per l'DRP1 null mutazione ^9. Da shock termico indotto bersaglio riconoscimento flippase-flippase (FLP-FRT) mediata site-specific mitotico ricombinazione crea cloni omozigoti dell'allele drpKG03815 funzionalmente nullo. Il genotipo di Drosophila portare il mutante DRP1 è drpKG03815 FRT40A / CYO, mentre il genotipo che porta la FLP shock termico indotto (hsFLP) e UbiGFP marcatore clonale è hsflp; NLS-GFP ubiquitina (UbiGFP) FRT 40A / cyo. Il genotipo della SEprole zionato della croce tra i genotipi di cui sopra è hsFLP / +; drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A.

1. Sincronizzare la Drosophila per la raccolta vergine spostandoli in nuovi flaconi di cibo fresco ogni 2 o 3 giorni. Monitorare le fiale pupariating giornaliera al fine di raccogliere femmine vergini emergenti.
2. Raccogliere, curly-ala femmine vergini dagli occhi rossi dal genotipo mutante DRP1 ogni giorno, una volta al mattino e una la sera, e metterli in un flacone separato. In parallelo, la raccolta di sesso maschile Drosophila con gli occhi rossi scuri e le ali diritte che trasportano hsflp e UbiGFP entro 5 giorni di eclosion.
3. Impostare una croce aggiungendo i maschi alle femmine vergini con un rapporto femmine: maschi di 2: 1.
4. Spruzzare una piccola quantità di lievito granulato per stimolare la produzione di uova.
   NOTA: spostare con cautela la Drosophila per una fiala fresca dei media ogni 2 o 3 giorni di tempo per aumentare la quantità di prole e per ridurre l'affollamento fiala.
5. Unesthetize, ordinare e raccogliere direttamente dalle ali, progenie femminile occhi rossi entro 5 giorni di eclosion.
6. Per lo shock termico, posizionare la Drosophila raccolto in fiale vuote con una piccola quantità di lievito granulata e un piccolo, morbido pulire (per assorbire l'umidità durante lo shock termico). Posizionare la fiala con il Drosophila in un bagno di acqua a 38 ° C per 1 h, per generare cloni principalmente follicolo, ea 37 ° C per 1 h due volte al giorno (in modo che almeno 5 h tra gli shock 2 calore) per 2 giorni consecutivi , per generare sia linea germinale e cloni di cellule del follicolo.
   NOTA: Assicurarsi che il flaconcino è completamente sommerso in acqua fino al livello della spina.
7. Lo shock termico può rendere il immobile Drosophila. Lasciare che la Drosophila calore scioccato per recuperare per 1 ora a temperatura ambiente quando diventano di nuovo mobile.
8. Aggiungere i maschi di nuovo alle femmine nella stessa proporzione, come nella croce, e spostarli fiale freschi con medium spruzzato con una piccola quantità di lievito granulato. Mantenere la Drosophila per almeno 5 giorni.
9. Sezionare ovaie come necessario per un esperimento in tensione o fisso.
   NOTA: ovaie isolati dal parentale Drosophila esprimere UbiGFP dovrebbero essere utilizzati come controlli negativi per confermare l'induzione efficiente di cloni GFP-negativo dallo shock termico.

7. Co-immunocolorazione per ciclina E e I mitocondri

NOTA: Per rilevare Drosophila ciclina E (dCyclinE), abbiamo utilizzato un anticorpo commerciale ottenuto in rilievo in particolare contro dCyclinE ⁹ (vedi Materiali Tavolo). Come marcatore mitocondriale, abbiamo utilizzato un anticorpo contro ATP-B (una subunità del complesso mitocondriale ATP sintasi) ^9.

1. Warm 4% paraformaldeide (PFA) a temperatura ambiente, 25 ° C. Attenzione! Paraformaldeide è tossico.
   NOTA: Dopo l'aperturala fiala, PFA deve essere conservato a 4 ° C e utilizzata entro 7 giorni. Questo perché stoccaggio di PFA può consentire l'ossidazione di metanolo, che drammaticamente alterare membrane mitocondriali durante la fissazione, anche se presenti in tracce.
2. Subito dopo la dissezione, fissare le ovaie sezionati mettendoli in 200 ml di fresca PFA in un pozzo di un piatto di vetro dissezione (senza prendere in giro). Tenere il piatto in una cappa aspirante per 15 min. Lavare le ovaie fissati spostandoli delicatamente con la pinza in 3 pozzetti consecutivi, ciascuna contenente 200 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS).
   NOTA: L'esperimento può essere fermato qui ed i campioni possono essere lasciati a 4 ° C per 1 giorno.
3. Tease le ovaie più a fondo in PBS (simile al punto 2.6) per rimuovere con attenzione la guaina fibrosa protettivo che possono ostacolare l'accesso antigene dell'anticorpo.
4. Permeabilize le ovaie presi in giro mettendoli in una provetta per microcentrifuga con 500 ml di appena fatte 0.5% PBS-Triton-X100 (PBS-TX) e incubare per 30 min mentre a dondolo a 25 rpm.
   NOTA: Durante il dondolio, posizionare i tubi paralleli al movimento a dondolo; mettendoli perpendicolarmente può consentire al tessuto di aderire al tappo dei tubi, con conseguente perdita di tessuto.
5. Per rimuovere il PBS-TX, posizionare i tubi microcentrifuga in un rack per consentire al tessuto di stabilirsi al fondo delle provette. li ispezionare visivamente e toccare i tubi, se necessario, per portare eventuali tessuti galleggiante verso il basso. Aspirare la soluzione attentamente dall'alto, assicurandosi che il tessuto nella parte inferiore dei tubi rimane indisturbata.
6. Bloccare le ovaie aggiungendo 200 ml di 2% di albumina sierica bovina (BSA) sciolti in 0.5% PBS-TX, e incubare sul bilanciere a temperatura ambiente per 1 h. Rimuovere l'agente bloccante seguendo passo 7.5.
7. Aggiungere anticorpi primari in 200 ml di agente bloccante fresco: anti-coniglio anticorpi dCyclinE (1: 100) e anti-topo ATP-B anticorpi(1: 100). Incubare i tessuti sul bilanciere per 2 ore a temperatura ambiente.
8. Lavare le ovaie con PBS-TX 3 volte per 15 minuti ciascuno, seguendo passo 7.5.
9. Aggiungere 200 ml di anticorpi secondari appropriate nella fresca PBS-TX: anti-topo-CY3 (1: 1.000) e anti-rabbit-CY5 (1: 500). Incubare sul bilanciere per 1 ha temperatura ambiente.
10. Lavare le ovaie con PBS-TX 3 volte per 15 minuti ciascuno, seguendo passo 7.5.
11. Per macchiare il DNA, aggiungere Hoechst (1: 1000 diluizione) alla finale di lavaggio PBS-TX.
12. Infine, lasciare il tessuto in 500 ml di PBS 1x.
13. Usando una micropipetta da 1 ml, togliere le ovaie immunostained dalla provetta da microcentrifuga in un pozzo fresco di un piatto di vetro dissezione contenente 200 ml di PBS.
14. Aggiungere una goccia di soluzione di montaggio glicerolo basata su un vetrino e aggiungere ovaie immunostained uno ad uno per la soluzione di montaggio.
    NOTA: Assicurarsi che le ovaie sono infatti trasferiti al mezzo di montaggio. Non riuscendo a fare so porterà alla perdita di tessuto.
15. Mentre guardando attraverso il microscopio dissezione, cogliere delicatamente le ovarioli trasparenti (stadi più giovani) dalle opache camere uovo maturo utilizzando l'ago presa in giro mentre si tiene la parte opaca delle ovaie con le pinze. Rimuovere le camere uovo maturo dal mezzo di montaggio.
16. Inserire un coprioggetti (22 mm, No. 1) sulla slitta e premere leggermente per assicurare che il mezzo di montaggio si diffonde uniformemente sotto.
    NOTA: Premendo sul coprioggetti assicura anche il corretto allineamento del tessuto lungo il coprioggetti. Non riuscendo a farlo in modo ottimale può consentire le tappe più piccole di galleggiare nel mezzo di montaggio, impedendo la microscopia ottimale di tali tessuti.
17. Asciugare i campioni per 15 minuti e sigillare i bordi del coprioggetti accuratamente con smalto.
18. Eseguire microscopia confocale come per bisogno sperimentale (Tabella 1).

Risultati

I metodi descritti possono essere utilizzati per studiare la struttura e la funzione mitocondriale in ovaie Drosophila vivi e fissi (Figura 2B). A condizione sono alcuni esempi di risultati attesi ottenuti con i metodi descritti.

La dissezione delle ovaie Drosophila: Quando sezionato ulteriormente, gli addomi mozzate (Figura 3B) da tutta la Drosophila ...

Discussione

I passaggi critici all'interno del protocollo

Photobleaching: Prevenire indebite photobleaching dei campioni fluorescenti è assolutamente necessario per l'esecuzione efficiente microscopia confocale. Pertanto, il tempo utilizzato per individuare i campioni attraverso l'oculare o per impostare i parametri di acquisizione di immagini attraverso la modalità di scansione dal vivo deve essere ridotto al minimo per ridurre al minimo photobleaching.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grace's Media (Insect Dissecting Medium)	Fisher Scientific	30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ	Electronic Microscopy Sciences	50-259-99
Mitotracker Green (overall mitochondrial stain)	Life Technologies	m7514	Reconstitute and Aliquot
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate	Sigma Aldrich	87917-25MG	Reconstitute and Aliquot
MitoSox (Mito-Ros stain)	Life Technologies	m36008	Reconstitute and Aliquot
PolyLysine	MP Biomedicals	ICN15017625
Fly Vials	Fisher Scientific	AS-515
Fly Conicals	Fisher Scientific	AS-355
Fly Vial Flugs	Fisher Scientific	AS273
Fly Conical Flugs	Fisher Scientific	AS 277
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)	Fisher Scientific	AS153
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9647-50G
Cyclin E Antibody (d-300)	Santa Cruz	sc- 33748
ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker	AbCam	ab14730
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-165-146
Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-175-144
Hoechst	Fisher Scientific	H3570
VectaShield	Fisher Scientific	H100
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides	Fisher Scientific	22-026-252
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish	Fisher Scientific	P35G-0-14-C
Active Dried Yeast	Fisher Scientific	ICN10140001
Confocal Microscope	Carl Zeiss	LSM 700
Dumont #5 Forceps	Fine Science Technologies	11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Technologies	26016-12
Minutien Pins	Fine Science Technologies	26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )	Bloomington Stock Center	7194
Fly Pad	Fly stuff	59-118
Blowgun	Fly stuff	54-104
Blowgun needle	Flystuff	54-119
Dissecting Microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000
Analyses software	Carl Zeiss	Zen
Analyses software	Open source	Image J
Research Macro Zoom Microscope	Olympus	MVX10
QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono	QImaging	QIC-F-M-12-C
QCapture Pro 5.1	QImaging