La coltivazione di<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In tre dimensioni in laboratorio

Riepilogo

Vi presentiamo un metodo semplice per la costruzione di sistemi di coltivazione nematode 3D chiamati NGT-3D e NGB-3D. Questi possono essere utilizzati per studiare nematode fitness e comportamenti in habitat che sono più simili a naturali Caenorhabditis elegans habitat rispetto alle laboratorio C. elegans piastre di coltura 2D standard.

Abstract

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Introduzione

The study of the nematode Caenorhabditis elegans in the laboratory has led to seminal discoveries in the field of biology over the last five decades¹. C. elegans was the first multicellular organism to have its genome sequenced in 1998², and it has been invaluable in understanding the contributions of individual genes to the development, physiology, and behavior of a whole organism. Scientists now are looking to further understand how these genes may contribute to the survival and reproductive fitness of organisms in their natural environments, asking questions about ecology and evolution at the genetic level^3-5.

C. elegans once again can provide an excellent system to answer these questions. However, little is known about C. elegans biology in natural nematode habitats, and there are no current methods to simulate controlled natural conditions of C. elegans in the laboratory. In the lab, C. elegans is cultivated on the surface of agar plates seeded with E. coli bacteria⁶. In nature, however, C. elegans and related nematodes can be found sparsely inhabiting soils throughout the globe, but they are specifically found thriving in rotting fruits and vegetative matter^7,8. These three-dimensional (3D) complex environments are quite different from the simple 2D environments to which worms are exposed to in the laboratory.

To begin to answer questions about the biology of nematodes in a more natural 3D setting, we have designed a 3D habitat for laboratory cultivation of nematodes we called Nematode Growth Tube 3D or NGT-3D for short⁹. The goal was to design a 3D growth system that allows for comparable growth, development, and fertility to the standard 2D Nematode Growth Media (NGM) plates¹⁰. This system supports the growth of bacteria and nematodes over their entire life cycles in 3D, allows worms to move and behave freely in three dimensions, and is easy and inexpensive to manufacture and employ.

In the current study, we provide a step-by-step method to manufacture NGT-3D and evaluate worm development and fertility. In addition to assessing worm fitness in 3D, we sought to image, video, and assess worm behavior and physiology in 3D cultivation. Thus, in addition to NGT-3D, we present here an alternate method called Nematode Growth Bottle 3D or NGB-3D, for the microscopic imaging of C. elegans during 3D cultivation. This will be especially important for the study of known behaviors identified in 2D, and the identification of novel behaviors unique to 3D cultivation.

Protocollo

1. Preparare Soluzioni per NGT-3D e NGB-3D

1. Preparare le seguenti soluzioni sterili: 1 L di soluzione 0,1454 M di NaCl, 1 L di 1 M CaCl _2, 1 L di 1 M MgSO _4, lisogenia Broth (LB), 1 L di 1 M KPO ₄ tampone (108,3 g di KH ₂ PO ₄ e 35,6 g di K ₂ HPO _4, e riempire H ₂ O a 1 L). Produzione di NGM utilizzando queste soluzioni può essere trovato in un precedente protocollo ^10.
2. Le soluzioni autoclave a 121 ° C, 15 min.
3. Preparare 50 ml di 5 mg / ml soluzione colesterolo sterile. In una provetta conica da 50 ml, mescolare 0,25 g di colesterolo e 50 ml di etanolo 99,99% e mescolare bene. Non sterilizzare in autoclave. Sterilizzare la soluzione di colesterolo utilizzando una siringa da 50 ml con un filtro a siringa da 0,45 micron. Questo sarà anche eliminare ogni colesterolo non disciolto.
4. (Opzionale) Preparare 10 ml di una 150 mm di 2'-desossi-5-fluorouridina (FUDR) stock. In un tubo conico da 15 ml, mescolare 0,3693 gdi FUDR e 10 ml di acqua distillata. Agitare bene.

2. Preparare Coltura dei batteri per NGT-3D e NGB-3D

1. Inoculare 10 ml di brodo LB con i batteri. I batteri standard utilizzati per la C. elegans alimentazione è ceppo di E. coli OP50.
2. Cultura l'inoculazione batterica a 37 ° C in un incubatore agitazione durante la notte.
3. In preparazione per una diluizione seriale, aliquote 9 ml di soluzione NaCl in sterili 15 ml provette coniche. Ad esempio, aliquota 9 ml in un totale di 7 tubi per fare una diluizione 10 ^-7 del ceppo OP50 E. coli.
4. Usando una pipetta sterile, 1.000 ml, pipetta 1 ml di coltura batterica o coltura batterica diluito nella nuova provetta sterile con 9 ml di soluzione di NaCl e vortice bene il composto 10 ml. Ripetere fino a raggiungere la diluizione batterica desiderato.
   NOTA: La diluizione batterica desiderata dipende dal tipo e dalle condizioni di batteri e le condizioni sperimentali esatti.Ad esempio, a 10 ^-6 - diluizione del ceppo OP50 E. coli 10 ^-8 era sufficiente a produrre da 1 - 200 colonie batteriche per 6,5 ml tubo NGT-3D. Worms affidabile sviluppati e riprodotti normalmente quando il numero delle colonie era finita 60, avvenuta ad una diluizione di 10 ^-6 - 10 ^-7. Per NGB-3D, usare una diluizione di 10 ^-8.

3. Fare NGT-3D e NGB-3D (200 ml)

1. Dopo preparazione della coltura batterica, miscela 0,6 g di NaCl, 1 g granulato agar, e 0,5 g di peptone in un pallone da 500 ml. Inserire una ancoretta magnetica nel pallone.
2. Aggiungere 195 ml di acqua distillata e coprire la bocca del pallone con un foglio di alluminio.
3. Autoclave 121 ° C per 15 min.
4. Porre il pallone in autoclave a caldo su un piatto mescolare, e mescolare a velocità moderata per almeno 2 ore. Raffreddare il pallone a 40 ° C. Assicurati di raffreddare sufficientemente come si continua da qui a temperature elevate può portare a opacità del agar finito.Tuttavia, temperature più basse possono provocare il rapido indurimento di agar.
   1. (Facoltativo) Per accelerare il processo di raffreddamento, mettere il pallone in un 40 ° C bagnomaria 15 minuti prima di mettere su un piatto mescolare.
5. Quando la temperatura del supporto agar raggiunge 40 ° C, aggiungere 200 ml 1 M CaCl _2, 200 ml di 5 mg / soluzione colesterolo ml, 200 ml 1 M MgSO ₄ e 5 ml 1 M KPO ₄ buffer come la soluzione continua a mescolare a concentrazioni finali di 1 mM CaCl _2, 5 ug / ml di colesterolo, 1 mM MgSO _4, 1 mM KPO _4.
   1. (Opzionale) per test di durata della vita NGT-3D aggiungere 80 ml di 150 mm FUDR ad una concentrazione finale di 120 micron ^12.
6. Aggiungere 6 ml di 10 ml diluiti coltura batterica dal punto 2.4 nel pallone direttamente.
   1. (Opzionale) per NGT-3D, rimuovere le 6 ml di terreni di coltura prima del punto 3.6 e tenere in caldo separatamente. Questo supporto sarà utilizzato per i batteri senzastrato superiore.
7. Utilizzando le procedure sterili, erogare i media in una camera di cultura sterile. Assicurarsi che il coperchio della camera si chiude ermeticamente.
   1. (Opzionale) Per evitare colonie batteriche formazione sulla superficie superiore della agar, fare uno strato di priva di batteri agar dal punto 3.6.1 sulla sommità prima che il supporto dal punto 3.7 completamente indurisce. Ciò creerà una zona libera da batteri nella parte superiore della NGT-3D.
   2. Per NGT-3D, versare 6,5 ml supporti nelle provette di plastica trasparenti 8 ml di fare uno strato di batteri agar, e dispensare accuratamente 200 ml di mezzi di comunicazione priva di batteri sulla parte superiore del supporto semi-indurito 3D per fare un sottile bacteria- strato libero sulla parte superiore.
   3. Per NGB-3D, versare 65 ml di media nel 25 centimetri bottiglia coltura cellulare ² plastica trasparente. Tale importo deve riempire il corpo della bottiglia 25 centimetri cultura ² cellule.
8. Lasciare camere verticalmente a temperatura ambiente per una settimana per consentire colonie batteriche di crescerenotevoli dimensioni del diametro minimo di 1 mm.
   1. (Opzionale) per test di durata della vita in NGT-3D, camere di coprire con un foglio di alluminio per evitare il degrado luce di FUDR.

4. Misurare Fitness di Worm Popolazione al NGT-3D (Brood dimensione relativa del saggio)

1. Scegliere un verme L4 fase utilizzando un filo di platino raccogliere e trasferire su un piatto NGM senza batteri. Lasciare verme di spostarsi liberamente per alcuni minuti per rimuovere batteri attaccati al suo corpo.
2. Ripetere il passaggio 4.1 e fare in modo che il worm è esente da batteri. In generale, due repliche di 4.1 sono sufficienti.
3. posizionare con cura il verme pulita sulla superficie del supporto 3D con un pick filo di platino. Il worm dovrebbe finalmente entrare l'agar agar nella matrice 3D.
4. Chiudere il coperchio senza bloccare consentendo una certa aria nel tubo, ma impedendo l'essiccazione dei media agar.
5. Incubare per 96 ore a 20 ° C.
6. Dopo 4 giorni, chiudere ermeticamente i coperchi e posizionare ilNGT-3D camera di cultura in un bagno d'acqua C 88 ° per sciogliere l'agar. Il calore uccide i vermi, ma i loro corpi rimangono intatti.
   NOTA: L'utilizzo 8 ml tubi per NGT-3D, 20 - 30 minuti di incubazione è di solito sufficiente.
7. Usando una pipetta di vetro, trasferire i mezzi fuso su un piatto di plastica 9 centimetri di Petri. pipette di plastica non sono invitati, come i vermi possono spesso bastone a loro.
8. Utilizzando un microscopio stereoscopico dissezione trasmissione, contare il numero di vermi al L3, L4 e stadi adulti. Non contare i vermi che sono L2 fase e più giovani, come le generazioni F1 e F2 possono essere confusi qui. Così, questo test è un test relativo dimensione covata piuttosto che un dosaggio totale dimensioni covata.

5. Immagine e Record Worm Comportamento NGB-3D

1. Scegli uno stadio verme L4 utilizzando un filo di platino raccogliere e rimuovere i batteri attaccati alla superficie trasferendo ad una piastra NGM senza batteri e permettendo di muoversi liberamente per alcuni minuti.
2. Ripetere il passaggio 5.1 per assicurarsi che il worm è esente da batteri.
3. posizionare accuratamente il verme pulito sul centro della superficie agar del NGB-3D vicino al collo della bottiglia con un pick filo di platino. Il worm dovrebbe finalmente entrare l'agar agar nella matrice 3D.
4. Chiudere il coperchio senza bloccare consentendo una certa aria nel tubo, evitando l'asciugatura dei media agar.
5. Immagine o registrare il verme sotto una dissezione stereo microscopio di trasmissione. Regolare la messa a fuoco come il verme si muove attraverso la matrice 3D.

Risultati

La costruzione di NGT-3D è un protocollo semplice e lineare che si traduce in una provetta agar-riempita con piccole colonie batteriche distanziati tutto il agar (Figura 1A). Worms possono muoversi liberamente attraverso la matrice agar, trovare e consumare le colonie batteriche. Per confermare se C. elegans possono riprodursi e di crescere normalmente in NGT-3D, abbiamo confrontato la fertilità e lo sviluppo larvale in 3D con piastre standard 2D NGM. Nel sagg...

Discussione

La coltivazione laboratorio di C. elegans utilizzando le piastre di terreni di crescita nematode classici è stato fondamentale per le centinaia di importanti scoperte che la ricerca in C. elegans ha fornito. Qui, vi presentiamo i nuovi metodi per coltivare C. elegans in un ambiente che rifletta più accuratamente i loro naturale habitat tridimensionali. Sebbene altri metodi sono stati usati per osservare C. elegans in 3D ^13, questo è il primo protocollo che permette la co...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB broth, Miller (Luria-Bertani)	Difco	224620
Sodium chloride	DAEJUNG	7548-4400	58.44 MW
Agar, Granulated	Difco	214530
Peptone	Bacto	211677
Calcium chloride, dihydrate	Bio Basic	CD0050	2*H2O; 147.02 MW
Cholesterol	Bio Basic	CD0122	386.67 MW
Ethyl alcohol	B&J	RP090-1	99.99%; 46.07 MW
Magnesium sulfate, anhydrous	Bio Basic	MN1988	120.37 MW
Potassium phosphate, monobasic, anhydrous	Bio Basic	PB0445	136.09 MW
2'-Deoxy-5-fluorouridine	Tokyo Chemical Industry	D2235	246.19 MW
Potassium phosphate, dibasic, anhydrous	Bio Basic	PB0447	174.18 MW
Multi-Purpose Test Tubes	Stockwell Scientific	ST.8570	8 ml
Test Tube Closures	Stockwell Scientific	ST.8575
Cell Culture Flask	SPL Lifescience	70125	25 cm2
Research Stereo Microscope	Nikon	SMZ18
High-Definition Color Camera Head	Nikon	DS-Fi2
PC-Based Control Unit	Nikon	DS-U3
NIS-Elements Basic Research, Microscope Imaging Software	Nikon	MQS32000