Un tumore modello murino ortotopico della vescica e del tumore Detection System

Riepilogo

Questo protocollo descrive la generazione di tumori della vescica ortotopico murini in femmine C57BL 6J e il monitoraggio della crescita tumorale /.

Abstract

Questo protocollo descrive la generazione di tumori della vescica in topi C57BL / 6J femmina utilizzando la linea cellulare di cancro alla vescica murino MB49, che è stato modificato a secernere prostatico umano specifico (PSA), e la procedura per la conferma di impianto del tumore. In breve, i topi vengono anestetizzati con farmaci iniettabili e sono fatti per porre in posizione di dorsale. L'urina è liberata dalla vescica e 50 ml di poli-L-lisina (PLL) viene lentamente instillato ad una velocità di 10 microlitri / 20 s utilizzando un catetere 24 G IV. Si lascia in vescica per 20 min in tappatura catetere. Il catetere viene rimosso e PLL è lasciata libera entro una leggera pressione sulla vescica. Questa è seguita da instillazione della linea cellulare di cancro alla vescica murino (1 x 10 ⁵ cellule / 50 mL) ad una velocità di 10 ml / 20 s. Il catetere viene tappo per evitare evacuazione prematura. Dopo 1 h, i topi sono fatti rivivere con un farmaco inversione, e la vescica è liberate. Il tasso di instillazione lento è importante,poiché riduce il reflusso vescico-ureterale, che può causare tumori a verificarsi nel tratto urinario superiore e nei reni. La linea cellulare dovrebbe essere ben risospeso per ridurre aggregazione di cellule, come questo può portare a dimensioni tumorali irregolari dopo l'impianto.

Questa tecnica induce tumori con elevata efficienza. La crescita del tumore è monitorato da urinario secrezione di PSA. monitoraggio marcatore PSA è più affidabile di ultrasuoni o la fluorescenza per la rilevazione della presenza di tumori nella vescica. I tumori nei topi generalmente raggiungono una dimensione massima che influisce negativamente la salute di circa 3 - 4 settimane, se non trattata. Monitorando la crescita tumorale, è possibile differenziare topi che sono stati curati da quelli che non sono stati impiantati con successo con tumori. Con solo l'analisi end-point, quest'ultimo può essere erroneamente assume che sono stati curati con la terapia.

Introduzione

L'obiettivo di questo metodo è quello di generare tumori della vescica murino ortotopiche e di monitorare i tumori impiantati con la massima precisione possibile, in modo che i topi senza l'impianto del tumore non è pensato per essere trattato ad analisi end-point. In generale, il metodo mostrato ridurrà la necessità di un gran numero di topi per analisi sperimentale e garantire una maggiore precisione nel determinare risultati terapeutici.

Lo sviluppo di un modello ortotopico per il cancro è importante, in quanto le cellule tumorali impiantare sottocute non ricapitolano l'ambiente della malattia clinica o consentire lo sviluppo di strategie terapeutiche. L'architettura della vescica permette l'instillazione di terapie del cancro della vescica direttamente nella vescica con effetti sistemici minimi. Così, i modelli animali che ricapitolano questo ambiente, come un modello ortotopico, sono importanti per valutare nuove terapie. Le conclusioni tratte da qualsiasi set-up sperimentale sono dependent sulle limitazioni del modello.

Numerose tecniche sono state sviluppate per la produzione di tumori della vescica ortotopico nei topi. Questi si affidano danneggiare lo strato glicosaminoglicano della vescica, consentendo cellule tumorali da impiantare. Le tecniche utilizzate comprendono elettrocauterizzazione, che si traduce in un unico punto di danno nella parete della vescica, con conseguente sviluppo del tumore in un sito nella vescica ^1,2. Tuttavia, il tasso di successo di impianto tumore, utilizzando elettrocauterizzazione è operatore-dipendente variabili da 10 - 90%, e comprende il pericolo che la parete della vescica viene perforato, portando a sviluppare tumori nella cavità peritoneale. Cauterizzazione chimica viene eseguita utilizzando nitrato d'argento, che danneggia la parete della vescica ^3. Analogamente, l'acido è stato usato per danneggiare la parete della vescica ^4. Tripsina è stato utilizzato anche per danneggiare la vescica e ^5. Questi metodi possono provocare lo sviluppo di più di un tumore nella vescica.Inoltre, vi è il rischio di gravi danni alla vescica se le sostanze chimiche vengono lasciati a contatto con la parete della vescica per troppo tempo. Il metodo sviluppato da Ninalga et al. utilizza il poli-L-lisina carica positiva (PLL) ⁶ molecole per rivestire la parete della vescica; Questo permette alle cellule tumorali carica negativa ad attaccarsi al livello glicosaminoglicano della vescica. Questo metodo comporta generalmente più di un tumore sviluppare nella vescica, ma tumorale impianto è a 80 - 100% ^4,7. Tecnicamente, è anche la procedura più semplice da eseguire. Per garantire che i tumori che si sviluppano sono abbastanza anche in dimensioni, è importante che le cellule tumorali non vengono raggruppati in grandi ciuffi prima dell'impianto.

Per valutare l'efficacia terapeutica, è meglio effettuare questo studio su topi con tumori abbastanza di dimensioni simili. Così, un buon sistema di rilevamento che possono quantificare le dimensioni del tumore subito dopo l'impianto è importante. Diverse strategie sono apen usato per valutare i tumori. Questi includono la risonanza magnetica (MRI) ^8-10, fluorescenza ^11, bioluminescenza ^12,13, ultrasuoni ^14, e il dosaggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) ^15,16. Mentre MRI e ultrasuoni non richiedono modifiche delle cellule tumorali, vi è la necessità di attrezzature e contrasto sensibili agenti per MRI. I saggi fluorescence-, luminescence-, e basati su ELISA richiedono modifiche delle cellule tumorali per esprimere proteine ​​marker che possono essere rilevati da questi metodi. Per luminescenza, un substrato è necessaria per la rilevazione dell'attività di luciferasi; vi è quindi un passo aggiunto e aumento dei costi. Sia luminescenza e fluorescenza richiedono attrezzature specializzate. Per produrre fluorescenza, proteina fluorescente verde (GFP) ciclizzazione, che viene catalizzata da ossigeno molecolare, è necessaria. Così, l'espressione della GFP può essere variabile all'interno di una massa tumorale seconda accesso ad ossigeno, rendendo questo un indicatore piuttosto affidabile ^{17. La modifica della linea di cellule murine cancro alla vescica MB49 a secernere prostatico umano Specific Antigen (PSA) 15,16 come marker surrogato è un'altra strategia. Questi marcatori forniscono anche un mezzo alternativo di conferma presenza del tumore al termine dell'esperimento, rendendoli alternativa alla immunoistochimica. Questo studio riporta il metodo PLL di impianto del tumore ortotopico e presenta un confronto tra sistemi di rilevamento del tumore, cioè ELISA, la fluorescenza, e imaging ad ultrasuoni.}

Protocollo

Tutti i lavori animale aderito alle linee guida istituzionali cura e l'uso Comitato Animal (IACUC) in uso animale di spedizione (numero di protocollo 084/12) presso l'Università Nazionale di Singapore.

1. crescita delle cellule MB49-PSA in vitro e misurazione del PSA secrezione

1. Mantenere murino di cancro della vescica cellule MB49-PSA ¹⁵ in totale Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con siero 10% fetale bovino (FBS), 2 mmol / L di L-glutammina, e 0,05 mg / ml penicillina-streptomicina in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO _2. Aggiungere 200 ug / mL Hygromycin B per mantenere la pressione selettiva di cellule PSA-secernenti.
2. Per determinare la secrezione di PSA, piastra 1 x 10 ⁶ cellule in una piastra di coltura da 6 pozzetti e incubare a 37 ° C in presenza del 5% di CO ₂ per 48 ore.
3. Due giorni dopo, raccogliere il supernatante per la misurazione PSA.
   1. Usando una pipetta Pasteur, trasferire il supernatant ad una provetta 15 centrifuga.
   2. Centrifugare per 5 minuti a 250 xg per rimuovere le cellule galleggianti e detriti. Se il test PSA viene effettuata su un giorno differente, memorizzare il supernatante a - 30 ° C in una provetta da microcentrifuga da 1,5. In caso contrario, passare alla fase successiva immediatamente.
   3. Determinare la concentrazione di PSA con un PSA libero-umano ELISA Kit ^7.
4. Enumerare le cellule placcato.
   1. Usando una pipetta Pasteur, lavare le cellule delicatamente con 1 ml di DMEM. Aspirare e completamente rimuovere il supporto.
   2. Aggiungere 1 ml di mezzi freschi e raschiare delicatamente con un raschietto cellulare per rimuovere le cellule dal pozzo.
   3. Trasferire le cellule in una provetta e risospendere accuratamente per garantire una cella singola sospensione.
   4. Miscelare uguali volumi di sospensione cellulare e una soluzione trypan blu 0,4%. Contare le cellule vive (che non occupano il colorante) utilizzando un emocitometro.
5. Calcolare l'espressione del PSA come ngdi PSA / ml di mezzi / 10 ⁶ cellule. L'espressione PSA di cellule MB49-PSA per l'impianto in topi è di 80 - 120 ng / mL / 10 ⁶ cellule.

2. Determinazione della sensibilità del PSA Misure da ELISA e analisi in tempo reale PCR

1. Piastra cellule MB49-PSA nei media DMEM completo in una piastra di coltura 6-bene con diverse quantità di cellule MB49 parentali tale che c'è un massimo di 1 x 10 ⁶ cellule per bene (ad esempio, 10 ^0, 10 ^1, 10 ^2, 10 ^3, 10 ^4, 10 ^5, o 10 ⁶ cellule MB49-PSA sono coltivate con 10 ^6, 10 ^5, 10 ^4, 10 ^3, 10 ^2, 10 ^1, 10 o ⁰ MB49 cellule, rispettivamente).
2. Il giorno dopo, raccogliere il surnatante per la misurazione del PSA, come descritto al punto 1.3. Determinare la concentrazione di PSA con un PSA libero-umano ELISA Kit ^7.
3. Estrarre il RNA dalle cellule.
   1. Lyse ille cellule direttamente nel piatto con l'aggiunta di 1 ml di reagente di estrazione di RNA.
   2. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente e trasferire il lisato cellulare in una provetta. Aggiungere 0,2 ml di cloroformio e vortice campioni energicamente per 15 s. incubare per 3 minuti a temperatura ambiente.
   3. Centrifugare i campioni a 12.000 xg per 15 min a 4 ° C. Trasferire accuratamente la fase acquosa superiore (0,5 mL) in una nuova provetta senza disturbare l'interfase.
   4. Aggiungere 0,5 ml di alcool isopropilico. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare i campioni a 12.000 xg per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante completamente, senza disturbare il precipitato RNA sul fondo della provetta.
   5. Lavare il pellet una volta con 1 ml di etanolo al 75%. Centrifugare a 7500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere tutti etanolo e consentire il pellet asciugare all'aria per 10 min.
   6. Sciogliere l'RNA in 30 ml di acqua priva di nucleasi. Incubare per 5 minuti a 60 ° C per aumentare la cosìlubility.
   7. Quantificare l'RNA misurando l'assorbanza mediante spettroscopia ultravioletta (UV) a 260 nm (A260). Per valutare l'RNA purezza, misurare l'assorbanza a 280 nm (A280) e calcolare il rapporto A260 / A280, che dovrebbe essere al di sopra 1.6.
4. Reverse-trascrivere cDNA da 2 mg di RNA.
   1. Preparare la miscela di reazione in ghiaccio e trasferirlo a 0,2 mL.
   2. centrifugare brevemente le provette a girare verso il basso i contenuti e per eliminare le bolle d'aria.
   3. Caricare le provette nel termociclatore ed eseguire la trascrizione inversa alle seguenti condizioni: 60 min a 37 ° C seguita da 5 min a 95 ° C. Una volta che la corsa è stata completata, conservare i campioni di cDNA a 4 ° C.
   4. Conservare i campioni a - 30 ° C per una conservazione a lungo termine.
5. Eseguire un real-time PCR per PSA e citoplasmatica beta actina. actina Beta viene utilizzato per normalizzare i campioni. Eseguire il test su 100 ng di RNA reverse-trascritte in un 96 pozzetti plaTE. Analizzare tutti i campioni in triplice copia. Eseguire 40 cicli con i seguenti parametri: 2 min a 50 ° C, 10 min a 95 ° C, 15 s a 95 ° C per la denaturazione, e 1 min a 60 ° C. Impostare il limite più basso di rilevazione in un ciclo soglia (CT) 35; quindi, ogni campione con un valore CT oltre 35 è considerata non rilevabile.

3. mantenere la tumorigenicità della MB49-PSA Cell Line

NOTA: prolungata crescita in vitro porta ad una perdita di tumorigenicità. Per mantenere tumorigenicità, la linea cellulare MB49-PSA è diversi passaggi attraverso il mouse, almeno una volta ogni 2 anni.

1. Cells.
   1. Raccolto in crescita esponenziale cellule raschiando delicatamente con un raschietto cellulare sterile. Miscelare uguali volumi di sospensione cellulare e una soluzione trypan blu 0,4%. Contare le cellule vive usando un emocitometro. Non impiantare se più del 20% delle cellule sono morti.
   2. Calcolare la quantità di cellule vive richiesto (1 x 107 cellule / ml) e trasferirli in una provetta 15 centrifuga. Centrifugare a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C e scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in DMEM supporti vuoti. Ripetere il lavaggio tre volte per rimuovere tutte le tracce di FBS prima dell'impianto.
   3. Mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio fino topi sono pronti per l'impianto.
2. Impiantare le cellule tumorali per via sottocutanea in topi sul fianco dorsale.
   1. Anestetizzare un 4 a 6 settimane di età topo C57BL6 / J utilizzando una miscela di anestetici ketamina e medetomidina (75 mg / kg e 1 mg / kg, rispettivamente), iniettata per via intraperitoneale a 0.1 ml per 10 g di peso corporeo.
   2. Shave il fianco destro per esporre la pelle.
   3. Utilizzando un paio di pinze, sollevare la pelle per separarlo dal muscolo sottostante e iniettare 0,1 ml di sospensione cellulare (1 x 10 ⁶ cellule) per via sottocutanea con un ago 24 G. Durante la rimozione dell'ago, pizzicare il sito di iniezione da 5 a 10 s in modo che le cellule tumorali fannonon fuoriuscire dal sito di iniezione.
   4. Revive il mouse con un'iniezione sottocutanea di atipamezolo (1 mg / kg) a 0.1 ml per 10 g di peso corporeo.
3. Monitorare la crescita del tumore ogni due giorni, misurando il diametro del tumore usando pinze. Il volume del tumore è calcolato utilizzando la formula v = (ab ²⁾ / 2, dove "a" è la dimensione più lunga e "b" è la larghezza perpendicolare, sia in mm.
4. Quando il volume del tumore è di almeno 50 mm ³ (circa 7 giorni), eutanasia il mouse con CO _2. Asportare la massa tumorale con un paio di pinze sterili e forbici in condizioni asettiche e il luogo in DMEM.
5. In una piastra di coltura 6-bene, tritare il tumore in piccoli pezzi con bisturi sterili. Utilizzare una siringa da 1 ml stantuffo come un "pestello" disaggregare ulteriormente il tumore.
6. Aggiungere 3 ml di DMEM completo e mantenere le cellule in un incubatore a 37 ° C e 5% CO _2.
7. Una volta che le cellule aderiscono alla piattaformae (tra uno e due giorni), rimuovere il supporto, detriti, e le cellule non-aderenti aspirando delicatamente con una pipetta Pasteur sterile. Lavare due volte con DMEM. Fare attenzione a non disturbare le cellule.
8. Aggiungere 1 ml di DMEM e raccogliere le cellule da essi raschiando con un raschietto cellulare. Per selezionare ed espandere singole colonie, Contare le cellule utilizzando un emocitometro e la piastra 1 cellule per pozzetto in una piastra di coltura a 96 pozzetti. Cellule di coltura in DMEM con 200 mg / ml Hygromycin B a 37 ° C e 5% di CO _2.
9. Modificare i media ed un antibiotico ogni 4 - 5 giorni. Monitorare le cellule fino a quando sono a circa il 80-90% confluenti. Re-plate cellule su una piastra di coltura a 24 pozzetti pipettando per staccare le cellule dal pozzo.
10. Una volta che le cellule nella piastra di coltura a 24 pozzetti sono confluenti, li rimuovere raschiando con un raschietto cellulare e piastra in una piastra di coltura da 6 pozzetti.
11. Schermo i diversi cloni per la secrezione del PSA, come descritto al punto 1. Cryo-conservare il clone con il massimo segreto PSAione e usarlo per esperimenti futuri del mouse.

4. Impianto del tumore

NOTA: Ogni mouse è impiantato con 1 x 10 ⁵ cellule MB49-PSA in 50 ml di DMEM supporti vergini nella vescica. A causa dello spazio morto nel catetere, sempre preparare volume extra (almeno 100 microlitri supplementari per topo). Un approccio alternativo sarebbe quello di utilizzare una siringa riempita di aria come descritto da Kasman et al. ⁵ piuttosto che una siringa riempita.

1. Cells.
   1. Un giorno prima dell'impianto, quando le cellule sono circa 80% confluenti, passaggio le cellule tumorali MB49-PSA in completa mezzi DMEM (supplementato con 10% FBS, 2 mmol / L di L-glutammina, 0,05 mg / ml penicillina-streptomicina e 200 mcg / mL Hygromycin B) a 37 ° C e 5% CO ₂ ad un rapporto di divisione di 1: 2.
   2. Il giorno della procedura, raccogliere le cellule raschiando delicatamente con un raschietto cellulare sterile. Miscelare uguali volumi di sospensione cellulare eun 0,4% trypan soluzione blu. Contare le cellule vive usando un emocitometro. Non impiantare se più del 20% delle cellule sono morti.
   3. Calcolare la quantità di cellule vive richiesto (2 x 10 ⁶ cellule / ml) e trasferirli in una provetta da 15 centrifuga. Centrifugare a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C e scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in DMEM supporti vuoti. Ripetere il lavaggio tre volte per rimuovere tutte le tracce di FBS prima dell'impianto.
   4. Mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio fino topi sono pronti per l'impianto.
2. Lasciare che il 4 a 6 settimane di età femminile C57BL topi / 6J da ambientare una settimana prima della procedura. Tutti i lavori animale deve essere eseguita in una cappa di sicurezza biologica per mantenere condizioni sterili.
   1. Pesare ogni topo ed iniettare anestesia (75 mg / kg ketamina e 1 mg / kg medetomidina) per via intraperitoneale a 0.1 ml per 10 g di peso corporeo. Bodyweights dovrebbe essere compreso tra 17 e 22 g. Confermare anestesia osservando non RESPONSE dopo un pizzico dito del piede.
   2. Per l'identificazione, segnare l'orecchio con un pugno all'orecchio.
   3. Iniettare la soluzione di sodio o composto di Hartmann lattato per via intraperitoneale a 0,1 ml per 10 g di peso corporeo ogni 1-2 ore per l'idratazione.
   4. Applicare pomata oftalmica sterile in entrambi gli occhi con un bulbo di cotone sterile, dal momento che il riflesso lampeggiante si perde in anestesia e gli occhi secchi. Riapplicare se necessario.
   5. Posare il mouse in posizione supina su carta assorbente sulla cima di un pacchetto di calore (attivato dal contatto con l'aria) per mantenere la temperatura corporea e nastro le zampe posteriori verso il basso.
3. Con un dito, applicare una leggera pressione alla regione addominale inferiore e raccogliere l'urina dalla vescica in una provetta da 1,5 ml. Questo esempio serve come il valore basale di PSA urinaria.
4. Estrarre sterile poli-L-lisina (PLL) in una siringa da 1 ml e allegare un 24-gauge catetere IV, con il mandrino dell'ago rimosso. Applicare il lubrificante alla punta del catetere e insert il catetere attraverso l'uretra nella vescica con pinze per guidare la cateterizzazione. Fermarsi quando si avverte resistenza. NOTA: ricercatori dovrebbero discutere con il proprio personale veterinario della necessità per l'uso di un gel lubrificante con anestetico per instillazioni endovescicale e l'uso di analgesici post-procedura.
5. Instillare 50 ml di PLL lentamente, ad una velocità di 10 ml ogni 20 s, per evitare vescico-ureterale reflusso ^18. Lasciare il catetere nella vescica per 20 min con un tappo per impedire out-flow.
6. Dopo 20 minuti, rimuovere il catetere e lasciare la camera d'aria di qualsiasi contenuto premendo delicatamente sulla regione addominale inferiore. L'utilizzo di un vuoto siringa da 1 ml, lavare eventuali contenuti residui fuori del catetere.
7. Mescolare le cellule MB49-PSA accuratamente pipettando e ritirarsi in una siringa da 1 ml. Fissare il catetere e applicare il lubrificante. Instillare 50 microlitri di 1 x 10 ⁵ cellule ad una bassa velocità di 10 ml ogni 20 s. Sostituire il fermo sulil catetere. Dare topi di controllo 50 ml di soluzione fisiologica.
8. Dopo 1 ora, rimuovere i cateteri e lasciare la vescica di qualsiasi contenuto. Rimuovere il nastro sulle zampe posteriori e posizionare il mouse sui loro lati ventrale. Rilanciare il topi per via sottocutanea che iniettano il farmaco di inversione (1 mg / kg atipamezolo) a 0,1 ml per 10 g di peso corporeo.
9. Monitorare il mouse fino a quando si osserva la motilità. Restituire i topi per loro gabbie.
10. Al termine di un protocollo di rilevamento del tumore (sezioni 5, 7 o 8), eutanasia i topi con CO _2. individuazione del tumore post-mortem è descritto nel capitolo 6.

5. Monitoraggio crescita tumorale con ELISA

NOTA: la presenza del tumore e la crescita è monitorato nei topi, misurando la secrezione di PSA nelle urine. I ricercatori dovrebbero consultare il proprio personale veterinario sul monitoraggio della salute degli animali e il benessere l'impianto post-tumore e gli endpoint umane.

1. Ci sono due metodi per raccogliere l'urina dai topi.
   1. Raccogliere urine notte posizionando un singolo mouse in un individuo gabbia metabolica per separare l'urina da materiale fecale. Se il set-up non ha refrigerazione, aggiungere un inibitore della proteasi (100 l) nel tubo di raccolta delle urine per prevenire la degradazione del PSA durante la notte. Tuttavia, il numero di gabbie metaboliche disponibili limita l'utilità di questo metodo di raccolta delle urine.
   2. Dove è logisticamente impossibile utilizzare gabbie metaboliche (come ad esempio nelle camere ABSL2), raccogliere l'urina posto utilizzando un dito per esercitare una leggera pressione sulla regione addominale inferiore, mentre i topi sono anestetizzati come descritto al punto 4.2.1. Questo è solitamente fatto prima della terapia è instillata. Dalla nostra esperienza, di almeno 150 ml di urina può essere raccolto 1 h dopo l'anestesia.
2. Subito posizionare l'urina raccolta sul ghiaccio. Ematuria può essere visibile dalla seconda settimana dopo l'impianto del tumore. Altamente campioni emolizzati possono influenzare l'analisi ELISA. Pertanto, urinedevono essere posti su ghiaccio e trasformati rapidamente dopo la raccolta.
3. Centrifugare le provette di urina a 6.700 xg per 5 minuti a 4 ° C per rimuovere le cellule o detriti.
4. Per normalizzare la differenza di diuresi tra i topi, un'aliquota l'urina in nuove provette e conservarli a -30 ° C fino a effettuare le analisi per PSA utilizzando un kit ELISA ⁷ e creatinina utilizzando un kit di dosaggio ^7. Anche se i topi non producono PSA, ci sono bassi livelli di legame non specifico identificati mediante ELISA. Per i campioni da considerare positivo, la soglia deve essere impostata a valori superiori a topi normali + 3 deviazioni standard (SD) ^15.

6. Rilevamento della presenza del tumore con il Real-time PCR

1. Alla cessazione, sezionare la cavità addominale del mouse e localizzare la vescica. Accise L'vescica e metterlo in una provetta Microbank ™. Congelare immediatamente in azoto liquido.
2. Estrarre il RNA omogeneizzando i tessuti in un estr RNAreagente azione.
3. Eseguire la trascrizione inversa e real-time PCR per PSA, come sopra descritto nella sezione 2.

7. Monitoraggio crescita tumorale con imaging di fluorescenza

1. Etichetta 1 x 10 ⁷ cellule MB49-PSA con un colorante fluorescente vicino infrarosso ^19.
2. Re-piastra e raccogliere le cellule marcate nei giorni 4, 7, 11, 14, 18, e 21 per verificare se le cellule mantengono la vitalità e fluorescenza mediante citometria di flusso ^20.
3. Impiantare le cellule MB49-PSA etichettati vesciche topi, come sopra descritto nella sezione 4.
4. Monitorare la crescita tumorale mediante un sistema di imaging di fluorescenza ogni due giorni.
5. Il giorno dell'imaging, pesare e anestetizzare topi usando una miscela di anestetici ketamina e medetomidina (75 mg / kg e 1 mg / kg, rispettivamente), iniettata per via intraperitoneale a 0.1 ml per 10 g di peso corporeo.
6. Radere la zona addominale per esporre la pelle.
7. Posizionare topi in camera di imaging e acquisireimmagini delle vesciche utilizzando il software fornito con il sistema di imaging.
8. Rivivere i topi da iniettare per via sottocutanea una droga di inversione (1 mg / kg atipamezolo) a 0,1 ml per 10 g di peso corporeo.

8. Monitoraggio crescita tumorale con alta frequenza ultrasuoni Imaging

1. tumori impianto in topi, come sopra descritti al punto 4.
2. Ogni due giorni, monitorare la crescita del tumore mediante imaging ad ultrasuoni.
3. Il giorno dell'imaging, pesare e anestetizzare topi usando una miscela di anestetici ketamina e medetomidina (75 mg / kg e 1 mg / kg, rispettivamente), iniettata per via intraperitoneale a 0.1 ml per 10 g di peso corporeo.
4. Radere la zona addominale per esporre la pelle.
5. Instillare 100 ml di sterile 0,9% soluzione fisiologica nella vescica utilizzando una 24-gauge catetere IV. La soluzione salina sarà distendere la vescica e migliorare la visibilità durante l'ecografia.
6. Posizionare il mouse sulla piattaforma ecografica e applicare il gel conduttivo alla lotenza addome.
7. Abbassare la sonda portatile per la pelle e acquisire immagini B-mode della vescica sulla piattaforma di imaging ^21.
8. Revive i topi da sottocutanea farmaco inversione iniezione (1 mg / kg atipamezolo) a 0.1 ml per 10 g di peso corporeo.

Risultati

secrezione di PSA da cellule MB49 è risultata variare con i mezzi di crescita. MB49-PSA viene coltivato in DMEM media, perché questo si traduce in un aumento della secrezione del PSA (Figura 1A). Per determinare la sensibilità del PSA ELISA e PCR in tempo reale, diverso numero di MB49-PSA-secernenti cellule sono state mescolate con cellule parentali MB49. PSA ELISA rileva un minimo di 1 x 10 ⁵ cellule secernenti PSA / 1 x 10 ⁶ cellule (Fi...

Discussione

Le fasi più critiche nel protocollo sono 1) mantenere correttamente la tumorigenicità della linea cellulare; 2) garantire la secrezione di PSA misurabile prima dell'impianto delle cellule tumorali nei topi; 3) generare una cella singola sospensione per l'impianto in modo da ridurre la variazione della dimensione del tumore; e 4) instillare cellule a bassa velocità per evitare vescico-ureterale reflusso, con conseguente impianto di cellule tumorali nel rene.

Dopo passaggio prolunga...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
MB49-PSA cells	N/A	N/A	ref (Wu QH, 2004)
RPMI 1640 media	HyClone	SH30027.01
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media	Biowest	L0102
Fetal Bovine Serum (FBS) South American	Biowest	S1810
Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium	Biowest	S181B
Fetal Bovine Serum (FBS)	HyClone	SH30088.03
L-glutamine	Biowest	X0550
Penicillin-Streptomycin	Biowest	L0022
Hygromycin B	Invitrogen	10687-010
free PSA (Human) ELISA kit	Abnova	KA0209
TRIzol Reagent for RNA extraction	Ambion	15596026
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor	Applied Biosystems	4374967
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
TaqMan Gene Expression Assay – Mouse Actb	Applied Biosystems	4331182	Mm00607939_s1
TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3	Applied Biosystems	4331182	Hs00426859_g1
C57BL/6J female mice	In Vivos		4 - 6 wk old
Anesthesia (75 mg/kg Ketamine and 1 mg/kg Medetomidine)	Local pharmacy
Reversal drug (1 mg/kg Atipamezole)	Local pharmacy
Ear punch	Electron Microscopy Sciences	72893-01
Hartmann's solution or Compound sodium lactate	B Braun
Ophthalmic ointment - Duratears sterile ocular lubricant ointment	Alcon
Heat pack - HotHands handwarmers	Heatmax Inc
Introcan Certo IV catheter	B Braun	4251300	24 G x 3/4″
Aquagel Lubricating jelly	Local pharmacy
Poly-L-lysine solution, 0.01%,	Sigma	P4707
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693159001
Quantichrom Creatinine Assay Kit	BioAssay Systems	DICT-50
Fluorescent dye - VivoTrack 680	Perkin Elmer	NEV12000
RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution	Ambion	4427575
Name	Company	Catalog number	Comments
Equipment and Software
7500 Realtime PCR System	Applied Biosystems
7500 Software v2.3	Applied Biosystems
Metabolic Cage	Tecniplast	Vertical type rack for 12 cages
BD FACSCanto I system	BD Biosciences
BD FACSDiva software v7	BD Biosciences
IVIS SpectrumCT in vivo imaging system	Caliper Life Sciences
Living Image Software v3.1	Caliper Life Sciences
Vevo 2100 imaging system	VisualSonics