La forza della semplicità: Sea Urchin embrioni<em&gt; In Vivo</em&gt; Modelli di sviluppo per lo studio delle cellule cellula-Complex segnalazione di rete Interazioni

Riepilogo

Questo articolo descrive il video di una semplice metodologia vivo che può essere utilizzata per caratterizzare in modo sistematico ed efficiente componenti di vie di segnalazione complessi e reti di regolazione in molti embrioni invertebrati.

Abstract

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

Introduzione

reti gene regolatore (GRN) e vie di trasduzione del segnale stabiliscono l'espressione spaziale e temporale dei geni durante lo sviluppo embrionale, che vengono utilizzati per costruire il piano di adulti corpo animale. Cell-a-cella trasduzione del segnale sono componenti essenziali di queste reti di regolazione, fornendo i mezzi con cui le cellule comunicano. Queste interazioni cellulari stabilire e perfezionare l'espressione di geni regolatori e differenziazione nei e tra i diversi territori durante l'embriogenesi ^{1, 2.} Le interazioni tra i modulatori secreti extracellulari (ligandi, antagonisti), recettori, e co-recettori controllano le attività delle vie di trasduzione del segnale. Un assortimento di molecole intracellulari transduces questi ingressi conseguente alterata espressione genica, divisione, e / o la forma di una cellula. Mentre molte delle molecole chiave utilizzati ai livelli extracellulari e intracellulari nelle principali vie sononoto, è una conoscenza incompleta dovuto in gran parte alla complessità delle vie di segnalazione individuali. Inoltre, diverse vie di segnalazione spesso interagiscono tra loro positivamente o negativamente al extracellulare, intracellulare e livelli trascrizionali ^{3, 4, 5, 6.} È importante sottolineare che i componenti di base delle vie di trasduzione del segnale sono altamente conservati in tutte le specie metazoi, e, straordinariamente, la maggior parte delle vie di segnalazione spesso svolgono funzioni di sviluppo simili in molte specie quando si confrontano gli organismi da phyla strettamente correlati, in particolare ^{7, 8, 9, 10, 11.}

Lo studio di segnalazione durante lo sviluppo è un compito arduo in qualsiasi organismo, e cisono diverse sfide significative per studiare percorsi di segnalazione nella maggior parte dei modelli deuterostomi (vertebrati, cordati invertebrati, hemichordata, ed echinodermi): 1) Nei vertebrati ci sono un gran numero di possibili ligando e recettore / co-modulatore, molecole di trasduzione intracellulare, così come potenziali interazioni tra diverse vie di segnalazione a causa della complessità del genoma ^{12, 13, 14;} 2) La morfologia complessa e movimenti morfogenetici nei vertebrati spesso rendono più difficile interpretare le interazioni funzionali e tra le vie di trasduzione del segnale; 3) Analisi in maggior parte delle specie modello invertebrato deuterostomi non echinoderma sono limitate da brevi finestre gravidity con l'eccezione di alcune specie tunicate ^{15, 16.}

Ilriccio di mare embrione ha alcune delle limitazioni di cui sopra ed offre molte qualità uniche per l'esecuzione di un'analisi dettagliata delle vie di trasduzione del segnale in vivo. Questi sono i seguenti: 1) La relativa semplicità del genoma riccio riduce significativamente il numero di possibili ligando, recettore / co-recettore e molecola di trasduzione intracellulare interazioni ^17; 2) I GRN che controllano la specifica e patterning degli strati germinali e le principali assi embrionali sono ben stabiliti in embrioni di riccio di mare, aiutando la comprensione del contesto normativo della cella / territorio, che riceve i segnali ^{18, 19;} 3) Molti vie di trasduzione del segnale possono essere studiati tra gli stadi scissione e gastrula quando gli embrioni sono costituiti da un singolo strato dell'epitelio la cui morfologia è più facile da analizzare; 4) Le molecole comportanod in vie di segnalazione nei ricci di mare sono facilmente manipolati; 5) Molti ricci di mare sono gravide per 10 a 11 mesi l'anno (ad esempio Strongylocentrotus purpuratus e Lytechinus variegatus).

Qui, vi presentiamo un metodo per caratterizzare in modo sistematico ed efficiente componenti delle vie di segnalazione che specificano e territori del modello negli embrioni di riccio di mare per illustrare i vantaggi che diversi sistemi modello invertebrati offrono nello studio dei meccanismi molecolari complessi.

Protocollo

1. Strategia High Throughput Morpholino design

1. Identificare un gene (s) di interesse (ad esempio, candidato approccio del gene, l'analisi cis-normativo, RNA-Seq e / o schermi differenziali proteomica).
2. Utilizzare genomica, trascrittomica, e dati di espressione genica disponibili sui siti web aggiornati di frequente (ad es SpBase http://www.echinobase.org ²⁰ e S. purpuratus Genome Ricerca http: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html) per determinare il profilo di espressione spazio-temporale si sovrappone con il meccanismo di sviluppo in questione. Se non ci sono dati di espressione è disponibile, quindi generare primer qPCR e / o un antisenso sonda situ per valutare il pattern di espressione genica.
3. Dopo aver determinato il pattern di espressione spaziale e temporale, ottenere la sequenza del DNA dai siti web genomici.
   1. Per la generazione di oligonucleotidi morfolino traduzione di blocco, è necessario ottenere la sequenza of la 'regione non tradotti (5' 5 UTR) direttamente a monte del codone iniziazione da expressed sequence tag (EST) banche dati disponibili sul SpBase o S. purpuratus Genome di ricerca siti web. Se questa informazione non è disponibile per il gene di interesse, quindi eseguire 5 'RACE.
   2. Per progettare un morfolino giunzione di blocco, la ricerca della sequenza genomica compresi gli esoni e introni utilizzando lo strumento patibolo BLASTN in SpBase o S. purpuratus Genome strumento di ricerca.
4. Utilizzare il sito oligonucleotide progettazione http://oligodesign.gene-tools.com al fine di progettare la base di 25 sequenza di coppia morfolino desiderato.
   1. Per un morfolino traslazionale-blocco, utilizzare la sequenza di mRNA da 5 'a 3' come sorgente di traslazione sequenza bersaglio. Includere il 5 'UTR sequenze (circa 70 nucleotidi a monte del sito di inizio della trascrizione) più 25 basi di regione codificante (a valle del sito di inizio) con l'inizio codone marcato wiesima parentesi (ATG).
   2. Per un morfolino giunzione di blocco, selezionare introne-esone o esone-introne sequenza di confine e comprendono 50 basi (25 basi della sequenza dell'esone e 25 basi di sequenze introne) attorno alle regioni di confine. Scansione genoma con la sequenza morfolino per verificare che la sequenza è unica.

2. Microiniezione di oligonucleotidi Morpholino

1. Preparare 3 soluzioni madre mm di oligonucleotidi morfolino con l'aggiunta di 100 ml di acqua priva di nucleasi nel morfolino flacone 300 nmol.
   NOTA: Non usare acqua trattata DEPC per la risospensione perché dietilpirocarbonato può danneggiare il morfolino.
2. Per la prima rotazione ricostituzione lungo il flaconcino contenente la soluzione di riserva oligonucleotide per 30 s alla massima velocità (14.000 - 16.000 xg), vortex brevemente, il calore a 65 ° C per 5 a 10 minuti, vortex brevemente, e mantenere lo stock morfolino in camera temperatura per almeno 1 h. Soluzione morfolino s vengono memorizzati da -20 ° C a + 4 ° C.
3. Preparare la soluzione iniettabile contenente oligonucleotidi morfolino alla concentrazione desiderata. Questa soluzione di solito contiene il 20% di glicerolo o 125 mm KCl come vettore e il 15% FITC-destrano (fluoresceina isotiocianato destrano 10.000 MW 2,5 mg / ml di soluzione). FITC-destrano e altri coniugati destrano fluorescenti sono abitualmente utilizzati per identificare gli embrioni iniettati mediante microscopia in epifluorescenza. Le soluzioni di iniezione conservare a -20 ° C.
4. Riscaldare la soluzione morfolino a 65 ° C in un blocco di calore oa bagnomaria per almeno 2 - 5 min.
5. Brevemente girare la soluzione morfolino per 30 s alla massima velocità (14.000 - 16.000 xg), vortex per 1 minuto e centrifugare a massima velocità (14.000 - 16.000 xg) per almeno 10 minuti.
6. Caricare i aghi da iniezione con la soluzione morfolino. Per una dettagliata protocollo microiniezione vedere Stepicheva e Song 2014 ²¹ e applausi e Ettensohn 2004"> 22.

3. Fissazione e in situ protocollo a 24 ore post-fecondazione (HPF) a S. purpuratus Embrioni

NOTA: Questo protocollo viene modificato da Arenas-Mena et al. 2000 ²³ e Sethi et al. 2014 ^24.

1. Fissazione
   1. Aggiungere qualche goccia di fissativo (vedi sotto) per pozzetti contenenti gli embrioni, mescolare delicatamente pipettando, e permettere loro di stabilirsi. Rimuovere la soluzione fissativo, e poi mescolare gli embrioni con due ulteriori lavaggi 180 ml di fissativo.
      NOTA: È importante omogeneizzare gli embrioni durante i lavaggi di dolce pipettando su e giù diverse volte. In caso contrario si può abbassare il rapporto segnale-rumore.
   2. Lasciare gli embrioni di fissare nella secondo lavaggio fissativo per 50 minuti a 1 ora a temperatura ambiente (RT) in 4% paraformaldeide microscopia elettronica grade costituito da 10 mM MOPS pH 7,0, 0,1% Tween-20, ed artificiale seawater (ASW). Rendere questa soluzione fresca ogni volta per ottenere i migliori risultati. Inoltre, per la facilità e praticità embrioni sono fissati in piastre da 96 pozzetti.
      1. Per 20 mL uso fissativo 5 ml 16% paraformaldeide, 15 mL ASW, 200 ml 1 M MOPS pH 7,0, e 20 ml di Tween-20.
   3. Lavare 5 volte a RT con 180 ml di MOPS lavare tampone costituito da 0,1 M MOPS pH 7,0, 0,5 M NaCl e 0,1% Tween-20 per almeno 5 minuti o fino embrioni cadere sul fondo del pozzo. Anche in questo caso, è importante mescolare bene gli embrioni nel tampone di lavaggio pipettando gentilmente su e giù parecchie volte. Il tampone di lavaggio MOPS può essere utilizzato per 2 giorni se conservato a 4 ° C.
      1. Per 40 mL MOPS lavano uso di buffer da 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml 5 M di NaCl, 32 mL dH ₂ O, e 40 ml di Tween-20.
      2. Embrioni fissi possono essere conservati a 4 ^° C per 2 giorni.
         NOTA: Se la memorizzazione di embrioni fisse più, quindi aggiungere lo 0,2% di sodio azide in MOPS tampone di lavaggio per prevenire la crescita batterica.
2. Pre-ibridazione
   1. Aspirare il MOPS tampone di lavaggio e aggiungere 180 ml di un rapporto di 2: 1 di MOPS tampone di lavaggio in tampone di ibridazione, mescolare embrioni nella soluzione delicatamente pipettaggio più volte, e incubare per almeno 20 minuti a temperatura ambiente. tampone di ibridazione consiste di 70% formammide, 0,1 M pH 7,0 MOPS, 0,5 M NaCl, 1 mg / ml BSA e 0,1% Tween-20.
      1. Per 40 mL uso tampone di ibridazione 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml 5 M di NaCl, 4 mL dH ₂ O, 0,04 g BSA, e 40 ml di Tween-20. Mescolare bene nel vortex, aggiungere 28 ml di formammide, e vortex di nuovo.
   2. Rimuovere il rapporto 2: 1 di MOPS lavare e buffer di ibridazione e aggiungere 180 ml di un rapporto 1: 2 del MOPS tampone di lavaggio in tampone di ibridazione, mescolare embrioni nella soluzione, e incubare per almeno 20 minuti a temperatura ambiente.
   3. Prima sonda di ibridazione mescolare delicatamente embrioni in 100 - 150 ml di buffer di ibridazione. Incubare embrioni a 50 ° C per almeno 1h.
      NOTA: incubazione degli embrioni durante la notte è accettabile. Prima di incubazione, sigillare i pozzetti con un foglio adesivo per evitare l'evaporazione.
3. ibridazione
   1. In un tubo separato aggiungere 0,1-0,3 ng / ml di sonda e 500 mg / ml di lievito tRNA in tampone di ibridazione, quindi vortice delicatamente per creare soluzione della sonda. tRNA lievito viene aggiunto alla soluzione della sonda di diminuire legame della sonda anti-senso non specifico. Riscaldare questa soluzione a 50 ° C, e il buffer aspirare ibridazione.
   2. Mix embrioni pre-ibridizzati in 100 microlitri della soluzione della sonda, sigillare con un foglio adesivo, e ibridano a 50 ° C per 2 a 7 giorni a seconda della sonda (sonda foxq2 può essere incubato per 2 giorni).
      NOTA: i tempi di incubazione possono variare in base al largo della sonda. Alcuni geni espressi a livelli bassi richiedono fino a un'incubazione di 7 giorni. piastre a 96 pozzetti possono essere collocati in una scatola di umidità come assicurazione contro l'evaporazione se i ADHESScheda ive non riesce a sigillare correttamente.
   3. Lavare 5 volte a 50 ° C con 180 ml di MOPS appena fatto il tampone di lavaggio per un totale di 3 ore. Poi, lavare 3 volte (15 min) con 180 ml di MOPS tampone di lavaggio a temperatura ambiente. Ricordarsi di mescolare gli embrioni nel tampone di lavaggio ogni volta pipettando delicatamente più volte.
4. incubazione
   1. Aspirare il MOPS tampone di lavaggio e mescolare gli embrioni in 180 ml di tampone di bloccaggio composto da 10% di siero di pecora normale e 5 mg / ml di BSA in MOPS tampone di lavaggio e incubare per almeno 45 minuti a temperatura ambiente o 4 ° C durante la notte.
   2. Rimuovere tampone di bloccaggio e poi mescolare gli embrioni in tampone di bloccaggio contenente una diluizione 1: 1.500 del alcalina anticorpo anti-digossigenina fosfatasi coniugato diluito in tampone di bloccaggio. Incubare per una notte a temperatura ambiente in un piatto sigillato per evitare l'evaporazione. NOTA: Non lasciare anticorpo in più di una notte.
   3. Lavare gli embrioni 6 volte (5 minuti o fino a quando gli embrioni drop) in MOPS tampone di lavaggio a temperatura ambiente. embrioni possonomemorizzare notte a 4 ° C.
5. Nello sviluppo situ
   1. Lavare embrioni 3 volte (10 min) a temperatura ambiente con fresco tampone a pH 9.5 comprensivi di 0,1 M Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl _2, 1 mM Levamisolo, e 0,1% Tween-20.
      1. Per 20 mL pH 9.5 utilizzo del buffer 2 ml 1 M Tris pH 9.5, 400 ml 5M NaCl, 1 ml di 1 M MgCl _2, 20 microlitri Tween-20, 16,6 mL dH ₂ O, e 0,0048 g Levamisolo.
   2. Incubare embrioni a 37 ° C in tampone colorazione riparo dalla luce. tampone colorazione consiste di 10% dimetilformammide, 4,5 microlitri / ml 4-nitro blu tetrazolio cloruro (NBT), e 3,5 microlitri / ml 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) in appena fatta pH 9,5 tampone .
      1. Per 1 ml di tampone colorazione utilizzare il 100 microlitri dimetilformamide, 4,5 ml NBT, e 3,5 microlitri BCIP.
   3. Arrestare la reazione della fosfatasi alcalina lavando 3 a 5 volte in MOPS tampone di lavaggio. La connessione wi reazioneesimo la sonda foxq2 richiede in genere 30 minuti a 1 ora. Alcune sonde possono avere bisogno di incubazione durante la notte sia a RT o 4 ° C.
   4. Mescolare embrioni in una soluzione di 70% di lavaggio MOPS e 30% glicerolo. Il glicerolo fornisce un indice di rifrazione necessaria per microscopia. Gli embrioni possono essere memorizzati in questa soluzione per diverse settimane. Sigillare le piastre con paraffina di plastica per evitare l'evaporazione.
6. Preparazione del vetrino e la cattura di immagini
   1. Preparare un vetrino organizzando tre piccole strisce di nastro biadesivo in un triangolo con piccoli spazi tra le strisce su un vetrino.
   2. Trasferire gli embrioni nel lavaggio MOPS 70% e soluzione di glicerolo 30% al centro del triangolo e coprire con coprioggetto.
   3. Sigillare il vetrino mediante l'applicazione di uno strato di smalto intorno ai bordi del vetrino.
   4. Catturare immagini utilizzando un microscopio ottico composto con un obiettivo 20X e una fotocamera collegata.

Risultati

Nell'embrione riccio di mare abbiamo dimostrato che 3 diverse di segnalazione Wnt rami (Wnt / β-catenina, Wnt / JNK, e Wnt / PKC) ^{4, 25} interagiscono per formare una rete di segnalazione Wnt che governa antero-posteriore (AP) patterning. Una delle più importanti conseguenze di questi eventi di segnalazione è che il ampiamente espresso anteriore neuroectoderma (ANE) GRN iniziale diventa limitato ad un piccolo territorio att...

Discussione

La metodologia qui presentata è un esempio che illustra il potere di usare embrioni con una minore complessità genomica e morfologica di vertebrati per capire le vie di segnalazione di trasduzione e GRN regolano meccanismi di sviluppo fondamentali .. Molti laboratori stanno utilizzando dosaggi simili durante lo sviluppo precoce riccio di mare a sezionare il coinvolti in percorsi di altri eventi di specifica destino della cellula di segnalazione (ad esempio Notch, Riccio, TGF-β, e la segnalazione FGF)

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino	Gene Tools LLC	Customized	More information at www.gene-tools.com
Glycerol	Invitrogen	15514-011
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate)	Invitrogen, Life Technologies	D1821	Make 25 mg/mL stock solution
Paraformaldehyde 16% solution EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15710
MOPS	Sigma Aldrich	M1254-250G
Tween-20	Sigma Aldrich	23336-0010
Formamide	Sigma Aldrich	47671-1L-F
Yeast tRNA	Invitrogen	15401-029
Normal Goat Serum	Sigma Aldrich	G9023-10mL
Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody	Roche	11 093 274 910
Tetramisole hydrochloride (levamisole)	Sigma Aldrich	L9756-5G
Tris Base UltraPure	Research Products Internationall Corp	56-40-6
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate	Roche	11 383 221 001
4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT)	Roche	11 383 213 001
Dimethyl Formamide	Sigma Aldrich	D4551-500mL
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541-5KG
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761-500G
Magnesium Sulfate	Sigma Aldrich	M7506-2KG
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C1016-500G