Metodo per visualizzare e analizzare membrana proteine ​​interagenti con microscopia elettronica a trasmissione

Riepilogo

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Abstract

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca²⁺-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Introduzione

Nella ricerca medica, molta attenzione è focalizzata sulle proteine ​​di membrana, sia intrinseci o estrinseci, coinvolti in una varietà di interazioni lipidi. Utilizzo di proteine lipidi interagenti comprende sia selezionando un sostituto dei lipidi, quali detergenti, amphipols ¹ o piccole proteine ^2, o trovare un sostituto membrana che mantiene la proteina solubile ed attiva. Sostituti membrana lipoico includono liposomi e nanodiscs (ND) ^{3, 4.}

Nanodiscs sono piattaforme membrana vicino native sviluppate progettando la parte proteica, ApoA-1, della lipoproteina ad alta densità (HDL) naturalmente nel sangue. ApoA-1 è un residuo di 243-lunga catena di brevi anfipatiche alfa-eliche e presenta una conformazione solubile privo di lipidi. In vitro quando in presenza di lipidi, due copie della proteina ApoA-1 spontaneamente riorganizzano per circondare il hydrophobic porzione catena acilica di un doppio strato lipidico cerotto ^5. versioni Engineered di ApoA-1 sono generalmente chiamati ponteggi proteine ​​di membrana (MSP), e un numero crescente sono disponibili in commercio come plasmidi o proteine ​​purificate. Ripetizioni o cancellazioni delle alfa-eliche in ApoA-1 risultato in più ⁶ o più brevi ponteggi proteine di membrana ^7. Questo a sua volta rende possibile l'ottenimento di dischi circa 6 nm ⁷ a 17 nm ⁸ di diametro. Ci sono diversi tipi di applicazioni per il nanodiscs ^{3, 9.} L'applicazione più comunemente usato è quello di fornire un ambiente membrana quasi nativa per la stabilizzazione di una proteina integrale di membrana ^8, recensito in precedenza ^{3, 9.} Un uso meno esplorato è quello di realizzare una superficie di membrana nanoscala per lo studioperiferica di membrana proteine ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17.} Sezione 1 del protocollo di sotto visualizza la procedura relativa alle nanodiscs composte da fosfolipidi e proteine ​​di membrana impalcature.

La preparazione del campione è un collo di bottiglia nella maggior parte dei metodi. campioni specifici del metodo può aggiungere informazioni particolari, ma anche fare i confronti dei risultati difficili. Pertanto, è più semplice quando i campioni sono multimodale e possono essere utilizzati direttamente in diversi metodi. Un vantaggio con l'uso di nanodiscs è la piccola dimensione del nanodisc rispetto ai liposomi (ad esempio, i campioni possono essere utilizzati direttamente per entrambi TEM e non denaturante gel elettroforesi, come nel presente protocollo).

vescicole e liposomi sono da tempo utilizzati per comprendere la funzione delle proteine ​​di membrana interagenti. Per gli studi strutturali e visualizzazione, un esempio della determinazione strutturale di una proteina transmembrana in liposomi è disponibile ^18. Tuttavia, nessuna struttura 3D ad alta risoluzione di una proteina di membrana monotopic incorporato in una membrana liposomiale è stato ancora pubblicata, per quanto ne sappiamo. Nanoparticelle d'oro o anticorpi possono essere utilizzati per visualizzare proteine leganti di liposomi o vescicole usando TEM ^19. Anche se queste sonde sono molto specifici, potrebbero interferire con proteine ​​di membrana vincolante velando il sito di legame della membrana o mascherando le aree di interesse con le parti flessibili. Gold-etichettato o proteine ​​anticorpi complessato potrebbe probabilmente essere analizzati su un gel, ma ciò aumenterebbe il costo dell'esperimento.

Anche se liposomi sono un'eccellente piattaforma, non si può essere certi che il poplamento ha un rapporto particolare di proteine per liposoma, una caratteristica che può essere esplorato con l'uso di nanodiscs ^20. In un liposoma, cofattori e substrati possono essere intrappolati all'interno solubile. Le sostanze che sono membrana-solubili condivideranno lo stesso destino per entrambi i tipi di mimetici di membrana. Tuttavia, come la zona doppio strato è più piccola in nanodiscs, una minore quantità di sostanza è necessaria per saturare le membrane nanodisc.

proteina funzione intesa attraverso la determinazione della struttura atomica è essenziale per molti campi di ricerca. Metodi per la determinazione della struttura proteica comprendono raggi X ^21; risonanza magnetica nucleare (NMR) ^{22, 23;} e microscopia elettronica a trasmissione (TEM) ²⁴ a temperature criogeniche, cryoEM. La risoluzione cryoEM ultimamente è stata notevolmente migliorata, principalmente per l'uso di elettroni de direttatectors ^{25, 26.} Le macromolecole vengono esposte in un sottile, ghiaccio vitreo ²⁷ in uno stato quasi native. Tuttavia, a causa del basso contrasto di molecole biologiche, diventano difficili da individuare nella gamma di dimensioni 100 - 200 kDa. Per i campioni di dimensioni opportune, raccolta dei dati può essere fatta e il metodo di ricostruzione singola particella può essere applicato per ottenere una struttura ^28.

Tuttavia, la determinazione della struttura delle proteine ​​mediante TEM è un processo a più fasi. Di solito inizia con la valutazione di monodispersity campione negativo-macchia TEM ²⁹ con sali di metalli pesanti come phosphotungsten (PT) ^{30 31} o uranio. Ricostruzione di un modello a bassa risoluzione della macromolecola macchiato negativamente è di solito fatta e può fornire informazioni importanti sulla struttura molecolare ^29. In parallelo,la raccolta dei dati utilizzando cryoEM può iniziare. Si deve prestare attenzione quando si valutano i dati TEM negativo-macchia per evitare l'errata interpretazione di formazione manufatto. Un particolare manufatto è l'effetto della macchia PT su fosfolipidi e liposomi ^32, con conseguente formazione di lunghe aste somiglianti pile di monete viste dal lato ^33. Tale "rouleau" o "stack" (di seguito indicato come "stack") sono stati osservati nella fase iniziale per HDL ^34, e più tardi anche per nanodiscs ^35.

L'accatastamento e rimodellamento delle membrane possono verificarsi per molte ragioni. Ad esempio, può essere indotta da cofattori come il rame, mostrate da immagini TEM in ammonio molibdato macchia ^36. Una frazione dei lipidi di membrana in liposomi conteneva un gruppo di testa di acido iminodiacetico imitando metallo complessazione da EDTA, impilamento così liposomi dopo l'aggiunta di ioni rame 36. Stacking potrebbe anche essere dovuto ad una interazione proteina-proteina mediante una proteina nei o sui doppi strati lipidici (la macchia utilizzato non è menzionato) ^37. La formazione pila di fosfolipidi da PT è stato osservato nella fase iniziale; Tuttavia, il lavoro in seguito si è concentrata sulla rimozione o abolire questa formazione artefatto ^38.

Qui, vi proponiamo un metodo per sfruttare la nanodisc NAPT indotto accatastamento per lo studio delle proteine ​​di membrana-binding da TEM. In breve, vincolante per le proteine ​​nanodiscs impedirebbe i nanodiscs da accatastamento. Sebbene le ragioni per l'impilamento non sono chiari, è stato proposto ³⁹ che vi è una interazione elettrostatica tra i fosfolipidi e il gruppo fosforile di PT, causando i dischi di aderire l'uno all'altro (Figura 1A). L'ipotesi dietro il nostro protocollo è che quando una proteina si lega ad un nanodisc, la maggior parte della superficie fosfolipide non è dispo BLE per l'interazione con il terminale a causa dell'impedimento sterico dalla proteina. Ciò impedisce la formazione di stack (Figura 1B). Due conclusioni possono essere tratte. In primo luogo, la prevenzione di impilamento significa che la proteina di interesse è legato alla membrana. In secondo luogo, il complesso proteina-ND può essere trattato con metodi di lavorazione singola particella standard di ^{24, 40} per ottenere una morfologia ruvida del complesso. Inoltre, le analisi con metodi come non-denaturazione elettroforesi su gel o dispersione della luce dinamica può essere eseguita.

Per dimostrare questa ipotesi, abbiamo utilizzato la proteina di membrana-binding 5-lipossigenasi (5LO), che è coinvolto in molte malattie infiammatorie ^{41, 42.} Questa proteina 78-kDa richiede ioni di calcio di legarsi alla sua membrana ^43. Anche se questa associazione membrana è stata ampiamente studiata utilizzando liposomis = "xref"> ^{44, 45, 46} e frazioni di membrana ^47, questi non possono essere utilizzati per l'analisi TEM e determinazione della struttura.

La preparazione di nanodiscs inizia MSP con lipidi risospese nel colato di sodio detergente miscelazione. Dopo incubazione in ghiaccio per 1 h, il detersivo viene lentamente rimosso dalla miscela ricostituzione con una resina adsorbente. Questo tipo di materiale è spesso realizzato in polistirene forma in piccole perline. Essi sono relativamente idrofobo e hanno una forte preferenza per il detersivo vincolante rispetto ai lipidi ^48. Dopo aver rimosso le perline idrofobiche e l'esecuzione di un chiarimento mediante centrifugazione, i nanodiscs sono purificati mediante cromatografia dimensione esclusione (SEC). I nanodiscs purificati vengono miscelati con una proteina di membrana monotopic (ed eventuali cofattori) in rapporto equimolare (o più rapporti per una titolazione) e sono lasciate rEACT (15 min). Analisi mediante TEM viene effettuata applicando microlitri-quantità di campione attraverso, griglie di carbonio rivestiti bagliore scarica e poi effettuando colorazione negativa con NAPT. Lo stesso campione da cui le aliquote sono state applicate alle griglie TEM può essere utilizzato per l'analisi non-denaturazione o SDS PAGE gel elettroforesi, nonché da vari tipi di misure di attività, con grandi cambiamenti.

Protocollo

1. Preparazione di Nanodiscs

1. Espressione e purificazione della proteina di membrana ponteggio ^{8, 35}
   1. Esprimere il MSP1E3D1 His-tag nel E. coli BL21 (DE3) ceppo T1R pRARE2 in fiaschi. Preparare una coltura starter durante la notte da 50 ml con terreno LB integrato con 50 mg / ml kanamicina a 37 ° C. Diluire la coltura starter durante la notte in 2 litri di brodo di medio formidabile integrato con 50 mg / ml kanamicina.
   2. Crescere le cellule a 37 ° C fino a quando la densità ottica a 600 nm (OD ₆₀₀₎ raggiunge circa 3. indurre l'espressione di proteine con 0,5 mM isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) per 3 ore a 18 ° C.
   3. Preparare il tampone di lisi (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl e 10% glicerolo). Aggiungere 1 mM TCEP immediatamente prima dell'uso.
   4. Dopo 3 h di induzione a 18 ° C, raccogliere le cellule per centrifugazione per 10 min a 4500 xge 4 ° C. Eliminare il supernatante, pesare le cellule raccolte, e risospendere in tampone di lisi con un rapporto di 2 ml di tampone di lisi per g di cellule.
   5. Lyse le cellule mediante ultrasuoni pulsato (frequenza di ripetizione: 4 s ON, 4 s OFF) per 3 minuti a 80% di ampiezza.
   6. Centrifugare i lisati per 20 min a 49.000 xg e 4 ° C. Eliminare il pellet da questo centrifugazione.
   7. Iniettare il surnatante in 5 mL Ni ⁺ colonna chelante collegato ad un sistema di cromatografia liquida automatizzato preferibilmente mantenuto a 4 ° C.
   8. Prima della fase di eluizione (fase 1.1.9), lavare la colonna con tamponi 1 - 3 di seguito per rimuovere tutte le proteine ​​tranne il His-tag MSP. Monitorare il contenuto proteico a 280 nm per seguire il processo di purificazione; la registrazione UV a 280 nm dovrebbe tornare ai valori basali dopo ogni lavaggio.
      1. Lavare con tampone di lavaggio 1: 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolo, e l'1% Triton, pH 8,0.
      2. Lavare con tampone di lavaggio 2: 40 mM Tris-HCl, 300 mmNaCl, 20 mM imidazolo, e 50 mM sodio colato, pH 8,0.
      3. Lavare con tampone di lavaggio 3: 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 50 mM imidazolo, pH 8,0.
   9. Eluire il MSP con 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, e 500 mm imidazolo, pH 8,0.
   10. Cambiare il buffer a MSP tampone standard (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl e 0,5 mM EDTA) mediante gel filtrazione ^{8, 35;} la resa per lotto dovrebbe essere intorno a 7 mg ^L-1.
2. Preparazione della soluzione madre fosfolipidi
   1. Aggiungere 305 ml di 1-palmitoil-2-oleoyl- sn -glycero-3-fosfocolina (POPC) sciolto in cloroformio a una concentrazione di 25 mg / mL in un bicchiere di vetro e si evapora il cloroformio eliminandola con una leggera corrente di azoto . Essiccare la notte lipide in un essiccatore sotto vuoto. NOTA: Questo passaggio viene eseguita per rimuovere il solvente dal lipide, che lascia una sottile pellicola di lipidi sul fondo del bicchiere di vetro.
   2. Risospendere la torta di lipidi in 200 ml di MSP tampone standard contenente 100 mM sodio colato vortex il tubo fino a quando la soluzione diventa trasparente; questo fornirà una soluzione con una concentrazione di 50 mM POPC.
      NOTA: In generale, il rapporto molare di lipidi di detersivo a questo punto dovrebbe essere 1: 2 (lipidi: detergente) ^8. Questa miscela lipidica detergente può essere conservato a -80 ° C per circa 2 mesi.
3. Preparazione di perline idrofobici per la rimozione del detersivo
   1. Porre 5 g di perline (peso secco) in una provetta da 50 ml.
   2. Lavare le perline con 30 mL di metanolo 100% e poi con 40 ml di acqua ultrapura.
   3. Lavare le perline con 10 ml di MSP tampone standard. Infine, memorizzare le perline con 15 mL di tampone standard PSM a 4 ° C.
4. Nanodisc ricostituzione
   1. Dispensare 190 ml di MSP1E3D1 (0,124 mM) in una provetta per microcentrifuga e aggiungere 61,5 ml di soluzione madre fosfolipidi (50 mm POPC) al tubo stesso. Incubare la miscela ricostituzione in ghiaccio per 1 ora. NOTA: Questo corrisponde ad un rapporto molare di 1: 130 (MSP1E3D1: POPC).
   2. Aggiungere perline idrofobi ad una concentrazione di 0,5 g di perline per ml di miscela ricostituzione di avviare il processo di auto-assemblaggio. Incubare in un incubatore rotativo per 16 ore a 4 ° C.
   3. Dopo incubazione, centrifugare per 10 min a 13.000 xg e 4 ° C per rimuovere i precipitati ed aggregati. Eliminare il pellet e salvare il surnatante.
   4. Equilibrare la colonna cromatografia ad esclusione sterica (montato su un sistema di cromatografia liquida automatizzato) con tampone standard MSP finché l'assorbanza a 280 nm è stabile. Iniettare il surnatante nella colonna e raccogliere le frazioni di picco.
   5. Misurare le concentrazioni di nanodiscs nelle frazioni di picco a 280 nm. Utilizzare il coefficiente di estinzione molare MSP1E3D1 (e = 29,91 mila centimetri ^-1 M ^-1) per il calcolo della concentrazione nanodisc. Notare lanumero di lipidi per nanodisc può essere misurata con una combinazione di lipidi radiomarcati e analisi dei fosfati ⁴ o mediante analisi fosfato sola.

2. Preparazione del Protein Monotopic 5 lipossigenasi ³⁵

1. Preparare una coltura starter durante la notte. Supplemento 50 ml di terreno LB con 100 mg / ml ampicillina. Seminare il terreno con E. coli BL21 (DE3) contenente il plasmide del gene 5-lipossigenasi (ALOX5). Diluire la coltura starter durante la notte in mezzo di espressione contenente 42 mM Na ₂ HPO _4, 24 mm KH ₂ PO _4, 9 mm NaCl, 19 mM NH ₄ Cl, 1 mM MgSO _4, 0.1 mM CaCl _2, 0,2% D-glucosio, 0,1 %, 5 mM FeSO _4, e 100 mg / ml di ampicillina. Crescere le cellule fino a quando la OD ₆₀₀ è ~ 0,5 a 25 ° C. Indurre l'espressione di proteine con 0,2 mM IPTG per 16 ore a 20 ° C ^35.
2. Harvest per centrifugazione per 10 min a 7000 xg e 4 ° C e scartare il surnatante. Pesare il pellet nella parte inferiore del tubo contenente le cellule raccolte e risospendere le cellule raccolte in tampone di lisi (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10% glicerolo e 1 mM TCEP) contenente inibitori delle proteasi e 0,5 mg / mL ³⁵ lisozima in un rapporto di 2 ml di tampone di lisi per g di cellule.
3. Lisare le cellule mediante sonicazione per 5 x 15 s a 80% di ampiezza. Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione per 10 min a 7000 xg e 4 ° C. Eseguire ammonio solfato precipitazione a 30 - 60% della saturazione per precipitare le proteine nella soluzione ^35. Centrifugare per 15 min a 16.000 xg e 4 ° C. NOTA: Il pellet 5LO può essere rapidamente congelato e conservato a -80 ° C per 6 mesi.
4. Risospendere il pellet con 20 ml di tampone di lisi e centrifugare per 15 min a 40.000 xg e 4 ° C.
5. Incubare il surnatante su una colonna di agarosio ATP a 4 ° C per 30 min. Lavare la colonna una volta con una colonna volumi di tampone di lisi contenente 0,5 M NaCl. Eluire il 5LO con 20 mM ATP in tampone di lisi contenente 10 mM FeSO ₄ e 20 mg / mL catalasi. Eseguire cromatografia su gel filtrazione per rimuovere ATP ^35.
   NOTA: Il 5LO è instabile e deve essere utilizzato immediatamente dopo la depurazione. Altrimenti, si raccomanda di fermare nella fase di solfato di ammonio precipitazioni (vedi la nota dopo passo 2.1.3).

3. Preparazione del complesso Nanodisc-proteina

1. Preparare un volume totale di 100 ml di complesso. Mescolare 0,8 mM ND e 0,8 mM 5LO con 1 mM Ca ²⁺ presente nel tampone standard MSP (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl; 0,5 mM EDTA e 1,5 mM CaCl ₂₎ e incubare per 10 min sul ghiaccio. NOTA: Il campione può essere conservato per un massimo di un mese a 4 ° C ^35.

ove_title "> 4. analisi dei campioni

1. elettroforesi su gel
   1. Non-denaturazione elettroforesi
      1. Mescolare 15 ml di campione con 5 ml di tampone di caricamento (50 mM BisTris, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w / v) di glicerolo, e 0,001% Ponceau S, pH 7,2) ⁴⁹ e caricarlo su 4 - 16% gel Bis-Tris per eseguire l'elettroforesi.
      2. Riempire il serbatoio catodo con tampone luce catodo (50 mM Bis Tris; 50 mM Tricine, pH 6,8, e 0,002% Coomassie G-250) e il serbatoio anodo con tampone di corsa (50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6,8). Avviare la separazione con una tensione costante a 150 V.
      3. Arrestare la separazione elettroforetica quando il fronte Coomassie raggiunge la fine del gel.
      4. Colorare il gel con un protocollo standard blu Coomassie.
   2. denaturazione elettroforesi
      1. Mescolare 40 ml di campione con 10 ml di tampone di caricamento contenente SDS (0,05% (w / v) blu di bromofenolo, 0,2 M Tris-HCl,pH 6.8; 20% (v / v) di glicerolo; 10% (w / v) di SDS; e 10 mM 2-mercaptoetanolo) e caricarlo su un 4 - gel glicina 20% Tris eseguire elettroforesi.
      2. Riempire i serbatoi catodo e anodo con tampone di corsa (25 mM Tris-HCl, pH 6,8; 200 mM glicina, e 0,1% (w / v) di SDS). Avviare la separazione con una tensione costante a 150 V.
      3. Arrestare la separazione elettroforetica quando la carica frontale colorante raggiunge la fine del gel.
      4. Colorare il gel con un protocollo standard blu Coomassie.
2. Preparazione della soluzione NAPT
   1. Sciogliere 1 g di sale sodico fosfotungstato in 50 mL di acqua mediante agitazione a temperatura ambiente per dare un 2% (w / v) soluzione acida.
   2. Regolare il pH a 7,4 con 1 M NaOH. Rimuovere le particelle utilizzando un filtro a siringa da 0,22 micron. Conservare la soluzione a temperatura ambiente oa 4 ° C.
3. Preparazione del campione per analisi TEM
   1. Glow-scarico griglie di rame di carbonio rivestita (400 maglie) per 20 s a 30 mA per rendere le griglie idrofile prima l'adsorbimento del campione. Collocare 3,5 ml di campione (0,8 mM rispetto ai nanodiscs) sulla griglia e incubare per 30 s. NOTA: Il volume applicata può variare tra 2,5 e 5 microlitri, a seconda della concentrazione del campione. Un intervallo di concentrazione adatta per nanodiscs è di 0,5 - 1 micron.
   2. Blot off soluzione in eccesso con carta da filtro.
   3. Subito macchiare la griglia con un calo del 2% NAPT per 30 s. Blot off soluzione in eccesso e lasciare la griglia di aria secca.
   4. Valutare le griglie di TEM. Un microscopio con 120-200 keV tensione di accelerazione sufficiente per valutare il grado di impilamento. NOTA: Per la presente protocollo, un microscopio elettronico a trasmissione calibrato è stato usato, equipaggiato con una pistola ad emissione di campo di 200 keV.
   5. Registrare le immagini TEM. Per le immagini che mostrano lunghe pile, non elaborare ulteriormente; immagini mostrano il complesso di nanodiscs, con proteine ​​estrinseca che può contenere alcunishort stacks, ma la maggior parte delle particelle sono nel complesso. Registrare varie immagini e procedimenti questi secondo i metodi standard per ottenere di classe medie e una a bassa risoluzione, 3 modello tridimensionale del complesso.
      NOTA: per la raccolta di dati negativi-macchia, griglie sono state effettuate in almeno tre giorni diversi. Per ogni giorno, sono state fatte incubazione campione fresco (come nel passaggio 3.1) prima che è stata applicata la macchia negativo.

Risultati

Il metodo proponiamo dipende dalla preparazione di nanodiscs per fornire la superficie della membrana per il legame monotopic membrana proteine. Poiché non esiste una proteina transmembrana integrato nel doppio strato lipidico nanodisc, i nanodiscs sono qui indicati come "nanodiscs vuoti" (Figura 2A). Questi hanno un peso molecolare calcolato di 256 kDa per una composizione di due proteine MSP1E3D1 ponteggi e circa 260 molecole di POPC ^8.

Discussione

Il metodo può essere suddiviso in tre parti: la ricostituzione di nanodiscs vuoti, la preparazione di complessi proteina-nanodisc, e la colorazione negativa per il TEM di questi complessi. Ogni parte sarà affrontata separatamente per quanto riguarda i limiti della tecnica, passaggi critici, e le modifiche utili.

Ricostituzione di nanodiscs vuote. passaggi critici e limitazioni nella produzione e l'uso di nanodiscs.

Per la preparazione dei nanodiscs vuoti, è e...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transmission electron microscope: JEOL2100F	JEOL
CCD camera	Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger	Baltec
TEM grid: 400 mesh	TAAB	GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5	Agilent Technologies	5190-2526
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare Life Sciences	17-5172-01
Plasmid: MSP1E3D1	Addgene	20066
Bacteria: BL21DE3	NEB	C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2	Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose	Sigma Aldrich	A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 mL	GE Healthcare Life Sciences	17-5247-01
Lipid: POPC	Avanti polar lipids	850457C	25 mg/mL in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin	Bio-Rad	1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm	Pall life sciences	PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate	Sigma Aldrich	31648
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Bio-Rad	161-0301
Protease inhibitor cocktail	Sigma Aldrich	4693132001
TCEP	Sigma Aldrich	646547
Detergent: Sodium cholate hydrate	Sigma Aldrich	C6445-10G
Sodium Cholate			500 mM Sodium cholate. Resuspend in miliQ water and store at -20 °C.
Lipid Stock			50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl. Store at 4 °C for a week; or Store -80 °C for a month, after purging the solution with nitrogen.
MSP standard buffer			20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA. Store at 4 °C.
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer	Thermo Fisher Scientific	BN2001	50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer	Thermo Fisher Scientific	BN2002	50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8, 0.002% Coomassie G-250
Non-Denaturaing Electrophoresis 4x Sample loading Buffer	Thermo Fisher Scientific	BN2003	50 mM Bis-Tris, pH 7.2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer			In-house recipe: 25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1% (w/v) SDS
Denaturaing Electrophoresis 5x Sample loading Buffer			In-house recipe: 0.05% (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8, 20% (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS, 10 mM 2-mercaptoethanol
Terrific broth			Tryptone - 12.0 g, Yeast Extract - 24.0 g, 100 mL 0.17 M KH2PO4 and 0.72 M K2HPO4, Glycerol - 4 mL. Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 mL and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium.