3D Stem magnetica cellulare Aggregazione e bioreattore maturazione per la cartilagine Regeneration

Riepilogo

Condrogenesi da cellule staminali richiede la messa a punto delle condizioni di coltura. Qui vi presentiamo un approccio magnetico per condensare le cellule, un passo essenziale per iniziare condrogenesi. Inoltre, mostriamo che la maturazione dinamico in un bioreattore applica stimolazione meccanica ai costrutti cellulari e aumenta la produzione di matrice extracellulare cartilaginea.

Abstract

Ingegneria cartilagine rimane una sfida a causa delle difficoltà nel creare un impianto funzionale in vitro simile al tessuto nativo. Un approccio recentemente esplorato per lo sviluppo delle sostituzioni autologhe comporta la differenziazione delle cellule staminali in condrociti. Per avviare questo condrogenesi, un grado di compattazione delle cellule staminali è richiesta; quindi, abbiamo dimostrato la fattibilità di cellule magneticamente condensazione, sia all'interno scaffold spessi e privo di scaffold, utilizzando miniaturizzati sorgenti di campo magnetico come attrattori cellulari. Questo approccio magnetico è stato utilizzato anche per guidare fusione aggregato e costruire privo di impalcatura, organizzato, tridimensionale (3D) i tessuti diversi millimetri di dimensione. Oltre ad avere una dimensione maggiore, il tessuto formato da fusione magnetica guidato presentato un significativo aumento dell'espressione di collagene II, ed una tendenza simile è stato osservato per l'espressione aggrecan. Come la cartilagine nativa è stato sottoposto a forze tcappello influenzato la sua struttura 3D, la maturazione dinamica è stata effettuata anche. Un bioreattore che fornisce stimoli meccanici stato usato per cultura scaffold magneticamente seminate su un periodo di 21 giorni. Bioreattore maturazione in gran parte migliorato chondrogenesis nelle impalcature cellularized; la matrice extracellulare ottenuto in queste condizioni era ricca di collagene II e aggrecano. Questo lavoro illustra il potenziale innovativo di condensazione magnetica delle cellule staminali etichettati e maturazione dinamica in un bioreattore per una migliore differenziazione condrogenica, sia-impalcatura libero e all'interno polisaccaridi ponteggi.

Introduzione

nanoparticelle magnetiche sono già utilizzati in clinica, come agenti di contrasto per la risonanza magnetica (MRI), e le loro applicazioni terapeutiche tenere in espansione. Ad esempio, è stato recentemente dimostrato che le cellule marcate possono essere manipolati in vivo usando un campo magnetico esterno e possono essere orientati e / o mantenuti in un sito definito di impianto ^{1, 2, 3.} In medicina rigenerativa, possono essere utilizzati per ingegnerizzare tessuti organizzati in vitro ^4, tra tessuto vascolare ^{5, 6, 7, 8} osso, cartilagine e ^9.

La cartilagine articolare è immersa in un ambiente avascolare, le riparazioni dei componenti della matrice extracellulare molto limitati quando si verificano danni. Per questo motivo, research è attualmente focalizzata sulla progettazione di sostituzioni cartilagine ialina che possono essere impiantati nel sito del difetto. Per produrre una sostituzione autologo, alcuni gruppi di ricerca stanno studiando l'utilizzo di condrociti autologhi come fonte cella ^{10, 11,} mentre altri sottolineano la capacità delle cellule staminali mesenchimali (MSC) a differenziarsi in condrociti ^{12, 13.} In studi precedenti ricapitolato qui, abbiamo scelto MSC, come il loro campionamento del midollo osseo è abbastanza semplice e non richiede il sacrificio di condrociti sani, che rischiano di perdere il loro fenotipo ^14.

Un primo passo essenziale per iniziare la differenziazione condrogenica delle cellule staminali è il loro condensazione. Aggregati cellulari sono comunemente formate utilizzando centrifugazione o cultura Micromass ^15; Tuttavia, questi metodi di condensazione Neither presentare il potenziale per creare raggruppamenti cellulari all'interno scaffold spessa né la possibilità di controllare la fusione degli aggregati. In questo documento, si descrive un approccio innovativo alla condensazione cellule staminali utilizzando marcatura magnetica MSC e l'attrazione magnetica. Questa tecnica è stata dimostrata per formare costrutti 3D-free scaffold attraverso la fusione di aggregati tra loro per ottenere un millimetro scala tessuto cartilagineo ^9. semina magnetico di scaffold spessi e grandi ha anche permesso la possibilità di aumentare la dimensione della ingegneria tessutale, realizzazione di una forma più facilmente utile per l'impianto, e diversificare il potenziale per applicazioni cliniche di riparazione della cartilagine. Qui, si dettaglio il protocollo per la semina magnetico di MSC nella scaffold porosi costituiti da polisaccaridi naturali, pullulano, e destrano, scaffold precedentemente utilizzato per confinare cellule staminali ^{16, 17.} differenziazione condrogenico era finally eseguita in un bioreattore per garantire continue dei nutrienti e diffusione del gas nel nucleo matrice degli scaffold seminati con un'alta densità di cellule. Oltre a fornire le sostanze nutrienti, fattori di crescita condrogeniche e gas alle cellule, il bioreattore offerto stimolazione meccanica. Nel complesso, la tecnologia magnetica utilizzata per confinare le cellule staminali, in combinazione con la maturazione dinamica in un bioreattore, può notevolmente migliorare la differenziazione condrogenico.

Protocollo

1. la costruzione dei dispositivi magnetici

NOTA: I dispositivi utilizzati per semina delle cellule variano a seconda dell'applicazione (Figura 1). A formare aggregati, il numero delle cellule è limitato a 2,5 × 10 ⁵ / aggregato, così le punte magnetiche devono essere molto sottili (750 micron di diametro). Seminare i ponteggi 1,8 centimetri ^2/7 mm di spessore, i magneti devono essere più grandi (3 mm di diametro) e garantiranno migrazione cellulare attraverso i pori del ponteggio.

1. Costruzione di un dispositivo a micro-magneti per la formazione di aggregati (Figura 1A)
   1. Rendere microfori con un trapano 0,8 mm mediante piastre di alluminio (3 cm di diametro e spessore 6 mm).
   2. Inserire una punta magnetica (750 micron di diametro) in ogni foro della piastra.
   3. Posizionare questo disco sopra un magnete al neodimio permanente, che garantisce la magnetizzazione di saturazione.
2. Costruzione di un dispositivo per ponteggio semina ( Figura 1B)
   1. Tagliare polistirolo rigido in 2.4 cm ² piazze.
   2. Inserire 9 piccoli magneti (3 mm di diametro, 6 mm di lunghezza) equidistanti su una superficie di 1,6 cm ^_2.
   3. Posizionare il dispositivo nel corso di un magnete al neodimio permanente.

2. Stem Cell Labeling

NOTA: Le cellule staminali sono state marcate con 0,1 mM nanoparticelle magnetiche per 30 min (2,6 ± 0,2 pg ferro / cella) a formare aggregati, mentre erano etichettati con 0,2 mM nanoparticelle magnetiche per 30 min (5 ± 0,4 pg ferro / cella) per seminare impalcature. Queste concentrazioni di nanoparticelle e tempi di incubazione sono stati utilizzati in precedenza e pubblicato per MSC e altre cellule ^{18, 19,} ed è stato determinato che le nanoparticelle influenzato né vitalità cellulare né capacità di differenziazione MSC. La massa ferro incorporata dalle cellule staminali è stato misurato mediante single-cell magnetophoresis ^{19, 20.}

1. Cellule di coltura umane staminali mesenchimali (MSC) nella massima terreno di crescita delle cellule staminali mesenchimali (MSCGM) a 37 ° C e 5% di CO ₂ fino vicino alla confluenza (~ 90%).
2. Preparare la soluzione di etichettatura magnetico miscelando 0,1 o 0,2 mM maghemite citrato rivestite con ossido di ferro (γFe ₂ O _3; nucleo: 8 nm di diametro) in terreno 5A di McCoy privo di siero modificata a Roswell Park Memorial Institute (RMPI) senza glutammina e contenente 5 mM citrato di sodio.
3. Eliminare il mezzo, lavare le cellule con mezzo RPMI privo di siero senza glutammina, e aggiungere 10 ml di soluzione di ferro ossido di nanoparticelle a 150 cm ² pallone di coltura, il volume minimo richiesto per coprire tutte le celle.
4. Incubare per 30 minuti a 37 ° C e 5% di CO ₂ e quindi eliminare la soluzione di nanoparticelle. Sciacquare per 5 minuti con mezzo RPMI privo di siero senza glutammina per internalizzare il nanoparticles ancora attaccato alla membrana plasmatica.
5. Eliminare il medium RPMI e aggiungere 25 ml di completo media MSCGM per bombola. Incubare per una notte a 37 ° C e 5% CO _2.

3. semina delle cellule magnetiche

1. Appena preparare il mezzo condrogenica usando Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose con L-glutammina aggiungendo 50 mM di acido L-ascorbico 2-fosfato, 0,1 pM desametasone, 1 mM sodio piruvato, 0,35 mM L-prolina, 1% cultura universale supplemento contenente insulina, transferrina umana e acido selenioso (ITS-Premix), e 10 ng / mL di crescita trasformante fattore-beta 3 (TGF-β3).
2. Staccare le cellule magnetiche utilizzando 8 ml di 0,05% tripsina-EDTA a 150 ^cm-2 pallone di coltura e centrifugare le cellule dissociate a 260 xg per 5 min. Aspirare il terreno e contare le cellule risospese.
3. Posizionare una coltura cellulare con fondo piatto Petri (35 mm) al di sopra di entrambi i dispositivi magnetici.
4. per magnetically formare aggregati, aggiungere 3 ml di terreno condrogenica alla piastra di Petri e delicatamente depositare il minor volume possibile (non più di 8 mL) contenente 2,5 x 10 ⁵ cellule marcate per aggregato (fino a 16 aggregati può essere depositato). Lasciare la piastra di Petri per 20-30 min senza spostarlo, permettendo di formare sferoidi, e quindi inserire il dispositivo completo, compresa la piastra di Petri contenente 16 aggregati, in incubatore a 37 ° C e 5% CO _2.
5. aggregati controllo forma seguendo lo stesso protocollo e sostituire il mezzo completo con il mezzo condrogenica senza TGF-β3.
   1. Per generare l'aggregato costrutto 3D, mettere 2 aggregati in contatto il giorno 8 per formare 8 doppiette ed avviare la fusione. Il giorno 11, unire 2 doppiette per formare 4 quartine. Infine, fondere le 4 quadruplets il giorno 15 per ottenere la struttura finale.
   2. Allo stesso tempo, formare aggregati centrifugando 2,5 × 10 ⁵ cellule staminali etichettati a 26015; g per 5 min a 15 mL provette con 1,5 mL di terreno condrogenica con o senza TGF-β3 (per il campione e controllo, rispettivamente).
6. Per magneticamente ponteggi seme, inserire ogni scaffold essiccato in una capsula di Petri. Utilizzare polisaccaridi scaffold porosi fatti di pullulano / destrano ^21. Per ogni scaffold, diluire 2 x 10 ⁶ cellule staminali marcate in 350 ml di mezzo condrogenica senza TGF-β3 e accuratamente pipetta le cellule sul ponteggio.
   1. Incubare per 5 min a 37 ° C per consentire la penetrazione cellulare completo entro l'impalcatura e poi delicatamente aggiungere 3 mL di terreno condrogenica con o senza TGF-β3 (rispettivamente campione o controllo,) alla piastra di Petri.
   2. Incubare il ponteggio cellularized sul suo dispositivo magnetico a 37 ° C e 5% di CO ₂ per 4 giorni per consentire la migrazione cellulare attraverso i pori scaffold e confinamento.
7. Allo stesso tempo, seminare ponteggi con 2 × 10 ⁶ cellule staminali etichettati seguendo lo stesso metodo e incubare senza il magnete per ottenere scaffold uniformemente seminato come controlli positivi.

4. differenziazione in condrociti

NOTA: Dopo 4 giorni di incubazione, rimuovere i magneti e continuare la maturazione condrogenica sia in una capsula di Petri (condizioni statiche) o in un bioreattore (condizioni dinamiche). campioni di controllo negativi sono maturati in condizioni statiche di media condrogenica senza TGF-β3.

1. In condizioni statiche, mantenere i ponteggi cellularized o aggregati della stessa piastra di Petri. Cambiare il medio condrogenica due volte a settimana per 21 giorni.
2. In condizioni dinamiche, preparare il bioreattore.
   1. Tagliare tubi in silicone alla lunghezza appropriata secondo il protocollo del produttore.
   2. Autoclavare tutti materiali: 500 mL camera cultura, tubi, piastre rotanti 2 vie, e gabbie.
   3. Posizionare le parti in un bioreattore microbio sterilistazione di sicurezza logico. Collegare il tubo per le 2 vie rotatori e alla camera di cultura seguendo le istruzioni del produttore.
   4. Trasferire accuratamente i ponteggi cellularized in gabbie sterilizzati utilizzando una spatola sterile. Mettere 2 ponteggi per gabbia. Quando le gabbie sono pronte, inserirle nelle aghi del coperchio per impedire loro di muoversi durante un'ulteriore rotazione. Riempire la camera di coltura con terreno condrogenica e chiuderlo con il coperchio contenente le gabbie.
3. Accendere la pompa peristaltica per riempire il tubo con il mezzo condrogenica e per eliminare le bolle d'aria.
4. Posizionare e fissare la camera riempita nel motore del bioreattore e accendere il computer, che controlla le rotazioni sia del braccio e della camera.
5. Applicare una velocità di rotazione di 5 rotazioni al minuto (rpm) sia sul braccio e la camera. Regolare la pompa peristaltica ad una portata di 10 rpm per l'alimentazione continua dei ponteggi cellularized.

5. RNA estrazione e l'analisi di espressione genica

NOTA: Prima di estrazione di RNA, digerire i ponteggi con una soluzione enzimatica.

1. Preparare 1 mL di soluzione enzimatica aggiungendo 100 ml di pullulanasi (40 U / ml) e 50 ml di destranasi (60 mg / ml) a 850 ml di terreno DMEM privo di siero.
2. Lavare i ponteggi due volte con DMEM privo di siero, scartare il mezzo, e aggiungere 800 microlitri della soluzione enzimatica per ponteggio. Incubare per 15-30 minuti a 37 ° C sotto leggera agitazione.
3. Quando l'impalcatura è completamente sciolto, trasferire la soluzione contenente le cellule ad una provetta da 1,5 mL, centrifugare a 300 xg per 10 min, aspirare accuratamente il mezzo, lavare due volte con sterile 1 × salina tamponata con fosfato (PBS), centrifugare a 300 g per 10 min, e risospendere le cellule in soluzione isolamento dell'RNA.
4. Per estrarre l'RNA dagli aggregati, posizionare i sferoidi nella soluzione di isolamento di RNA ecompletamente schiacciare usando un omogeneizzatore prima di eseguire l'estrazione di RNA.
5. Isolare l'RNA utilizzando un kit per l'estrazione di RNA totale secondo le istruzioni del produttore.
6. Sintetizzare il DNA complementare da 400 ng di RNA totale utilizzando la trascrittasi inversa secondo le istruzioni del produttore, utilizzando 250 ng di primer casuali, 1 ml di miscela di dNTP (10 mM ciascuno), e 40 U / ml RNasi inibitore; il volume finale della reazione è di 20 microlitri. Al termine della reazione, aggiungere 80 ml di acqua distillata per ottenere un volume finale di 100 microlitri.
7. Per la reazione a catena della polimerasi (PCR) quantitativa, usare una miscela di PCR contenente un reagente fluorescente per quantificare l'espressione relativa dei geni di interesse, come aggrecan (AGC) e collagene II (Col II), con 10 × diluito cDNA. Normalizzare i livelli di espressione genica con la Ribosomale proteina del gene di riferimento, di grandi dimensioni, P0 (RPLP0). Eseguire i calcoli con il 2 ^- formula ^ΔΔCT, Dove ΔΔCT = ΔCT condizione differenziata - significa ΔCT di condizione di controllo, e ogni ΔCT rappresenta la TC del gene di interesse - CT del gene di riferimento (RPLP0).
8. Determinare misurazioni statistiche come i valori medi ± l'errore standard della media (SEM). Eseguire l'analisi con n ≥ 2 esperimenti indipendenti. Utilizzare test t di analizzare le differenze statistiche tra pellets centrifugati e fusioni magnetici (* p <0,05). Determinare la significatività con un test di Kruskal-Wallis (ANOVA non parametrico) per analizzare le differenze statistiche tra scaffold differenziati e con lo scaffold controllo (* p <0,05).

6. analisi istologica

1. Lavare i ponteggi cellularized o aggregati con sterile 1 × PBS, fissarli in formalina al 10% per 1 ora a temperatura ambiente, e risciacquare con 1 × PBS.
2. Rimuovere la PBS, incorporare i campioni in cuttin ottimalecomposto g temperatura (OCT), e congelarli in un bagno isopentano immersi in azoto liquido. Conservare il campione a -20 ° C. Tagliare i campioni con un criostato avere criosezioni 8 micron per gli aggregati o 12 micron per i ponteggi cellularized.
3. Macchiare le criosezioni con 0,5% toluidina soluzione blu per 2 min, risciacquo in acqua di rubinetto, disidratare con etanolo al 100%, chiarire con toluene, e montare i vetrini con un mezzo di montaggio per la microscopia ottica.

Risultati

In primo luogo, gli aggregati possono essere formati individualmente tramite microorganismi magneti depositando 2,5 x 10 ⁵ cellule staminali marcate (Figura 2A). Questi singoli aggregati (~ 0,8 mm di dimensione) possono essere fusi in strutture più grandi grazie sequenziale, fusione indotta magneticamente. Per esempio, il giorno 8 di maturazione condrogenica, aggregati sono stati posti in contatto in coppia per formare doppietti; quartine sono state assemblat...

Discussione

In primo luogo, perché le tecniche qui presentate si basano su l'internalizzazione delle nanoparticelle magnetiche, una questione importante è il risultato delle nanoparticelle, una volta che localizzano all'interno delle cellule. È vero che le nanoparticelle di ferro possono scatenare tossicità potenziale o capacità di differenziazione ridotta seconda delle loro dimensioni, rivestimento, e il tempo di esposizione ^{19, 22.} Tuttavia, numerosi studi ha...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iron oxide (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3)	PHENIX - University Paris 6	Made and given by C. Ménager	Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge
Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds	LIOAD - University Nantes	Made and given by C. Le Visage	Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10 M NaOH). Porosity: 185-205 µm; Thickness: 7 mm; Surface area: 1.8 cm2.
TisXell Regeneration System	QuinXell Technologies	QX900-002	Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber
Cage for scaffolds: Histosette II M492	VWR	720-0909
Mesenchymal Stem Cell (MSC)	Lonza	PT-2501	Three independant batches have been used
MSCGM BulletKit medium	Lonza	PT-3001	For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium
DMEM with Glutamax I	Life Technologies	31966-021	No sodium pyruvate, no HEPES
RPMI medium 1640, no Glutamine	Life Technologies	31870-025	No sodium pyruvate, no HEPES
PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2	Life Technologies	14190-094
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
Penicillin (10,000 U/mL) / Streptomycin (10,000 µg/mL)	Life Technologies	15140-122
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)	Corning	354352
Sodium pyruvate solution 100 mM	Sigma	S8636
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Sigma	A8960	Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously
L-Proline	Sigma	P5607	Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C
Dexamethasone	Sigma	D4902	Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20 °C
TGF-beta 3 protein 10 µg	Interchim	30R-AT028
Tri-sodium citrate	VWR	33615.268	Prepare the 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C
Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus	Sigma	P2986
Dextranase from Chaetomium erraticum	Sigma	D0443
NucleoSpin RNA Extraction Kit	Macherey-Nagel	740955.5
SuperScript II Reverse Transcriptase	Life Technologies	18064-014
Random Primer - Hexamer	Promega	C1181	500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample
Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor	Promega	N2511	40 U/µL: put 1 µL per sample
PCR nucleotide dNTP mix (10 mM each)	Roche	10842321
SyBr Green PCR Master Mix	Life Technologies	4368708
Step One Plus Real-Time PCR System	Life Technologies	4381792
Formalin solution 10% neutral buffered	Sigma	HT5012
OCT solution	VWR	361603E
Isopentane	Sigma	M32631
Toluidine blue O	VWR	1.15930.0025
Ethanol absolute	VWR	20821.310
Toluene	VWR	1.08323.1000
Mounting medium Pertex	Histolab	840
RPLP0 Primer for qPCR	Eurogentec		5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3'
Aggrecan Primer for qPCR	Eurogentec		5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'
Collagen II Primer for qPCR	Eurogentec		5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5'