Differenziazione efficiente delle pluripotenti cellule staminali per NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; progenitori pancreatici

Riepilogo

Qui si descrive un protocollo a 4 stadi per differenziare le cellule staminali embrionali umane per NKX6-1 ⁺ progenitori pancreatici in vitro. Questo protocollo può essere applicata ad una varietà di linee di cellule staminali pluripotenti umane.

Abstract

cellule staminali pluripotenti hanno la capacità di auto rinnovarsi e differenziarsi in molteplici linee cellulari, che li rende una fonte interessante per la generazione di cellule progenitrici pancreatiche che può essere utilizzato per lo studio di e futuro trattamento del diabete. Questo articolo descrive un protocollo di differenziazione a quattro stadi progettato per generare cellule progenitrici del pancreas da cellule staminali embrionali umane (hESC). Questo protocollo può essere applicato a un numero di (HPSC) linee di cellule staminali pluripotenti umana. L'approccio adottato per generare cellule progenitrici del pancreas è quello di differenziare hESC per modellare con precisione le fasi chiave dello sviluppo del pancreas. Questo inizia con l'induzione della endoderma definitiva, che si ottiene coltivando le cellule in presenza di Activin A, fattore base di crescita dei fibroblasti (bFGF) e CHIR990210. Ulteriore differenziazione e patterning con fibroblasti fattore di crescita 10 (FGF10) e Dorsomorphin genera cellule simili a foregut posteriore. L'aggiunta di RetinOico, NOGGIN, SANT-1 e FGF10 differenzia le cellule posteriore foregut in cellule caratteristici di endoderma al pancreas. Infine, la combinazione di Epidermal Growth Factor (EGF), nicotinammide e NOGGIN porta alla generazione efficiente di cellule PDX1 ⁺ / ⁺ NKX6-1. Citometria a flusso viene eseguita per confermare l'espressione di marcatori specifici nelle fasi chiave dello sviluppo del pancreas. I Pdx1 ⁺ / ⁺ NKX6-1 progenitori pancreatici al termine della fase 4 sono in grado di generare cellule beta mature sul trapianto in topi immunodeficienti e possono essere ulteriormente differenziati per generare cellule che producono insulina in vitro. Così, l'efficiente generazione di PDX1 ⁺ / ⁺ NKX6-1 progenitori pancreatici, come dimostrato in questo protocollo, è di grande importanza in quanto fornisce una piattaforma per studiare lo sviluppo del pancreas umano in vitro e fornisce una fonte di cellule con il potenziale di differenziazione per le cellule beta che potrebbe eVentually essere utilizzato per il trattamento del diabete.

Introduzione

La prevalenza del diabete è in aumento e, secondo la Canadian Diabetes Association, si stima che oltre 11 milioni di persone in Canada sono diabetici o prediabetici, con il 5-10% di questi individui che hanno il diabete di tipo 1 (diabete di tipo 1) ^1. T1D è una malattia autoimmune che è causata dalla distruzione delle cellule beta produttrici di insulina che si trovano all'interno delle isole di Langerhans. Attualmente, le persone che vivono con diabete di tipo 1 richiedono fonti esogene di insulina ^2. Nonostante i progressi nella terapia insulinica, i pazienti T1D continuano ad avere un momento difficile che regola i livelli di glucosio nel sangue e continua a soffrire sia ipo e iperglicemia. Una forma promettente trattamento per ripristinare la normoglicemia nel diabete di tipo 1 è l'uso di cellule staminali embrionali umane (hESC), che potrebbero essere utilizzati per generare una quantità illimitata di cellule produttrici di insulina beta sia in vivo che in vitro ^{3, 4, 5, 6, 7.} Differenziare hESC ai beta-come le cellule potrebbero rendere possibile lo studio del diabete in vitro, consentendo l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici per il diabete di tipo 2 e di fornire cellule per il trapianto in pazienti T1D.

Il tentativo più riuscito a generare le cellule produttrici di insulina dalle hESC in vitro è di ricapitolare gli eventi embrionali che si verificano durante lo sviluppo del pancreas ^{4, 5.} Ciò comporta la manipolazione di vie di segnalazione distinti per modellare con precisione le fasi essenziali del pancreas in via di sviluppo. Sviluppo pancreas inizia con l'induzione della endoderma definitiva, che si caratterizza per l'espressione di CXCR4 e CD117 (c-KIT) ^{8, 9.} regolazione precisa della definitorganizzazione endoderma ive è necessaria per la formazione del tubo intestinale, che poi subisce anteriore-posteriore patterning e ventrale-dorsale. La dorsale e gemme pancreatico ventrale emergono dalla regione del foregut posteriori che esprime il gene homeobox pancreatiche e duodenali (Pdx1), che è necessario per lo sviluppo del pancreas ^10. Il fusibile dorsale e ventrale gemme per formare il pancreas, che poi viene ampiamente rimodellamento epiteliale e di espansione ^11. L'impegno per il sistema endocrino e esocrina lignaggio è accompagnata dalla generazione di cellule progenitrici multipotenti (PPM) che esprimono, tra gli altri, i fattori di trascrizione Pdx1, Nkx6.1 e Ptf1a ^{12, 13.} PPM che diventeranno cellule endocrine e duttali continuano ad esprimere Nkx6-1 riducendo espressione Ptf1a. Contrariamente a questo, le cellule esocrine lignaggio perderanno expression di Nkx6-1 e mantenere Ptf1a espressione ^12.

Il fattore di trascrizione Nkx6-1 ha un ruolo chiave nello sviluppo del pancreas, in particolare durante la differenziazione delle cellule progenitrici endocrine di beta cellule. Come descritto in precedenza, l'eliminazione di Nkx6-1 risultati in formazione ridotta di cellule beta durante lo sviluppo del pancreas ^14. Pertanto, generando cellule ß che producono insulina sia in vitro che in vivo richiede l'induzione efficiente Nkx6-1.

Recentemente abbiamo sviluppato un protocollo per generare in modo efficiente Pdx1 ⁺ / ⁺ NKX6-1 progenitori pancreatici da hPSCs. Questi progenitori pancreatici HPSC-derivati generano cellule beta mature su trapianto in topi immunodeficienti ^3. Il protocollo differenziazione può essere diviso in 4 stadi caratteristici di: 1) induzione endoderma definitivo, 2) posteriori foregut patterning, 3) le specifiche del pancreas e 4) l'induzione NKX6-1. Qui forniamo una descrizione dettagliata di ogni fase della differenziazione diretto.

Protocollo

1. preparazione di soluzioni e supporti

NOTA: Preparare tutti i supporti per colture cellulari in un ambiente sterile. Media deve essere fatto e utilizzato immediatamente. Dettagli reagenti sono forniti nella tabella materiali.

1. differenziazione media
   1. Preparare Giorno 0 differenziazione di media: RPMI medio con 1% glutammina, 2 micron CHIR 99021, 100 ng / ml Activin A, 10 ⁴ M MTG.
   2. Preparare Giorno 1-2 Differenziazione di media: RPMI medio con 1% glutammina, 100 ng / ml Activin A, 10 ⁴ M MTG, 5 ng / ml bFGF, Acid 50 mg / ml ascorbico.
   3. Preparare Giorno 3-5 Differenziazione di media: RPMI medio con 1% glutammina, 1% B27, 10 ⁴ M MTG, 0,75 micron Dorsomorphin, 50 ng / ml FGF10.
   4. Preparare Giorno 6-7 Differenziazione di media: DMEM con 1% glutammina, 1% B27, 50 mg / ml di acido ascorbico, 50 ng / ml FGF10, 0,25 micron SANT-1, 2 mM acido retinoico, 50 ng / ml NOGGIN.
      NOTA: retinoicoAcido deve essere aggiunto ai media dell'ultimo e dei media deve essere protetto dalla luce per evitare la degradazione ossidativa ^15.
   5. Preparare Giorno 8-12 Differenziazione di media: DMEM con 1% glutammina, 1% B27, 50 mg / ml di acido ascorbico, 50 ng / ml NOGGIN, 100 ng / ml hEGF, 10 mM nicotinamide.
2. Preparare FACS buffer: 10% FBS in PBS, meno calcio e magnesio.

2. HESC Differenziazione

NOTA: HESC vengono scongelati, diversi passaggi e ampliato di topo irradiati fibroblasti embrionali in presenza di un supporto KOSR-based integrato con bFGF ^16. HESCs sono pronti per la differenziazione quando le cellule raggiungono 80-95% di confluenza. In questo momento le colonie dovrebbero essere grandi con bordi definiti e un 'a forma di cupola' struttura (Figura 1A). Tutti coltura cellulare viene eseguita in fondo piatto, tessuto di coltura trattata piastre rivestite con 0,1% di gelatina. Tipicamente, le cellule sono coltivate in 6 opiastre da 12 pozzetti, in volumi dei media di 2 ml o 1 ml, rispettivamente.

1. Il giorno 0, iniziare la differenziazione sostituendo il materiale KOSR-based con Giorno 0 Differenziazione Media.
2. Nei giorni 1 e 2, agitare delicatamente la piastra per rimuovere tutte le cellule morte dal monostrato prima aspirazione. Sostituire con il giorno 1-2 Differenziazione Media.
3. Il giorno 3, Celle di raccolta per citometria a flusso. Se le cellule esprimono più del 90% CXCR4 ⁺ / CD117 ^+, procedere al punto 2.4.
4. Nei giorni 3 e 5, agitare delicatamente la piastra per rimuovere tutte le cellule morte dal monostrato prima di aspirazione. Sostituire con il giorno 3-5 Differenziazione Media.
5. Nei giorni 6 e 7, sostituirlo con il giorno 6-7 Differenziazione Media.
6. Nei giorni 8, 10 e 12, sostituire con la Giornata 8-12 Differenziazione Media.
7. Il giorno 13, Celle di raccolta per citometria a flusso per determinare PDX1 ed espressione NKX6-1.

3. Cellule di raccolta per l'analisi Citometria a Flusso

1. Separa celle consoluzione di tripsina commerciale 1x secondo il protocollo del produttore e incubare a 37 ° C per 3 min.
2. Rimuovere la soluzione tripsina commerciale e sospendere nuovamente le cellule singole a 1.000 ml FACS tampone con 30 microlitri DNasi I.
3. Celle filtranti con un colino cella di rete di nylon 35 micron e trasferire in una provetta.
4. cellule centrifugare a 455 xg per 5 min. Preparare le cellule sia per la colorazione dal vivo o fisso.

4. La colorazione per citometria a flusso

1. Flusso di preparazione per la colorazione dal vivo il giorno 3
   1. Risospendere le cellule in 1.000 ml FACS tampone. Trasferimento 200 ml (circa 1-3 x 10 ⁵ cellule) in due pozzetti di una piastra a 96 pozzetti (per entrambi i campioni non colorati e macchiati).
   2. Centrifugare la piastra a 931 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante invertendo la piastra.
   3. Macchia con anticorpi primari coniugati, CXCR4: APC e CD117: PE (vedi Tabella M ateriali) per 30 min a temperatura ambiente al riparo dalla luce.
   4. Centrifugare la piastra a 931 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante invertendo la piastra.
   5. campioni risospendere in 100 microlitri FACS tampone.
   6. Centrifugare la piastra a 931 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante invertendo la piastra.
   7. Risospendere ogni campione e trasferimento in un volume totale di 300-500 microlitri FACS tampone a 1 ml provette micro o 5 ml tubi a fondo rotondo.
   8. Campioni eseguito sul citofluorimetro ^17. Se i campioni non possono essere eseguite immediatamente, conservare a 4 ° C al riparo dalla luce.
2. Flusso di preparazione per la colorazione fissato il giorno 13
   1. Risospendere il pellet di cellule in soluzione di fissaggio / permeabilizzazione commerciale per 24 ore a 4 ° C.
   2. Centrifugare il campione a 455 xg per 5 min. Risospendere in 400 ml soluzione di Perm / Wash.
   3. Trasferire 200 microlitri del campione (circa 0,5-1 x 10 ⁶ cellule) per twO pozzetti di una piastra a 96 pozzetti (per il controllo IgG e PDX1 / NKX6-1 colorazione). Centrifugare a 931 xg per 2 minuti.
   4. Risospendere il pellet di cellule in 100 microlitri soluzione di Perm / Wash contenente anti-PDX1 e gli anticorpi di controllo primario o isotipo anti--NKX6-1 (vedi Materiali Tavolo). Incubare per una notte a 4 ° C.
   5. Centrifugare la piastra a 931 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante invertendo la piastra. campioni risospendere in 100 microlitri soluzione di Perm / Wash.
   6. Centrifugare la piastra a 931 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante invertendo la piastra.
   7. Risospendere i campioni in 100 microlitri Perm / Wash contenenti anticorpi secondari a temperatura ambiente per 1 ora al riparo dalla luce.
   8. Centrifugare la piastra a 931 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante invertendo la piastra.
   9. campioni risospendere in 100 microlitri Perm Solution / lavaggio.
   10. Centrifugare la piastra a 931 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante invertendo la piastra.
   11. rappresentantemangiare passo 4.2.9 e 4.2.10.
   12. Risospendere ogni campione e trasferimento in un volume totale di 300-500 microlitri FACS tampone a 1 ml provette micro o 5 ml tubi a fondo rotondo.
   13. Campioni eseguito sul citofluorimetro ^17. Se i campioni non possono essere eseguite immediatamente, conservare a 4 ° C al riparo dalla luce.

Risultati

Generazione efficiente di progenitori pancreatici basa sulla corretta crescita e il mantenimento di cellule indifferenziate seguita dalla precisa aggiunta di specifiche molecole di segnalazione durante il protocollo di differenziazione, come illustrato nello schema di Figura 1A. Il giorno 0, cellule indifferenziate dovrebbe essere 80-95% confluenti e le colonie devono avere bordi definiti (Figura 1A). Durante la fase 1, i media sarà probabilmente appari...

Discussione

Generando con successo NKX6-1 ⁺ progenitori pancreatici da hPSCs in vitro si basa su l'uso di colture di alta qualità di hPSCs e differenziazione diretto che coinvolgono la regolazione precisa delle specifiche vie di segnalazione che regolano principali fasi di sviluppo durante lo sviluppo del pancreas. Sebbene questo protocollo può essere usato per indurre robusta espressione di NKX6-1 attraverso una varietà di linee HPSC come precedentemente indicata ^3, per assicurare...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media and cytokines
1-Thioglycerol (MTG)	Sigma	M6145
Activin A	R&D	338-AC/CF
Ascorbic Acid	Sigma	A4544
B-27 Supplement	Life Technologies	12587-010
BD Cytofix/Cytoperm Buffer	BD Bioscience	554722
BD Perm/Wash buffer, 1x	BD Bioscience	554723
bFGF	R&D	233-FB
CHIR990210	Tocris	4423a
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11995
DNase I	VWR	80510-412
Dorsomorphin	Sigma	P5499
EGF	R&D	236-EG
Fetal Bovine Serum (FBS)	Wisent	88150
FGF10	R&D	345-FG
Gelatin from porcine skin	Sigma	G1890
Glutamine	Life Technologies	25030
Nicotinamide	Sigma	NO636
NOGGIN	R&D	3344-NG
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-063
Retinoic acid	Sigma	R2625
RPMI Medium 1640	Life Technologies	11875
SANT-1	Tocris	1974
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red	Life Technologies	12605-010
Name	Company	Catalogue Number	Comments
Antibodies for flow cytometry (working dilutions)
CD117 PE (1:100)	Life Technologies	CD11705
CXCR4 APC (1:50)	BD  Bioscience	551966
Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400)	Life Technologies	A-31571
Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400)	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	705-546-147
Isotype Control Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	015-000-003
Isotype Control Goat IgG	R&D	AB-108-C
NKX6-1 (1:2,000)	DSHB	F55A10
PDX1 (1:100)	R&D	AF2419