Intracellulare colorazione e citometria a flusso per l'identificazione dei linfociti sottoinsiemi all'interno murino Aorta, rene e linfonodi in un modello di ipertensione

Riepilogo

Questo articolo fornisce una metodologia dettagliata per identificare e quantificare i sottoinsiemi dei linfociti T funzionali presenti all'interno dei nodi del rene murino, aorta e linfatici mediante colorazione intracellulare e citometria a flusso. Il modello di angiotensina II ipertensione indotta è stato scelto per spiegare, passo-passo, le procedure ei principi fondamentali della citometria a flusso e colorazione intracellulare.

Abstract

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases^1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension⁶. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention^1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.

Introduzione

Recenti evidenze dimostra che il sistema immunitario adattativo, in particolare i linfociti T, giocano un ruolo fondamentale nello sviluppo di diverse malattie cardiovascolari ^1,2,3,4,5. Ad esempio, nel modello di angiotensina II ipertensione indotta, un accumulo di cellule T nei vasi e nei reni dei topi è stato descritto ^6. L'accumulo vascolare è prevalentemente nel avventizia e il grasso perivascolare. Nel rene, cellule T accumulano sia midollo e corteccia renale. A seconda di quale sottoinsieme è coinvolto, queste cellule T danno luogo a diverse citochine che possono influenzare la funzione vascolare e renale e portare allo sviluppo della patologia (recensione da McMaster et al. ^6).

Linfociti T helper CD4 ⁺ possono essere suddivisi in diversi sottogruppi: cellule (TFH) T helper 1 (Th1), Th2, Th9, Th17, Th22, regolatori (Treg), le cellule T, e T helper follicolare in base alle loro funzioni e la firma citokines ^7. Allo stesso modo, le cellule CD8 ⁺ T citotossici possono essere classificati come Tc1, Tc2, TC17 o TC9 ^8. Ci sono anche doppie cellule T negative (cioè le cellule che non esprimono CD4 o marcatori cellulari T CD8). Un sottoinsieme di queste cellule possiedono una gamma delta recettore delle cellule T alternativo (al posto dei classici alfa e beta recettori) e sono quindi indicato come cellule T gamma delta. L'analisi multi-parametro mediante citometria di flusso del marcatore di superficie, citochine e fattori di trascrizione costituisce l'approccio migliore per identificare queste cellule. Anche se questo metodo è ampiamente usato nel campo della immunologia, è meno ben descritto in organi solidi e nel contesto delle malattie cardiovascolari.

Storicamente, l'identificazione dei linfociti nei tessuti era limitato a immunoistochimica o approcci RT-PCR. Sebbene immunoistochimica e immunofluorescenza sono metodi efficaci per determinare la distribuzione tissutale di un antigene di interest, essi sono inadeguati per identificare fenotipicamente i sottoinsiemi coinvolti. Inoltre, mentre l'analisi RT-PCR è utile per rilevare l'espressione mRNA di antigeni, citochine o fattori di trascrizione, non permette la rilevazione di più proteine ​​simultaneamente a livello delle singole cellule.

L'avvento della citometria a flusso, specialmente se combinata con la colorazione intracellulare per rilevare citochine e fattori di trascrizione, fornisce gli investigatori con una tecnica potente che permette l'identificazione e la quantificazione a livello di singola cellula di sottoinsiemi di cellule immunitarie in organi solidi. Abbiamo ottimizzato un test colorazione intracellulare per identificare mediante citometria di flusso principali sottogruppi di cellule T presenti nel rene murino, aorta e aortici linfonodi drenanti in un modello di angiotensina II ipertensione indotta. L'ottimizzazione di ogni fase: la digestione dei tessuti, ex vivo di attivazione, permeabilizzazione, e la superficie e risultati di colorazione intracellulare in un grande retest producibile che può essere applicato ad altri modelli di malattie cardiovascolari e renali.

Protocollo

Comitato Cura e uso istituzionale degli animali del Vanderbilt University ha approvato le procedure descritte nel presente documento. I topi sono alloggiati e curati in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (National Academies Press. Revised 2010).

1. L'isolamento della Drenante aortica linfonodi, reni e aorta di topi

1. Euthanize i topi da CO ₂ inalazione. Spruzzare il petto con il 70% di etanolo e aprire con cautela la pelle e la parete toracica con le forbici per esporre il cuore.
2. Per profumato la vascolarizzazione, eseguire una piccola incisione nell'atrio destro e costantemente iniettare almeno 10 ml di PBS freddo (circa 1 ml / sec) nella all'apice del ventricolo sinistro con un ago 21 G o 23. Profumato fino a quando tutti gli organi sono scottati. Il cuore blanches prima. Imbiancamento del fegato indica che la perfusione è stata ben eseguita.
3. Utilizzando piccole pinze e forbici sottili, delicatamente tagliare ed estrarre l'intestino,stomaco, milza, pancreas e del fegato per visualizzare meglio l'aorta.
   NOTA: Questa operazione deve essere effettuata con estrema precisione come danni al tratto gastrointestinale può indurre contaminazione.
4. Tagliare e rimuovere ogni polmone con le forbici. Risciacquare la cavità toracica con tampone fosfato (PBS) con una siringa senza ago. Rimuovere il sangue in eccesso e di liquidi utilizzando garza sterile.
5. Rimuovere i nodi dell'aorta addominale drenanti linfatici utilizzando dissettore sottili. Assicurarsi di non rompere la capsula. Rimuovere il grasso che rimane sulla superficie di ogni linfonodo con le pinze dissezione. Tagliare i due reni con forbici sottili.
6. Sezionare l'intero dell'aorta (aorta toracica e addominale) con sottili, forbici curve. Inizia a livello del cuore e con attenzione sezionare dalla esofago e le vertebre fino al livello della biforcazione iliaca evitando di mettere il grasso circostante perivascolare attaccata all'aorta.
   NOTA: Ulteriore dissezione dell'aorta Remove strutture circostanti possono essere fatte al microscopio. In particolare, rimuovere rami arteriosi (arterie carotidi, arterie succlavia, celiaci, mesenterici, e arterie renali) e linfonodi. Non tenere uno strato consistente di grasso perivascolare attorno ad ogni aorta dal momento che questo è un sito dove molte cellule infiammatorie risiedono nella cornice di ipertensione. Mettere ogni tessuto in provette separate contenenti PBS freddo.

2. Generazione di sospensioni singola cellula da ogni tessuto

1. i reni
   NOTA: Il rene può essere dissociata in una sospensione singola cella mediante la combinazione di dissociazione meccanica più digestione enzimatica.
   1. Preparare la soluzione di digestione renale aggiungendo collagenasi D (2 mg / ml) e DNasi I (100 ug / ml) di terreno RPMI 1640 (integrato con siero fetale bovino al 5% (FBS)). Preparare 10 ml per campione di rene.
   2. Utilizzare pinze per trasferire i due reni in un tubo di dissociazione contenente 10 ml di rene digeriresoluzione di ioni.
   3. Eseguire la dissociazione meccanica utilizzando un dispositivo dissociatore semi-automatico in base alle istruzioni del produttore.
   4. Dopo la dissociazione meccanica, staccare il tubo dal dispositivo ed eseguire la digestione enzimatica. Incubare i campioni per 20 min a 37 ° C sotto rotazione continua. fermare immediatamente la digestione enzimatica con l'aggiunta di freddo medie RPMI 1640 supplementato con 5% FBS.
   5. Trasferire la soluzione pipettando in un tubo conico da 50 ml dopo che filtra attraverso un colino 40 micron. Tease il tessuto rimanente parte premendo con lo stantuffo di una siringa da 1 ml. Agglomerare le cellule (500 XG, 8 min, 4 ° C).
   6. Risospendere il pellet in 3 ml di 36% mezzi centrifugazione in gradiente di densità. Trasferire la sospensione in una provetta conica da 15 ml. Delicatamente aggiungere 3 ml di 72% dei media gradiente di densità di centrifugazione sotto la sospensione cellulare 3 ml di 36% senza alcuna interruzione. Centrifuga (1.000 xg senza freno, 20 min, 4 ° C).
   7. Le cellule immunitarie saranno posizionati all'interfaccia. Rimuovere lo strato più alto giallastro contenente detriti cellulari e quindi portare il volume fino a 15 ml con PBS freddo. Agitare bene per rottura del gradiente. Spin le cellule (300 XG, 8 min, 4 ° C) e risospendere il pellet in 3 ml di RPMI con il 5% FBS. Contare il numero di cellule vive su un emocitometro utilizzando trypan blu.
2. L'aorta
   1. Preparare la soluzione di digestione aorta aggiungendo collagenasi A (1 mg / ml), collagenasi B (1 mg / ml), e DNasi I (100 ug / ml) di terreno RPMI 1640 (integrato con il 5% FBS).
   2. Utilizzando una pinza sottile, trasferire l'aorta in una provetta 2 ml contenente 1 ml di soluzione dell'aorta digestione. Tritare l'intera aorta in pezzi molto piccoli con le forbici sottili nella soluzione di digestione 1 ml. Tenere in ghiaccio. Incubare i campioni per 30 minuti a 37 ° C sotto rotazione continua.
   3. Trasferire la soluzione in un piatto di coltura di tessuti e fermare la Enzymadigestione tic aggiungendo 5 volte il volume del freddo RPMI con 5% FBS.
   4. Trasferire la soluzione pipettando in un tubo conico da 50 ml dopo che filtra attraverso un colino 40 micron. Tease il tessuto rimanente parte in una sospensione singola cella premendo con lo stantuffo di una siringa da 1 ml. Lavare il filtro e agglomerare le cellule (300 XG, 8 min, 4 ° C).
   5. Lavare il pellet aggiungendo 10 ml di RPMI con 5% FBS. Spin le cellule (300 XG, 8 min, 4 ° C) e risospendere il pellet in 3 ml di RPMI con il 5% FBS. Contare il numero di cellule vive su un emocitometro utilizzando trypan blu.
3. I aortici linfonodi drenanti
   1. Collocare un filtro 40 micron in un piatto di coltura di tessuti (60 mm x 15 mm). Posizionare i linfonodi sul filtro e li prendere in giro a parte in una sospensione singola cella premendo con lo stantuffo di una siringa da 1 ml. Lavare il filtro con 2 ml di RPMI con il 5% FBS. Raccogliere le cellule nel piatto.
   2. Trasferimentole cellule in una provetta da 15 ml falco e agglomerare le cellule (300 XG, 8 min, 4 ° C). Risospendere il pellet in 500 ml di RPMI con 5% FBS. Contare il numero di cellule vive su un emocitometro utilizzando trypan blu.

3. Ex Vivo Stimolazione per citochine rilevamento mediante citometria di flusso

1. Preparare il mezzo di coltura: RPMI con 5% FBS, 0,1 mM di aminoacidi non essenziali, 50 mM β-mercaptoetanolo e 1% di penicillina / streptomicina.
2. Centrifugare ogni sospensione cellulare ottenuta dai nodi reni, aorta e linfatici (300 xg, 8 min, 4 ° C). Risospendere ogni pellet con il mezzo di coltura ad una concentrazione di 1 x 10 ⁶ cellule per ml.
3. Stimolare le cellule con l'aggiunta di 2 ml di cocktail di attivazione delle cellule (contenente Phorbol 12-Myristate 13-acetato (PMA), il ionomicina ionoforo del calcio, e l'inibitore Golgi brefeldina a) per ogni 1 ml di coltura cellulare.
   NOTA: La concentrazione finales di ogni componente sono: 81 nM di PMA, 1,33 micron di ionomicina e 5 mg / ml di brefeldin A. Il trattamento con PMA e ionomicina attiva le cellule per la produzione di citochine. Le citochine sono secreti proteine ​​che devono essere intrappolati nelle celle da rilevare. Brefeldina a causa l'accumulo di proteine ​​secrete normalmente nell'apparecchiatura reticolo endoplasmatico e Golgi. Pertanto, la tecnica qui descritta migliora la rilevabilità dei linfociti producenti citochine mediante citometria di flusso.
4. Piastra 1 a 2 milioni di cellule in un 12-pozzetti (aorta o renali) o 24 pozzetti (linfonodi) piastre a bassa aderenza. Porre la piastra in un 37 ° C umidificata CO ₂ incubatore per 3 ore.
   NOTA: Il numero di cellule placcato può essere inferiore nei linfonodi di topi di controllo. Inoltre, il tempo di stimolazione deve essere determinato empiricamente per ciascuna popolazione cellulare e citochine studiate. Nel caso di cellule T isolate da nodi aorta, reni o linfatici, si consiglia di stimolante per 3-4 ore. Una più lunga stimolazione wmalato non aumentare la secrezione di citochine e indurrà un ulteriore down-regulation di diversi marcatori di superficie delle cellule T come CD3, CD4 e CD8. (Si noti che anche una stimolazione 3-4 ore indurrà alcuni down-regulation di questi marcatori.)

La colorazione 4. Superficie

1. Trasferire le cellule in una provetta di polistirene FACS e centrifugare (300 xg, 8 min, 4 ° C). Lavare le cellule due volte con tampone FACS (Ca ²⁺ e Mg ⁺ free PBS contenente 4% FBS e 2 mM EDTA) e dividere la sospensione cellulare equamente in diversi tubi FACS base al numero di pannelli di anticorpi desiderate e il numero dei tubi di controllo necessari ( vedi sotto).
2. Per eseguire la compensazione per ogni pannello, preparare i tubi di controllo non colorati e singoli tubi colorati per ogni tipo di tessuto e il pannello di anticorpi. Inoltre, preparare tubi fluorescenza meno uno (FMO) controllo per ciascun pannello anticorpi sommando tutti tranne uno degli anticorpi.
3. Regolare il volume di ciascuna provetta a 2 ml con FACSBuffer. Centrifugare la sospensione cellulare (300 xg, 8 min, 4 ° C), rimuovere i recettori surnatante e blocco Fc incubando le cellule con 0,5 ug di anticorpi anti-CD16 / CD32 per milione di cellule per 10 min in ghiaccio.
   NOTA: CD16 è bassa affinità IgG Fc recettore III (CFR III) e CD32 è FcR II. CD16 / CD32 sono espressi su granulociti, mastociti, monociti / macrofagi, le cellule natural killer, linfociti B, cellule dendritiche e alcune cellule mature T attivate.
4. Eseguire la vitalità colorazione: Lavare le cellule con PBS 1x, centrifuga (300 xg, 8 min, 4 ° C) e risospendere in 1.000 ml di PBS 1x. Aggiungere 1 ml di una ammina-reattiva colorante (macchia la vitalità delle cellule)-impermeant. Incubare per 15 minuti a 4 ° C al riparo dalla luce.
5. Durante l'incubazione, preparare il cocktail di anticorpi (per la colorazione superficiale) in un volume adeguato di tampone FACS. Lavare le cellule due volte con 1-2 ml di tampone FACS, centrifuga (300 xg, 8 min, 4 ° C) e risospendere ogni pellet con 100 microlitridella miscela di anticorpi. Incubare per 30 min a 4 ° C al riparo dalla luce.
   NOTA: per ogni flusso citometria anticorpo, è utile per determinare la quantità ottimale di anticorpo necessaria una curva di titolazione della dose.
6. Lavare le cellule due volte con 2 ml di tampone FACS e agglomerare le cellule (300 XG, 8 min, 4 ° C).

5. fissazione, permeabilizzazione e intracellulare colorazione

1. Eseguire la colorazione intracellulare con un kit di fissaggio e permeabilizzazione contenente tamponi appropriati seguendo le istruzioni del produttore. Fissare e permeabilize le cellule da essi risospendere in tampone appropriato. Incubare i campioni per 40 minuti a 4 ° C al riparo dalla luce.
2. Aggiungere 1 ml di 1x permeabilizzazione e tampone di lavaggio direttamente alle cellule fisse e permeabilizzate. Centrifuga (500 xg, 8 min, 4 ° C) e rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet con 2 ml di tampone di lavaggio 1X.
3. Preparare le miscele di ANTIBodies (solo per la colorazione intracellulare) in un volume adeguato di tampone di lavaggio 1x (di solito 100 ml per provetta).
   NOTA: Come descritto in precedenza, la concentrazione ottimale di anticorpi deve essere determinato per ciascun anticorpo nel pannello. Ad esempio, per gli anticorpi anti IL-17A o IL-17F, usiamo un fattore di diluizione di 1:30, ma per gli anticorpi anti IFNγ e T-bet, si usa un fattore di diluizione di 1: 100.
4. Centrifugare le cellule (500 xg, 8 min, 4 ° C) e risospendere ogni pellet con 100 microlitri della miscela di anticorpi. Incubare per 40 minuti a 4 ° C al riparo dalla luce.
5. Lavare le cellule due volte con 2 ml di tampone di lavaggio 1x e agglomerare le cellule (500 XG, 8 min, 4 ° C). Risospendere il pellet con 300 ml di soluzione di lavaggio 1x e analizzare su un citofluorimetro con filtri appropriati.
6. Per la quantificazione del numero totale di cellule per campione di tessuto, utilizzare conteggio sfere. Prima di acquisizione, aggiungere il volume / numero consigliato di contare perle ad ogni provetta.

6. compensazione, gate, la normalizzazione, e suggerimenti

1. Compensazione e gating
   1. provette di controllo Run non colorati e singole macchiati di risarcimento per regolare per sovrapposizione spettrale.
      NOTA: L'uso di sfere di compensazione piuttosto che i controlli di compensazione a base di cellule è necessaria nei casi in cui è presente a livelli così bassi che la compensazione utilizzando cellule sarà difficile l'antigene di interesse o popolazione di cellule in un campione. Anche di nota, quando si utilizza coloranti tandem, è consigliabile preparare compensazioni per ogni esperimento da coloranti tandem variano da lotto a lotto e con ogni giorno.
   2. Eseguire fluorescenza meno uno dei controlli (QOR) per tutti i fluorofori nel pannello quando si inizia un nuovo esperimento multicolore.
      NOTA: I controlli FMO sono campioni che contengono tutti gli anticorpi nel pannello ad eccezione di uno. Questi controlli consentono una discriminazione accurata dei positiva rispetto segnali negativi per l'anticorpo omesso di adjus correttamentet i cancelli. Questi controlli sono particolarmente importante quando i livelli di espressione sono bassi o quando la separazione della popolazione bersaglio è povero (ad esempio, quando il bersaglio è una citochina o fattore di trascrizione). Anche se non sempre necessario, in alcuni casi, i controlli isotipo possono essere preferiti in luogo di FMO controlla quanto forniscono un'adeguata compensazione per isotipo dell'anticorpo e fluoroforo reagenti con la specificità dell'antigene.
   3. Impostare la porta principale: regolare Forward Scatter Area (FSC-A) e Side Scatter Area (SSC-A) di tensione al fine di individuare la popolazione leucocitaria.
   4. Escludere le cellule morte.
      NOTA: La macchia redditività reagisce con ammine liberi presenti sia sulla superficie e all'interno delle cellule. In contrasto a vivere cellule, le cellule morte (con membrane compromessi) permettono il colorante di entrare nel citoplasma, aumentando la quantità di etichettatura proteine. Così, le cellule morte saranno più luminoso di cellule vive che permettono facile discriminazione. Porta sul vivocellule.
      NOTA: La vitalità delle sospensioni cellulari dalla aorta e rene può essere inferiore alla vitalità delle sospensioni cellulari da linfonodi a causa della fase di digestione aggiuntivo.
   5. Trama Forward Scatter Area (FSC-A) [asse y] e Forward Scatter Altezza (FSC-H) [asse x]. Canottiere appaiono come una diagonale su questo terreno dot. Porta su questa diagonale per escludere doppietti. Poi tracciare SSC-A [y] e CD45 [asse x].
   6. La popolazione CD45 ⁺ leucociti può essere facilmente identificato. Porta su questa popolazione. popolazioni successive possono essere identificate da questa popolazione.
2. La normalizzazione della conta delle cellule
   1. conteggio sfere hanno caratteristiche che si traducono in bassa SSC FSC e alto. Ad esempio, se 50.000 perle sono aggiunti in 300 microlitri della sospensione cellulare singolo, l'equazione per il calcolo del numero assoluto di qualsiasi dato tipo di cellula per provetta è il seguente:
      Numero di celle ptubo di ER = (50.000 / numero di perline contati dal citofluorimetro) x numero di cellule contate.
      Usando questo calcolo, il numero assoluto di un dato tipo di cellula per provetta può essere determinato. Sulla base di quante tubi sono stati generati da ogni organo, il numero di cellule per organo può essere calcolato.
      NOTA: Tenere tutte le cellule e reagenti a 4 ° C durante il protocollo. Evitare vortex vigorosa perché può danneggiare le cellule. Utilizzare le forze minime per agglomerare le cellule. Evitare di fare bolle nel tubo FACS dal momento che può precipitare la morte delle cellule. Non lasciate che il pellet asciugare in qualsiasi momento.

Risultati

Il protocollo consente descritto l'identificazione di marcatori di superficie ed intracellulari in cellule T isolate dal rene murino, aorta e aortici linfonodi drenanti in un modello di angiotensina II ipertensione indotta. I risultati rappresentativi sono presentati di seguito.

La Figura 1 mostra la strategia di gating utilizzato per identificare la popolazione di cellule T in una sospensione di cellule s...

Discussione

The protocol described herein has been optimized to properly identify T cell subsets present within murine kidneys, aorta and lymph nodes. This protocol can be easily adapted to examine other immune cell subsets such as B lymphocytes and innate immune cells and can be modified to include other tissue types. The digestion step is critical and has to be modified and optimized for each tissue⁹. A prolonged digestion step or the use of an inappropriate enzyme can affect the stability of antigen expression. Similar...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase D	ROCHE	11088882001
Collagenase A	ROCHE	10103586001
Collagenase B	ROCHE	11088815001
Dnase	ROCHE	10104159001
1x Red blood cell lysis buffer	eBioscience	00-4333-57
RPMI Medium 1614 1x	Gibco	11835-030
DPBS without calcium and magnesium	Gibco	14190-144
Percoll	GE Healthcare	17-5445-02	For density gradient centrifugation
GentleMACS™ C tube	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS dissociator device	Miltenyi Biotec	130-093-235	Use the program SPLEEN_04
Cell activation cocktail (with Brefeldin A)	Biolegend	423303
anti-CD16/32	eBioscience	14-0161-81	dilute 1:100
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit	Life Technologies	L34955
Transcription factor buffer set	BD Pharmingen	562725
OneComp eBeads	eBioscience	01-1111-42
123 count eBeads	eBioscience	01-1234-42
CD45 AmCyan (clone 30-F11)	BioLegend	103138
CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2)	BioLegend	100218
IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1)	BioLegend	506910
IL-17F APC (clone 9D3.1C8)	BioLegend	517004
CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5)	BD Biosciences	560181
CD8 APC (clone 53-67)	eBioscience	17-0081-82
T-bet PE-Cy7 (clone 4B10)	BioLegend	644823
IFNγ FITC (clone XMG1.2)	BD Biosciences	557724