Scaling di Engineered vascolari innesti Usando 3D Stampato Guide e il metodo di impilamento Anello

Riepilogo

Scalabili vasi sanguigni ingegnerizzati migliorerebbero applicabilità clinica. Uso delle guide facilmente considerevoli 3D-stampati, anelli di muscolatura liscia vascolare sono stati creati e accatastati in una forma tubolare, formando un innesto vascolare. Innesti possono essere dimensionati per soddisfare la gamma di dimensioni delle arterie coronarie umane semplicemente cambiando la dimensione guida 3D-stampata.

Abstract

Malattia coronarica rimane una delle principali cause di morte, che colpisce milioni di americani. Con la mancanza di innesti vascolari autologhi disponibili, innesti ingegnerizzati offrono un grande potenziale per il trattamento del paziente. Tuttavia, innesti vascolari ingegnerizzati in genere non sono facilmente scalabile, che richiede la fabbricazione di stampi personalizzati o tubi polimerici per personalizzare al formato, costituendo una pratica richiede tempo e costoso. arterie umane variano nel diametro del lume da circa 2,0-38 mm e spessore di parete da circa 0,5-2,5 mm. Abbiamo creato un metodo, definito il "Ring Metodo di impilamento", in cui gli anelli di dimensioni variabili di tessuto di tipo cellulare desiderato, hanno dimostrato qui con le cellule muscolari lisce vascolari (SMC), possono essere creati utilizzando le guide del centro messaggi per controllare il diametro del lume e gusci esterni di dettare spessore della parete del vaso. Questi anelli di tessuto vengono poi impilati per creare un costrutto tubolare, imitando la forma naturale di un vaso sanguigno. La lunghezza della nave può be adattato semplicemente impilando il numero di squilli richiesto per costituire la lunghezza necessaria. Con la nostra tecnica, tessuti di forme tubolari, simile ad un vaso sanguigno, possono essere facilmente realizzati in una varietà di dimensioni e lunghezze per soddisfare le esigenze della clinica e paziente.

Introduzione

Nel trattamento della malattia coronarica (CAD), propri vasi sanguigni del paziente vengono raccolte come materiale di innesto per un intervento chirurgico di bypass. Tuttavia, spesso, i malati non hanno vasi vitali per donare a se stessi, e nei casi in cui lo fanno, il sito donatore, reca notevole ulteriori danni e ha un serio rischio di infezione. ¹ innesti vascolari Engineered potrebbero soddisfare questa esigenza. La scalabilità è della massima importanza per le navi di ingegneria al fine di soddisfare la vasta gamma di requisiti di dimensione nave paziente. Tuttavia, i metodi attuali per le navi di ingegneria non sono facilmente scalabile, e in genere richiedono rigenerazione di stampi complessi o impalcature di polimeri. La maggior parte progettati innesti o utilizzano un ponteggio tubolare in polimero che viene seminato con fibroblasti vascolari, muscolari lisce, o cellule endoteliali; oppure rotolare una strato di cellule attorno ad un mandrino per creare un tubo di tessuto. Due innesti vascolari ingegnerizzate negli studi clinici si basano su un decellularized piattaforma di polimero-ECM. ^{2, 3, 4} innesti di polimeri disponibili per l'uso nella riparazione vascolare sono già noti per avere problemi con la pervietà, che potrebbero derivare da una questione importante con l'applicazione a lungo termine di un innesto con una presenza di polimero sostenuta. Stampi tubolari sono stati utilizzati per fabbricare navi completamente cellulari, ^{5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13} che procedure richiederebbe disegno aggiuntivo e produzione di utensili per stampi personalizzati per produrre navi in una varietà di formati .

Il metodo descritto nel presente documento comprende una tecnica innovativa per creare facilmente scalabile vascolare ingegnerizzatoinnesti utilizzando inserti stampati 3D personalizzabili e piastre di coltura tradizionali. ¹⁴ Le cellule vengono seminate in piastre con inserti di un palo centrale e guscio esterno. I controlli a lume di diametro e consente il monostrato cellulare di auto-assemblano in un anello di tessuto. I comandi guscio esterno spessore dell'anello, e quindi lo spessore della parete del recipiente finale. anelli di tessuto completati vengono quindi impilate a formare un tubolare, graft vascolare. Il vantaggio di questo metodo, definito il "Ring Metodo Stacking," è che qualsiasi tipo di cellule aderenti può essere seminato nel setup piastra e anelli di tessuto o tubi di qualsiasi dimensione necessaria per l'applicazione desiderata può essere generato semplicemente modificando inserti di guida. Tecniche comparative in Ingegneria dei Tessuti Creazione anelli di tessuto restano difficili in scala, ^{15, 16} che richiedono rigenerazione di stampi per ogni dimensione desiderata. Inoltre, innesti vascolari realizzati con questo metodo si possono produrred in 2-3 settimane, alcune settimane più veloce rispetto ad altre navi ingegnerizzati. ⁶ Per la clinica, questa volta discrepanza può fare una differenza significativa nel trattamento di un paziente deterioramento.

Protocollo

1. Colture cellulari Preparazione

1. Utilizzare aortica cellule muscolari lisce umane acquistati in commercio.
2. Mantenere le cellule della muscolatura liscia dei media la crescita delle cellule composte da 88,6% 231 mezzi di comunicazione, lo 0,1% ciascuno di insulina umana ricombinante (RH-insulina), ricombinante fattore di crescita dei fibroblasti umani (RH-FGF), ricombinante del fattore di crescita epidermico umano (RH-FGF), e acido ascorbico; e 5% ciascuno di siero bovino fetale (FBS) e L-glutammina; e 1% di antibiotici / antimicotici.
   NOTA: ogni fattore di crescita, FBS e L-glutammina vengono acquistati come kit di sviluppo multimediale vascolare.
3. Modificare i media ogni 48 ore fino a quando le cellule sono circa il 90% confluenti e pronti per la semina dei tessuti.
4. cellule Conservare in un incubatore tra i cambiamenti dei media per l'espansione.

2. Preparazione del 3D stampato Inserti e silicone abitudine modellata Piastre

1. Utilizzare una stampante 3D commerciale (ad esempio, Replicator Mini) per la stampa 3D gli inserti della piastra.
   1. utilizzare open software di progettazione 3D source come Blender per creare i modelli 3D degli esterni-conchiglie e messaggi stampati.
   2. Esportare file del driver del modello attraverso un formato STL consentendo la portabilità al software di stampa 3D.
   3. Produrre messaggi stampati e gusci esterni che utilizzano poli (acido lattico) filamento (PLA) caricati nella stampante 3D.
   4. Dopo la stampa, effettuare 30 minuti di ammollo in una soluzione di etanolo -100% al 70% per sterilizzare ogni inserto.
2. Preparare un agente di indurimento 01:10 basare miscela polimerica di poli (dimetilsilossano) (PDMS) polimero siliconico e consentire la miscela degassare a temperatura ambiente per 10 min.
   1. Definire i formati capsula di Petri utilizzati come piccoli (35 mm), intermedio (60 mm), e di grandi dimensioni (100 mm).
   2. Aggiungere 2 mL, 4 mL e 6 mL di silicone non polimerizzato ad ogni piccola, media e grande piastra, rispettivamente, e creare uno strato sottile su tutta la parte inferiore della capsula di Petri.
   3. Creare posti per il piccolo piatto versando PDMS in un100 millimetri piastra per un'altezza di 7 mm e permettono di curare su una piastra calda a 60 ° C per circa 2-3 ore. Quindi utilizzare una biopsia pugno da 5 mm per perforare i messaggi cilindrici. Utilizzare una piccola quantità di PDMS non vulcanizzati per fissare ciascun PDMS cilindro e al centro di ogni piastrina.
   4. Per le piastre intermedie e grandi, prima della completa maturazione dei PDMS nella parte inferiore della piastra, inserire i montanti 3D stampati rispettivamente 10 mm e 20 mm di diametro centrale in ciascun piastre intermedie e grandi,. Per i piatti di grandi dimensioni, inoltre posizionare un guscio esterno in 3D stampato circa 66,7 millimetri di diametro equidistanza dalla carica.
      1. Consentire ogni piatto per curare all'aperto su una piastra calda a 60 ° C per circa 2-3 ore, permettendo 18 ore per degasaggio del polimero. Fissare componenti stampati alla piastra nella regione e corretto orientamento, come mostrato nella Figura 1.
   5. Aggiungere una soluzione di etanolo al 70% con acqua distillata 30% per 30 minuti all'interno di tutti plates per la sterilizzazione e poi coprire ogni piatto.
   6. Con attenzione aspirare l'etanolo da ogni piatto e lasciare asciugare all'aria.
   7. Disporre ogni piatto in un armadio di sicurezza biologica (BSC) accanto al suo coperchio, a faccia in su. Esporre piastre e coperchi a luce UV con il BSC per 30 minuti per completare la sterilizzazione. tecnica sterile viene eseguita con ogni passo dopo l'esposizione ai raggi UV.

3. Preparazione di fibrina Hydrogel, semina con cellule della muscolatura liscia e la manutenzione delle piastre

1. Mescolare una soluzione di gel di fibrina contenente i media di crescita + 0,01% TGF-β1 nelle quantità di 0,5 ml, 1,1 ml e 1,81 ml per i piccoli, intermedi e grandi dimensioni piastra, rispettivamente.
   1. Aggiungere 40 ml, 88,4 ml e 145 ml di trombina, da uno stock di 100 U / mL, ai media di ciascuna piastra piccola, media e grande, rispettivamente. Scuotere con delicatezza ogni piatto a mano per garantire che la trombina è uniformemente mista ai mezzi di comunicazione.
   2. Successivamente, aggiungere 1601; L, 354 ml e 580 ml fibrinogeno, da uno stock di 20 mg / mL, goccia a goccia circolarmente alla miscela trombina-media per ogni piatto piccolo, intermedio e di grandi dimensioni, rispettivamente. Agitare delicatamente a mano per garantire la miscelazione di distribuzione e dell'idrogel in uno strato uniforme.
   3. Lasciare idrogel di cura per 10-15 minuti a temperatura ambiente.
2. Trypsinize cellule muscolari lisce espanse in piastre di coltura cellulare 150 mm e centrifugare secondo protocolli standard. Il pellet risultante deve essere risospeso in 3 ml di terreni di differenziazione costituito da 98% - 231 supporti, 1% FBS e 1% di antibiotici / antimicotici.
   1. Mescolare energicamente cellule titolando su e giù con una pipetta 2 ml per rompere eventuali grumi di cellule. Contare le cellule con un emocitometro e creare / mL per lastre piccole, intermedie e grandi rispettivamente una sospensione cellulare di 2 x 10 ⁶ cellule / ml, 1.0 x 10 ⁷ cellule / ml e 1,4 x 10 ⁷ cellule.
   2. Aggiungere 1 ml di ogni int sospensione cellulareOA corrispondenti 50 ml conica etichettato piccola, media e grande. Impostare un ulteriore 50 ml conica in questo modo per ogni anello di tessuto aggiuntivo desiderato.
   3. Aggiungere supporti differenziazione tra conica per ottenere volumi semina finali di 2 ml, 4 ml e 5 ml per ogni piccolo, intermedio e grande recipiente rispettivamente. Poi, pipettare attentamente la soluzione di cellule goccia a goccia in cima al idrogel preparati in ciascuna piastra corrispondente.
   4. Piastre Inserire nella incubatore a 37 ° C e 5% CO _2.
3. Modificare i media differenziazione ogni 48-72 ore per ogni piatto. Nel caso della piastra superiore, cambiare supporto inizialmente dopo 24 ore, poi sostituirlo ogni 48-24 ore per compensare la grande densità di semina cellulare.
   1. Dopo 2-4 giorni, come gli anelli saranno completamente contratta in verso il secondo palo, aggiungere 10 ml, 20 ml e 35 ml di TGF-β1 ad ogni piccolo, intermedio e grande anello, rispettivamente. Dopo l'esposizione a TGF-β; 1 per almeno 24 ore, anelli sono pronti per essere maneggiati.

4. Montaggio di Vascolare costruire e manutenzione

1. Prima della fabbricazione del costrutto finale vascolare, un contenitore speciale viene creato per contenere il vaso completato.
   1. Per la piccola imbarcazione, creare uno spazio alto per l'anello di impilamento tagliando una sezione 2 pollici fuori dalla parte superiore di una mL policarbonato tubo da 50 ml, quindi PDMS incollare il bordo tagliato in una piastra 35 mm. Utilizzare il coperchio conico come il coperchio piatto.
   2. Per la nave anello alto intermedio e grande accatastamento piatti, tagliare un tubo in policarbonato di diametro 1,75 pollici in sezioni da 2,5 pollici della lunghezza di servire come le pareti della piastra alte. Per il fondo piatto alti, tagliare una lastra di policarbonato 0,125 pollici di spessore in pezzi diametro del cerchio da 2 pollici. Utilizzando acrilico incollaggio, legare la sezione tubo in policarbonato per il pezzo tagliato circolare. Utilizzare il coperchio da una capsula di Petri 60 millimetri come coperchio per la targa alta.
   3. 3D pmessaggi Rint 5, 10 e 20 mm di diametro e 50 mm di lunghezza.
   4. Aggiungere 10 ml di silicone non polimerizzato per ogni contenitore. Prima della polimerizzazione completa delle PDMS, posizionare centralmente ogni post creato nel passaggio 4.1.3 in ogni piccolo, intermedio e grande contenitore.
   5. Lasciare catalizzare su un insieme piastra calda a 60 ° C per 2-3 ore.
   6. Sterilizzazione con una soluzione di etanolo al 70% con acqua distillata 30% per 30 minuti.
   7. Con attenzione aspirare l'etanolo da ogni contenitore e poi lasciare asciugare all'aria nel BSC. Successivamente, sistemare i contenitori nella cappa con ogni piatto posto accanto al suo coperchio, a faccia in su. Esporre i contenitori alla luce UV sotto il BSC per altri 30 minuti per un'ulteriore sterilizzazione. Utilizzare tecnica sterile ad ogni passo dopo l'esposizione ai raggi UV.
2. Utilizzando pinze molto fine, rimuovere con attenzione ogni anello idrogel muscolatura liscia strettamente arrotolato dal suo posto e trasferire al suo contenitore più grande in corrispondenza con i posti alti.
   1. Utilizzare un paio dipinze in ogni mano e sollevare un lato dell'anello dal palo, e poi l'altro. Fare attenzione a proteggere e mantenere il lume.
   2. Eseguire il trasferimento con questo metodo due mani, scorrevole primo lato, poi l'altro lato dell'anello sul montante alto. Utilizzando dolci, movimenti graduali, e lavorando circonferenziale, spingere lentamente l'anello verso il basso sul montante alto. Successivamente impilare anelli di tessuto fino alla lunghezza dell'imbarcazione desiderata è stata ottenuta, con ciascun anello aggiungendo circa 1-2 mm di lunghezza costrutto completata.
3. Con lo stack anello posizionate sui montanti 3D stampati alti, ruotare la piastra in modo che il post è parallelo alla superficie di lavoro.
   1. Usando una micropipetta, aggiungere 40, 80 e 160 ml di trombina ad una concentrazione di 100 U / mL delicatamente la superficie esterna di ciascun piccola, media e grande recipiente rispettivamente. Mentre l'aggiunta di trombina, ruotare lentamente la piastra di garantire anche la copertura di tutte le superfici del costrutto.Questa sarà la base per la colla di fibrina utilizzato per fissare il costrutto pila anello nei primi giorni dopo la costruzione.
   2. Successivamente, aggiungere 40, 80 e 160 ml di fibrinogeno ad una concentrazione di 20 mg / mL di ogni piccolo, intermedio, e grandi costrutto rispettivamente, utilizzando una micropipetta ruotando il costrutto rapidamente. La trombina e fibrinogeno rapidamente impostare in un gel solido, una volta mescolati. A causa del tempo di indurimento breve, applicare il fibrinogeno più rapidamente e uniformemente possibile.
4. Aggiungere 20 ml di media differenziazione per ogni recipiente contenente il costrutto. Posizionare i vasi in un incubatore a 37 ° fino a quando necessario. Cambiare i media ogni 3-5 giorni.

Risultati

Dimostrato qui è fabbricazione di 3 formati differenti graft vascolari ingegnerizzati (Figura 1), dimostrando che il Metodo di impilamento Ring (RSM) è scalabile. Per dimostrare l'applicabilità, i 3 formati differenti vaso scelto correlato alle effettive dimensioni delle navi umano per la discendente anteriore sinistra (piccolo; lume diametro = 4 mm) ^17, aorta discendente (intermedio; diametro del lume = 10 mm) e dell'aorta ascendente (...

Discussione

Il metodo Stacking anello presenta molteplici vantaggi rispetto ingegneria tessutale attuali tecniche costrutto vascolari. La RSM può essere adattato per creare vasi umani di qualsiasi dimensione, semplicemente personalizzare le dimensioni postali e guscio esterno. Il nostro metodo permette lo sviluppo dei vasi ingegnerizzati libera polimero-composte unicamente da cellule umane e rapidamente degradare il materiale di supporto si trovano in processo di guarigione delle ferite naturale del corpo. innesti polimeri sono no...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Aortic Smooth Muscle Cells	ATCC	PCS-100-012	vascular smooth muscle cells
Medium 231	Gibco (Life Technologies	M-231-500	media specific to vascular smooth muscle cells
Human Aortic Smooth Muscle Cell Growth Kit	ATCC	PSC-100-042	growth factors for maintaining vascular smooth muscle cell viability
Replicator Mini 3D printer	MakerBot	N/A	3D printer
Poly(lactic acid) 3D ink (PLA)	MakerBot	N/A	3D printer filament
Poly(dimethlysiloxane) (PDMS)	Ellworth Adhesives	3097358-1004	polymer for gluing plate parts
Fibrinogen	Hyclone Labratories, Inc.	SH30256.01	fibrin gel component
Thrombin	Sigma Life Sciences	F3879-5G	fibrin gel component
Tranforming Growth Factor-Beta 1	PeproTech	100-21	growth factor for stimulating collagen production
Hemocytometer	Hausser Scientific Co.	3200	for cell counting
Polycarbonate tubing	US Plastics	PCTUB1.750X1.625	material for making tall, ring stacking plates
Polycarbonate sheet	Home Depot	409497	material for making tall, ring stacking plates
Adhesive polymer solvent	SCIGRIP	10799	material for making tall, ring stacking plates
Instron 5940	Instron	N/A	tensile testing machine
U-Stretch	Cell Scale	N/A	tensile testing machine
Smooth Muscle Actin	MA5-11547	Thermo Fisher	antibody
Tropomyosin	MA5-11783	Thermo Fisher	antibody