Quantificazione assoluta di A?<sub&gt; 1-42</sub&gt; In CSF Utilizzando un riferimento alla procedura di misurazione di massa spettrometrica

Riepilogo

A reference measurement procedure for the absolute quantification of Aβ_1-42 in human CSF based on solid-phase extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry is described.

Abstract

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the diagnosis of AD is based on cognitive tests and mental state exams, but the peptide amyloid-beta (Aβ) in cerebrospinal fluid (CSF) is increasingly used in clinical trials and settings. As for most protein and peptide biomarkers, quantification is performed using antibody-based techniques, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). However, intra- and inter-laboratory variability in these assays hamper its use as a diagnostic marker in clinical routine.

An antibody-independent Reference Measurement Procedure (RMP) was developed based on solid-phase extraction (SPE) and liquid chromatography (LC)-tandem mass spectrometry (MS/MS), where stable, isotope-labeled Aβ peptides were used as internal standards, enabling absolute quantification. A high-resolution quadrupole-orbitrap hybrid instrument was used for the measurements. The method allows for the quantification of CSF Aβ_1-42 between 150-4,000 pg/mL.

Introduzione

La malattia di Alzheimer (AD) è la forma più comune di demenza e colpisce circa 35 milioni di persone in tutto il mondo ^1. Le caratteristiche neuropatologici della malattia ampiamente creduto di essere al centro della patogenesi sono grovigli neurofibrillari intracellulari di hyperphosphorylated proteina tau ² e placche extracellulari costituito da (Ap) peptidi ³ aggregati beta-amiloide. In linea con questo, la valutazione della patologia placca in vivo da biomarcatori è stato recentemente inserito nei criteri diagnostici di ricerca per AD ^4. Per misurazioni CSF di Ap _1-42, vari test immunologici sono disponibili e sono utilizzati in molti laboratori clinici ^5. La concentrazione di Ap _1-42 in CSF è inferiore di circa il 50% in pazienti con AD rispetto al cognitivo normale anziani, riflettendo la deposizione del peptide in placche nel brain ^{6, 7.}

Questi biomarcatori sono principalmente analizzati utilizzando saggi immunologici (ad esempio, le tecniche a base di anticorpi), ma questi test possono essere influenzati da effetti di matrice ^8. L'uso di saggi immunologici su piattaforme tecnologiche diverse e la mancanza di test di standardizzazione ^{9, 10} rende l'introduzione di concentrazioni di cut-off globali difficili ^{11, 12.} Un RMP analiticamente convalidato avrebbe permesso la calibrazione uniforme delle piattaforme di analisi diverse, idealmente con conseguente migliore comparabilità tra le piattaforme di analisi e in un migliore controllo dei fattori che contribuiscono alla variabilità complessiva di misura.

La quantificazione assoluta di Ap _1-42 con il metodo LC-MS / MS sviluppata supera molti dei problemi connessi con tecn a base di anticorpiiques. Il metodo, indicato come un RMP dal comitato misto per la tracciabilità in Medicina di Laboratorio (JCTLM archivio di identificazione numero C11RMP9), sarà utilizzato per determinare la concentrazione assoluta di Ap _1-42 in un materiale di riferimento certificato (CRM) per armonizzare CSF Ap ₁ misurazioni _-42 attraverso tecniche e piattaforme analitiche. Il flusso di lavoro descritto deve essere rilevante per lo sviluppo di metodi di riferimento candidato per peptidi e proteine ​​all'interno di altre aree della medicina.

Protocollo

NOTA: Questo protocollo richiede aliquote di almeno 50 ml, con una concentrazione di 50 mg / ml per ciascun peptide Ap, come materiale di partenza. I peptidi Ap vanno dissolte in 20% acetonitrile (ACN) e il 4% di soluzione di ammoniaca concentrata in acqua deionizzata (v / v) e conservati a 80 ° C.

Attenzione: Vedi Tabella 1 per le informazioni di sicurezza.

1. preparazione delle soluzioni

1. Preparare 100 ml di 20% ACN e 4% ammoniaca concentrata in acqua deionizzata (v / v) diluendo 20 mL di ACN e 4 ml di ammoniaca concentrata (~ 25%) in acqua deionizzata. Regolare il volume finale a 100 ml con acqua deionizzata. Fare fresco tutti i giorni.
2. Preparare 50 mL di 5 M guanidina cloridrato sciogliendo 26,08 g di guanidina cloridrato in acqua deionizzata fino ad un volume finale di 50 ml. Conservare a 20 ° C e fare mensile fresco.
3. Preparare 200 ml di acido fosforico 4% in acqua deionizzata (v /v) diluendo 9,4 mL di acido fosforico concentrato (~ 85%) in acqua deionizzata. Regolare il volume finale a 200 ml con acqua deionizzata. Conservare in frigorifero e fare settimanale fresco.
4. Preparare 50 mL di 75% ACN e ammoniaca concentrata 10% (v / v) in acqua deionizzata diluendo 37,5 mL di ACN e 5 ml di ammoniaca concentrata (~ 25%) in acqua deionizzata. Regolare il volume finale di 50 ml con acqua deionizzata. Fare fresco tutti i giorni.
5. Scongelare almeno 2,5 ml di CSF umano per i calibratori, ottenuti da campioni avanzi de-identificato da analisi cliniche di routine.
6. Preparare CSF artificiale contenente 150 mM Na, 3,0 mM K, 1.4 mM Ca, Mg 0,8 mM, 1,0 mM P, e 155 mM Cl in acqua deionizzata e aggiungere sieroalbumina bovina ad una concentrazione finale di 4 mg / mL. Solo 1 ml è necessaria per l'analisi, ma preparare un grande volume, un'aliquota di esso, e conservare per uso futuro.

2. Preparazione dei calibratori

1. Preparare 0,5 ml di 4 mg / ml ¹5 NAβ _1-42 peptide aggiungendo 40 ml di 50 mg / mL ¹⁵ NAβ ₁₄₂ al 0.46 mL di 20% ACN e ammoniaca concentrata 4% in una provetta da 0,5 ml. Miscelare con un miscelatore vortex per 1 minuto.
2. Preparare 2 mL di 100 ng / mL ¹⁵ NAβ _1-42 peptide aggiungendo 50 ml di 4 mg / mL ¹⁵ NAβ ₁₄₂ al 1.95 mL di 20% ACN e ammoniaca concentrata 4% in una provetta 2 mL. Miscelare con un miscelatore vortex per 1 minuto.
3. Preparare sei soluzioni calibratori (AF) mescolando i volumi di ogni soluzione indicata nella tabella 2. Utilizzare 0.5, 1.5, e 2 tubi ml microcentrifuga. Miscelare con un miscelatore vortex per 1 minuto.
4. Preparare i calibratori finali (in duplicato) in 0,5 ml microprovette con l'aggiunta delle soluzioni di taratura corrispondenti e CSF umano secondo la Tabella 3. Mix su un vortex per 1 minuto.

3. Preparazione dello standard interno

1. Preparare 2 ml di 0,8 mg / mL ¹³ CAβ _1-42 peptide aggiungendo 32 ml di 50 mg / mL ¹³ CAβ ₁₄₂ al 1.968 ml di 20% ACN e ammoniaca concentrata 4% in una provetta 2 mL. Miscelare con un miscelatore vortex per 1 minuto.
2. Preparare 5 ml di 16 ng / mL ¹³ CAβ _1-42 peptide aggiungendo 0,1 ml di 0,8 mg / ml a 4,9 ml di 20% ACN e ammoniaca concentrata 4% in una provetta da microcentrifuga 5. Miscelare con un miscelatore vortex per 1 minuto.

4. Preparazione del campione Fattore di risposta

NOTA: Il fattore di risposta (RF) determinazione è eseguita per determinare la concentrazione del peptide marcato usato per la calibrazione ⁽¹⁵ NAβ _1-42). Ciò richiede che la concentrazione del nativo Ap _1-42 peptide è stata determinata tramite analisi amminoacidica (AAA). Così, il volume e la concentrazione di nativi aliquote peptide Ap _1-42necessità di soddisfare i requisiti del AAA.

1. Preparare 0,5 ml di 4 mg / ml nativo (senza etichetta) ^Ap _1-42 con l'aggiunta di 40 ml di 50 mg / ml nativo Ap _1-42 a 0,46 ml del 20% ACN e ammoniaca concentrata 4% in una provetta da 0,5 ml. Miscelare con un miscelatore vortex per 1 minuto.
2. Preparare un 2-ml 40 ng mL mix di nativi e ¹⁵ NAβ _1-42 / aggiungendo 20 ml di 4 mg / ml nativo Ap _1-42 e 20 ml di 4μg / mL ¹⁵ NAβ _1-42 a 1,96 ml del 20% ACN e 4% concentrate di ammoniaca in una provetta da microcentrifuga 2. Miscelare con un miscelatore vortex per 1 minuto.
3. Aggiungere 20 ml di 40 ng / mL mix di 0,38 ml di liquido cerebrospinale artificiale in una provetta 0,5 microcentrifuga. Preparare i duplicati e mescolare su un vortex per 1 minuto.

Preparazione del campione 5.

NOTA: Scongelare i campioni da misurare a temperatura ambiente su un rullo stanza.

1. Aggiungere 0,18 ml di ogni calibratore, fattore di risposta, e campione non noto (compreso il controllo di qualità [QC] campioni, se utilizzato) ad una piastra a 96 profondo bene 1 proteina mL, secondo la figura 1 (assumendo un piatto pieno è utilizzato). Assicurarsi di aggiungere i campioni in, o in prossimità, il fondo dei pozzetti.
2. Aggiungere 20 ml di standard interno ad ogni pozzetto (ad esempio, calibratori, i fattori di risposta, QC, e le incognite); è fondamentale per rilasciare la goccia sul lato del pozzo vicino alla superficie del campione senza immergendo la punta della pipetta.
3. Aggiungere 0,2 ml di 5 M guanidina-cloridrato in ciascun pozzetto.
4. Posizionare il piatto del campione, un vortex e miscelare i campioni per 45 min a 1100 rpm. La frequenza ottimale potrebbe differire a seconda della strumentazione. Impostare la frequenza e l'ampiezza del mixer in modo che le soluzioni sono accuratamente miscelati e non gocce di standard interno o CSF ​​sono lasciati non miscelato sul lato dei pozzetti.
5. Aggiungere 0,2 ml di acido fosforico 4%in ciascun pozzetto. Vortex mescolare brevemente.

6. estrazione in fase solida

NOTA: In tutte lavaggio, carico, e passi di eluizione, applicare il vuoto più basso possibile, dopo l'aggiunta della soluzione e aumentare gradualmente come necessario per caricare o eluire la soluzione. Disabilitare il vuoto tra ogni carico e passo eluizione.

1. Mettere un vassoio di serbatoio per i rifiuti sotto una modalità mista, scambio cationico, 96 pozzetti estrazione in fase solida (SPE) placca nella camera di collettore piatto di estrazione.
2. Condizionare la assorbente SPE con l'aggiunta di 0,2 ml di metanolo ad ogni pozzetto.
3. Equilibrare il sorbente aggiungendo 0,2 mL di acido fosforico 4% a ciascun pozzetto.
4. Trasferire tutti i campioni (circa 0,62 ml in ogni pozzetto) dalla piastra profondo bene alla piastra SPE. Utilizzare una pipetta a otto canali per il trasferimento dei campioni dalla piastra profondo bene alla piastra SPE; non è cruciale per la trasmissione completa o volumi uguali di tutti i campioni, poiché i campioni contengono un internoal standard che compensare le variazioni.
5. Lavare il sorbente dopo i campioni hanno attraversato aggiungendo 0,2 mL di acido fosforico 4% a ciascun pozzetto.
6. Dopo che il solvente di lavaggio è eluito dalla sorbente, sostituire il vassoio serbatoio con una piastra di raccolta o tubi.
7. Eluire il campione dalla sorbente di due volte aggiungendo 50 ml di 75% ACN / 10% ammoniaca concentrata e notare che questa soluzione richiede molto basso vuoto per passare attraverso l'assorbente. Ricordarsi di disattivare il vuoto tra ogni aggiunta.
   1. OPTIONAL: Sigillare la piastra di raccolta o tubi e congelarli a -80 ° C. Rimuovere il sigillo dalla piastra raccolta o tubi prima di procedere al punto 6.8.2.
   2. Asciugare le eluati utilizzando centrifugazione a vuoto (senza applicazione di calore); questo può richiedere da una a diverse ore, a seconda della centrifuga a vuoto.
   3. Sigillare i contenitori e congelarli a -80 ° C.

7. chromato Liquidgrafia

1. Preparare fase mobile A (5% ACN e ammoniaca concentrata 0,3% in acqua deionizzata [v / v]), B (acqua deionizzata 4% e ammoniaca concentrata 0,1% in ACN [v / v]), e lavaggio dell'ago (50% ACN e 4% concentrato ammoniaca in acqua deionizzata [v / v]).
   1. Per 500 ml di fase mobile A, aggiungere 25 ml di ACN e 1,5 ml di ammoniaca concentrata di acqua deionizzata. Regolare il volume finale a 500 ml con acqua deionizzata.
   2. Per 500 ml di mobili fase B, aggiungere 500 ml di ammoniaca concentrata e 25 ml di acqua deionizzata ad ACS. Regolare il volume finale di 500 ml con ACN.
   3. Preparare 250 ml di lavaggio dell'ago aggiungendo 120 mL di ACN e 10 ml di ammoniaca concentrata di acqua deionizzata. Regolare il volume finale a 250 ml con acqua deionizzata.
   4. Mettere il fasi mobili A e B e lavare l'ago bottiglie aperte in un bagno di ultrasuoni per 20 minuti prima di utilizzarlo con il sistema LC
2. Sciogliere ogni campione con 25 ml di 20% ACN e il 4% Concentrasoluzione di ammoniaca Ted e metterli su un agitatore per 20 min. Centrifuga verso il basso i campioni e metterli nel campionatore automatico (tenere a 7 ° C).
3. Iniettare 20 ml di campione su un 1 x 250 mm ² polistirene-divinilbenzene (fase inversa) colonna monolitica mantenuta a 50 ° C.
   1. Utilizzare il gradiente LC mostrato nella Tabella 4 con una portata di 0,3 mL / min. Deviazione i primi due e gli ultimi cinque minuti sprecare (post-colonna) mediante una valvola di deviazione per ridurre la contaminazione dello spettrometro di massa.

Analisi 8. Messa spettrometrica

NOTA: Questi parametri sono stati utilizzati per uno spettrometro di massa ibrido quadrupolo-Orbitrap dotato di aheated sorgente di ionizzazione elettrospray.

1. Impostare i parametri per la sorgente di ioni secondo la tabella 5.
2. Impostare lo strumento MS per isolare i 4+ carica stati di natale Ap _1-42 (1,129.48 di massaa-charge ratio [m / z]), ¹⁵ NAβ _1-42 (1,143.00 m / z), e ¹³ CAβ _1-42 (1,179.50 m / z) nell'analizzatore di massa a quadrupolo con una larghezza isolamento di 2,5 m / z.
3. Frammentare i peptidi isolati nella cella di collisione con un'energia di collisione normalizzata (NCE) di 17,0. Questo potrebbe essere necessario sintonizzati per ogni strumento, anche dello stesso tipo (e soprattutto se si utilizzano altri tipi di strumenti, come un triplo quadrupolo MS).
4. Registrare il spettri frammento con una risoluzione di 17.500, con un obiettivo di controllo automatico del guadagno di 2 x 10 ⁵ cariche e un tempo massimo di iniezione di 250 ms.

9. Elaborazione dati

1. Utilizzare la somma degli ioni prodotto (con una tolleranza massa di ± 250 unità di massa milli [MMU]) nella Tabella 6, per calcolare le aree cromatografiche per ciascun peptide. Si noti che i tipi di ioni ed i numeri sono indicati solo per Ap nativo _{ioni 1-42 di prodotto, dal momento che sono gli stessi per entrambi ¹⁵ NAβ 1-42 e ¹³ CAβ 1-42.}
2. Determinare il fattore di risposta media dei due campioni fattore risposta dividendo l'area sotto la curva (picco cromatografico) del ¹⁵ NAβ _1-42 con l'area sotto la curva del nativo Ap _1-42.
3. Regolare la concentrazione del ¹⁵ NAβ _1-42 utilizzata per la calibrazione, moltiplicandolo per il fattore di risposta calcolato nel passo 9.2.
4. Costruire una curva di taratura riportando i rapporti di superficie di ¹⁵ NAβ _1-42 al ¹³ CAβ _1-42 da due serie di calibratori contro la concentrazione.
5. Calcolare la pendenza e intercetta della curva di calibrazione utilizzando la regressione lineare.
6. Calcolare il rapporto di nativo Ap _1-42 area a standard interno ⁽¹³ CAβ _1-42) per uncampioni noti.
7. Estrapolare la concentrazione dei campioni sconosciuti dalla curva di calibrazione utilizzando la pendenza e l'intercetta ottenuto nel passaggio 9.5.

Risultati

Il setup piatto in Figura 1 è utilizzato per un piatto pieno di campioni. Se un minor numero di campioni sconosciuti sono da analizzare, il secondo calibratore, set RF, e QC deve essere posto dopo la prima metà dei campioni sconosciuti.

Come si vede nella figura 2, i calibratori sono vicini alla linea di regressione, con basse deviazioni standard. Questo metodo ha un livello inferiore di qua...

Discussione

Per il metodo descritto, invece di utilizzare una matrice surrogata, abbiamo usato il metodo surrogata analita ^{13, 14, 15, 16,} che consente la calibrazione in CSF umano. L'approccio analita surrogato coinvolge due diversi standard marcati con isotopi. Uno ⁽¹⁵ NAβ ₁₄₂₎ è utilizzato per generare la curva di calibrazione in CSF umano, mentre un altro ⁽¹³ CA?...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL	Eppendorf	022431081
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Eppendorf	022431081
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL	Eppendorf	022431102
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL	Eppendorf	0030 108.310
Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96	Eppendorf	951032905
Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom	Micronic	MPW32071BC3	Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates.
Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes	Micronic	MP53026	Caps for Micronic tubes.
Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded	Micronic	MPW51015BC3	Holder for Micronic tubes.
Biohit Optifit tips 1.2 mL	Sartorius	791210	Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well.
Waters Oasis MCX 96-well µElution Plate	Waters	186001830BA
Waters Plate manifold reservoir tray	Waters	WAT058942
Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates	Waters	186001831
Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis	Sigma-Aldrich	30501-1L-D
Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L	Fisher Scientific	A/0627/17X
ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur	Merck Millipore	1005731000
Guanidine Hydrochloride, 500 g	Thermo Scientific	24110
Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFALGMAZR	With bundled Dionex Ultimate 3000 LC & autosampler.
Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm)	Dionex	066640
Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated	Sigma-Aldrich	B6917
Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA	rPeptide	A-1002-2
15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled	rPeptide	A-1102-2
13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled	rPeptide	A-1106-2
Microplate shakers, TiMix 2	Edmund Bühler	6110 000