Analizzando dendritiche Morfologia in colonne e strati

Riepilogo

Qui mostriamo come analizzare dendritica instradamento dei neuroni midollo Drosophila in colonne e strati. Il flusso di lavoro comprende una tecnica di imaging dual-view per migliorare la qualità delle immagini e strumenti computazionali per tracciare, registrare mandrini dendritiche alla matrice di colonna di riferimento e per analizzare le strutture dendritiche nello spazio 3D.

Abstract

In molte regioni del sistema nervoso centrale, come le mosche lobi ottici e corteccia vertebrato, circuiti sinaptici sono organizzati in strati e colonne per facilitare il cablaggio cervello durante lo sviluppo e l'elaborazione delle informazioni in animali sviluppati. neuroni post-sinaptici dendriti elaborati nei modelli specifici del tipo a livelli specifici di sinapsi con opportuni terminali presinaptici. Il neuropil mosca midollare è composto da 10 livelli e circa 750 colonne; ogni colonna è innervato dal dendriti di oltre 38 tipi di neuroni midollo, che corrispondono con i terminali degli assoni di alcuni 7 tipi di afferenze in maniera specifica per tipo. La presente relazione illustra le procedure per l'immagine e analizzare dendriti dei neuroni midollo. Il flusso di lavoro prevede tre sezioni: (i) la sezione di imaging dual-view combina due pile immagine confocale raccolti a orientamenti ortogonali ad alta risoluzione di immagini 3D di dendriti in; (Ii) il dendrite tracciamento e la sezione di registrazione tracce dendritichepergole in 3D e registri tracce dendritiche nella matrice colonna di riferimento; (Iii) la sezione di analisi dendritica analizza i modelli dendritiche rispetto alle colonne e strati, tra cui la direzione di terminazione e la proiezione planare specifico strato di gazebo dendritiche, e deriva stime di frequenze ramificazione e terminazione dendritiche. I protocolli utilizzano plug-in personalizzati costruiti sulla MIPAV open-source (Medical Imaging elaborazione, l'analisi e la visualizzazione) di piattaforma e personalizzati toolbox nella lingua di laboratorio della matrice. Insieme, questi protocolli forniscono un flusso di lavoro completo per analizzare l'instradamento dendritica di Drosophila neuroni midollo in strati e colonne, per identificare i tipi di cellule, e determinare difetti di mutanti.

Introduzione

Durante lo sviluppo, i neuroni dendriti elaborati in complesse ma stereotipati modelli ramificati per formare sinapsi con i loro partner presinaptici. modelli di ramificazioni dendritiche correlano con l'identità e le funzioni dei neuroni. Le posizioni di pergole dendritiche determinano il tipo di ingressi presinaptiche che ricevono, mentre il dendritica ramificazione complessità e dimensioni del campo governano il numero di input. Così, dendritiche proprietà morfologiche sono fattori determinanti per la connettività sinaptica e computazione neuronale. In molte regioni del cervello complessi, come le mosche lobi ottici e retina dei vertebrati, circuiti sinaptici sono organizzati in colonne e strati per facilitare l'elaborazione delle informazioni ^{1, 2.} In una tale organizzazione colonna e strato, neuroni presinaptici di un distinto assoni progetto modalità per terminare a un livello specifico (cosiddetto targeting specifico-layer) e per formare un ordinato matrice bidimensionale (i called mappa topografica), mentre i neuroni postsinaptici estendono dendriti di dimensioni adeguate a livelli specifici per ricevere gli ingressi presinaptici dei tipi e dei numeri corretti. Mentre assonale mira a strati e le colonne è stato ben studiato ^{3, 4,} e tanto meno si sa su come dendriti vengono indirizzati a livelli specifici e si espandono opportunamente dimensionate campi recettivi per formare connessioni sinaptiche con la corretta partner presinaptica ^5. La difficoltà di imaging e quantificare dendritiche mira a strati e le colonne ha ostacolato lo studio dello sviluppo dendritiche nelle strutture cerebrali colonnari e laminati.

Drosophila neuroni midollo sono un modello ideale per lo studio di routing dendritiche e montaggio del circuito in colonne e strati. Il neuropil mosca midollare è organizzato come un reticolo 3D di 10 strati e circa 750 colonne. Ogni colonna è innervato da un insieme di afferenze, tra cui photoreceptors R7 / R8 e neuroni lamina L1 - L5, i cui terminali assonale formare le mappe topografiche in maniera specifica strati ^6. Circa 38 tipi di neuroni midollo sono presenti in ogni colonna di midollo e dendriti elaborati in strati specifici e con adeguati dimensioni del campo per ricevere input da queste afferenze ^7. I circuiti sinaptici nel midollo sono state ricostruite a livello microscopico elettronico; in tal modo, le partnership sinaptiche sono ben stabiliti ^{7, 8.} Inoltre, strumenti genetici per l'etichettatura di vari tipi di neuroni midollo sono disponibili ^{9, 10, 11.} Esaminando tre tipi di transmedulla (TM) neuroni (Tm2, TM9 e TM20), abbiamo già individuato due-specifica delle cellule di tipo attributi dendritiche: (i) i neuroni proiettano Tm dendriti in entrambe le direzione anteriore o posteriore (Proj planareezione direzione), a seconda dei tipi di cellule e (ii) dendriti dei neuroni midollo terminare in strati midollo specifici in un modo specifico tipo cellulare (terminazione specifico layer) ^12. Planar direzione di proiezione e terminazione specifici strati sono sufficienti per differenziare questi tre tipi di neuroni Tm, mentre le mutazioni che sconvolgono le risposte TM per spunti di livello e colonna riguardano aspetti distinti di questi attributi.

Qui, vi presentiamo un flusso di lavoro completo per l'esame della patterning dendritica dei neuroni midollo Drosophila in colonne e strati (Figura 1). Innanzitutto, mostriamo un metodo di imaging dual-view, che utilizza software personalizzato per unire due immagine confocale pile per generare immagini isotrope alta qualità. Questo metodo richiede solo la microscopia confocale convenzionale per generare immagini di alta qualità che consentono la tracciabilità affidabile di rami dendritici, senza ricorrere alla microscopia super-risoluzione, ad unas STED (emissione stimolata Depletion) o l'illuminazione strutturale. In secondo luogo, vi presentiamo un metodo per tracciare pergole dendritiche e per registrare le tracce dei neuriti conseguenti ad una matrice di colonna di riferimento. Terzo, mostriamo i metodi di calcolo per estrarre informazioni sulla direzione di proiezione planare e terminazione specifico strato di dendriti, nonché per derivare stime per frequenze ramificazione e terminazione dendritiche. Insieme, questi metodi consentono la caratterizzazione di modelli dendritiche in 3D, la classificazione di tipi cellulari basate su morfologie dendritiche, e l'identificazione di potenziali difetti nei mutanti.

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Protocollo

Nota: Il protocollo contiene tre sezioni: dual-view di imaging (sezioni 1 - 3), tracciamento dendritiche e registrazione (sezioni 4 - 6), e l'analisi dendritiche (sezione 7 - 9) (Figura 1). I codici e file di esempio sono riportati nella Tabella dei materiali / attrezzature.

1. Dual-Image Acquisition

NOTA: Questo passaggio è progettato per acquisire due pile di immagini del neurone di interesse in orientamenti due ortogonali (orizzontali e frontali).

1. Preparare cervelli mosca che contengono scarsamente etichettati neuroni midollo (~ 10 cellule / cervello lobo) con un pennarello GFP membrana (mCD8GFP), come descritto in precedenza ^12. Colorare il cervello con coniglio anti-GFP (per dendriti dei neuroni midollare) e mouse mAb24B10 (per gli assoni dei fotorecettori), anticorpi primari, e anticorpi secondari fluorescenti (Alexa 488 anti-coniglio e Alexa 568 anticorpi anti-topo), come descritto in precedenza13. Cancellare il cervello in 70% glicerolo in PBS 1x.
2. Per montare il cervello in orientamento orizzontale (figure 2A, B), trasferire la mosca cervello glicerolo-cancellata per una goccia 20 ml di mezzo di montaggio antifade nel centro di una diapositiva.
3. Fissare piccole macchie di argilla ai 4 angoli del vetrino per evitare che il vetrino dalla frantumazione campione cervello durante il montaggio.
   NOTA: Le patch di argilla forniscono ammortizzazione per evitare che il vetrino dalla frantumazione del campione. Ogni cerotto argilla dovrebbe essere di circa 1 mm di diametro.
4. Sotto un microscopio da dissezione, posizionare il cervello in posizione ventrale-up e posizionare il coprioggetto sopra per fissare il cervello. Utilizzare la superficie dorsale convessa del cervello come punto di riferimento per identificare l'orientamento del campione cerebrale (Figura 2A).
5. Ottenere la prima serie di immagini (vista orizzontale) con un microscopio confocale. Utilizzare una lente obiettivo ad alta NA (come ad esempio un 63X 1.3 NA glicerolo o immersione in olio objective obiettivo) e 2,5 volte lo zoom digitale (la dimensione dei pixel è 0,105 micron per pixel, il numero di media è 2). Acquisire più di 180 sezioni ottiche (512 x 512 pixel) per coprire il neuropil midollare con un passo di 0,2 micron.
6. Rimontare il cervello, come descritto nei punti 1.3 - 1.4, ma allineare il cervello in posizione antero-up (vista frontale).
7. Acquisire la seconda pila di immagini (vista frontale) dello stesso neurone, come descritto al punto 1.5.
   NOTA: Trovare lo stesso neurone potrebbe essere difficile quando ci sono numerosi neuroni marcati nel lobo ottico. Per identificare gli stessi neuroni da entrambi gli orientamenti, in basso a ingrandimento immagine pile da entrambe le visualizzazioni possono essere richiesti (ad esempio, utilizzare uno zoom di 0.7, e un passo di 0,45 micron di acquisire pile di immagini a bassa risoluzione). Se l'immagine più grande di 512 x 512, l'immagine deve essere ritagliata a 512 x 512 prima di combinazione delle immagini, e la dimensione dei pixel dovrebbe tenere a 0,105 micron per pixel, mentre l'imaging del grande campo. Perdita del segnaleè un potenziale problema per il tessuto profondo. Se il segnale è debole, immagine metà ventrale del cervello. Per ridurre photobleaching durante la scansione, usare partire una potenza del laser il più possibile. Utilizzare l'indicatore di gamma per verificare la presenza di sovraesposizione prima di acquisire pile di immagini. Se possibile, utilizzare un microscopio confocale dotato di rilevatori GaAsP.
8. Identificare e registrare la posizione del neurone di interesse rispetto al neuropil midollare (destra / sinistra [R / L] e dorsale / ventrale [D / V]). Controllare se il campione spostato durante l'acquisizione dell'immagine esaminando la pila.
   NOTA: Il campione in movimento è spesso a causa di un montaggio non corretto. Se si verifica il movimento del campione, lo stack immagine non può essere utilizzato per la registrazione e deve essere eliminato. Rimontare il campione e acquisire pile di immagini dallo stesso neurone.

2. Immagine Deconvoluzione

NOTA: Il passo deconvoluzione utilizza il software immagine deconvoluzione per ripristinare le immagini acquisite che vengono degradate sfocandoe rumore. Anche se questo passaggio è facoltativo, migliora in modo significativo la qualità delle immagini. Si consiglia di usare pile di immagini deconvolved per la registrazione di immagini e la combinazione nella sezione 3.

1. Avviare il programma di deconvoluzione in modalità interattiva. Caricare la pila di immagini (in LSM o in formato microscopico specifica) scegliendo Menu: File / Open (o Ctrl-o) nella finestra principale.
2. Fare clic per selezionare lo stack immagine caricata e scegliere il menu: Ops per aprire la finestra di operazione di immagine. Utilizzare l'algoritmo di default Classic stima di massima verosimiglianza (CMLE).
3. Nella finestra di operazione di immagine, fare clic sulla scheda "Parametri". Inserire i parametri appropriati per mezzo di immersione lente, mezzo di inclusione e apertura numerica (ad esempio, olio, glicerina, ecc.) (Ad esempio, olio di immersione, ecc.) (NA; qui, 1.3 è stato utilizzato). Controllare i parametri rimanenti per assicurarsi che essi riflettono correttamente le condizioni di imaging. Fare clic sulla scheda "Imposta tutto verificato" a pinnaAlize le impostazioni dei parametri.
4. Nella finestra di operazione di immagine, fare clic sulla scheda "Operazione". Assegnare una destinazione di uscita (ad esempio, c). Inserire il numero appropriate "Segnale / Rumore per canale" (per esempio, "12 12 12 12" è un buon punto di partenza, mentre l'impostazione predefinita è "20 20 20 20"). Utilizzare le impostazioni predefinite per i restanti parametri.
5. Fare clic sulla scheda "Run Command" per avviare deconvoluting la serie di immagini; questo processo può richiedere fino a decine di minuti per completare, a seconda del computer.
6. Nella finestra principale, fare clic e selezionare la serie di immagini deconvolved. Scegli Menu: Salva con nome per salvare l'immagine deconvolved nel formato di file immagine ICS (.ics e .ids).
   NOTA: Ogni stack immagine ha due file: il file ICS contiene le informazioni di intestazione e il file ids contiene le informazioni immagine raw.
   1. Rinominare i file immagine Pila secondo l'orientamento delle immagini (ad esempio, il nome del orizzontale-visualizzazione dell'immagine schiodini H.ids e H.ics e frontale-view immagine Pila F.ids e F.ics).

3. Dual-view Combinazione immagini

Nota: questo passaggio combina immagine due pile di generare immagini 3D ad alta risoluzione utilizzando il software MIPAV.

1. Generazione di matrici per combinazione di immagini.
   1. Avviare il programma MIPAV. Caricare le pile di immagini H e F scegliendo Menu: File / Apri immagine (A) dal disco (o Ctrl-F) /H.ids e F.ids; la finestra mostrerà due immagini.
   2. Selezionare l'immagine H cliccando l'immagine e scegliere il menu: Strumenti di utilità / Conversione / RGB / Grays; la finestra mostrerà GrayG, GrayB, e le immagini GrayR.
   3. Chiudere GrayR e GrayB, solo mantenendo GrayG sulla finestra.
   4. Selezionare l'immagine F cliccando l'immagine e scegliere il menu: Strumenti di utilità / Conversione / RGB / Grays. La finestra mostrerà GrayG1, GrayB1, e le immagini GrayR1.
   5. Chiudere GrayR1 e GrayB1 e mantenere solo GrayG1 sulla finestra. A questo punto, solo GrAYG e GrayG1 sono sulla finestra.
   6. Selezionare il GrayG (evidenziare), selezionare il menu: Algoritmi / registrazione / ottimizzata immagine Registrazione automatica; la finestra di dialogo "ottimizzata Automatic Image registrazione 3D" pop-up.
      1. Nelle opzioni d'immissione, cambiare i "gradi di libertà" da default "Affine-12" a "specifico rescale-9". In chiave -105 a 105 nel "range di campionamento Angolo di rotazione", "Rotazioni" (di default: da -30 a 30 gradi), 10 nel "incremento dell'angolo Coarse" (default: 15 gradi), e 3 in "Belle incremento dell'angolo "(default: 6 gradi).
   7. Fare clic su OK; il primo Matrix "GrayG_To_GrayG1.mtx" verrà generato e salvato nella cartella di immagini. Chiudere tutte le finestre delle immagini e procedere alla fase successiva; questo passo ci vorranno almeno 15 min.
   8. Caricare le pile di immagini H e F scegliendo Menu: File / Apri immagine (A) dal disco (o Ctrl-F) /H.ids e F.ids, come al punto 3.1.1.
   9. Selezionare l'immagine H cliccando l'immagine e scegliere il menu: Strumenti di utilità / Conversione / RGB / grigio; il "> RGB-Gray" finestra di dialogo pop-up. Fare clic su OK; la finestra mostrerà immagini "HGray". Mantenere HGray e chiudere l'immagine H.
   10. Ripetere il passaggio 3.1.9 per l'immagine F; le immagini "FGray" apparirà sulla finestra. Mantenere FGray e chiudere l'immagine F; solo HGray e FGray saranno lasciati sulla finestra.
   11. Selezionare l'immagine HGray (evidenziare) e andare al menu: Strumenti Algoritmi / trasformazione / Transform. La finestra di dialogo "Trasforma / Ricampiona immagine" pop-up. Fare clic sulla scheda "Resample" e modificare il campionamento a dimensione di "HGray" a "FGray". Avanti, fare clic sulla scheda "Trasforma" e carico "GrayG_To_GrayG1.mtx" selezionando il tasto "Leggi matrice da file". Fare clic su OK; la finestra mostrerà l'immagine HGray_transform. Chiudere l'immagine in modo che solo HGray HGray_transform e FGray vengono lasciati sulla finestra.
   12. Selezionare "HGray_transform & #34; immagine (evidenziare) e andare al Menu: Algoritmi / registrazione / ottimizzata Automatic Image registrazione. La finestra di dialogo "ottimizzata Automatic Image registrazione 3D" pop-up. In "Rotazioni," chiavi in ​​-5 a 5 nel "range di campionamento Angolo di rotazione" (default: -30 a 30 gradi), 3 nel "incremento dell'angolo Coarse" (default: 15 gradi), e 1 in "Belle incremento dell'angolo "(default: 6 gradi). Fare clic su OK.
       NOTA: Il Affine Matrix (HGray_transform_To_FGray.mtx) verrà generata e salvata nella cartella immagine e l'immagine "HGray_Transform_register" verrà mostrato nella finestra. Questo passo ci vorranno almeno 40 min.
   13. Chiudere l'immagine "HGray_transform"; solo "HGray_Transform_register" e "FGray" dovrebbero essere lasciati sulla finestra.
   14. Selezionare l'immagine "HGray_Transform_register" (evidenziare) e andare al Menu: Algoritmi / Registrazione / B-Spline automatico Registrazione 2D / 3D. Il "B-Spline Registrati automaticaon-3D intensità "finestra di dialogo pop-up. Selezionare" minimi quadrati "nella funzione di costo (il valore predefinito è rapporto di correlazione).
       1. Fai clic su "Esegui due passaggi di registrazione". Nella sezione Passo 1, digitare 2 in "discesa del gradiente Minimizzare Step Size (unità di campionamento)" (il valore predefinito è 1) e digitare 10 in "Numero massimo di iterazioni:" (il valore predefinito è 10). Nella sezione Passo 2, digitare 1 in "discesa del gradiente Minimizzare Step Size (unità di campionamento)" (il default è 0.5) e digitare 2 in "Numero massimo di iterazioni:" (il valore predefinito è 10).
          NOTA: La matrice NLT, "HGray_transform_register.nlt," verrà salvato nella cartella immagine e l'immagine "HGray_transform_register_registered" sarà visualizzato nella finestra. Questo passo ci vorranno almeno 5 min.
   15. Chiudere tutte le immagini sulla finestra.
2. Generare l'immagine di riferimento per la combinazione di immagini.
   NOTA: Questa fase ha lo scopo di genermangiato un immagine orizzontale registrata per la combinazione.
   1. immagine F carico H e pile scegliendo il menu: File / Apri immagine (A) dal disco (o Ctrl-F) /H.ids e F.ids; due immagini vengono visualizzate sulla finestra.
   2. Selezionare l'immagine H (evidenziare) e andare al menu: Strumenti Algoritmi / trasformazione / Trasformazione; la finestra di dialogo "Trasforma / Ricampiona immagine" pop-up. Fare clic sulla scheda "Resample" e modificare il ricampionamento da una dimensione di "H" a "F" Avanti, fare clic sulla scheda "Trasforma" e carico "GrayG_To_GrayG1.mtx" selezionando "Leggi matrice da file". Fare clic su OK; l'immagine H_transform apparirà nella finestra. Chiudere l'immagine H ma mantenere H_transform e F nella finestra.
   3. Selezionare l'immagine "H_transform" (evidenziare) e andare al menu: Strumenti Algoritmi / trasformazione / Trasformazione; la finestra di dialogo "Trasforma / Ricampiona immagine" pop-up. Fare clic sulla scheda "Resample" e modificare il ricampionamento da una dimensione di "H_transform" a "F. & #34; Avanti, fare clic sulla scheda "Trasforma" e carico "HGray_transform_To_FGray.mtx" selezionando "Leggi matrice da file". Fare clic su OK; l'immagine "H_transform_transform" apparirà nella finestra. Chiudere l'immagine H_transform; a questo punto, solo H_transform_transform e F viene lasciato sulla finestra.
   4. Selezionare l'immagine "H_transform_transform" (evidenziare) e andare al menu: Strumenti Algoritmi / Trasformazione / Trasformazione non lineare; la finestra di dialogo "non lineare B-Spline Trasformazione" pop-up. Avanti, carico "HGray_transform_register.nlt" e fare clic su OK; l'immagine "H_transform_transform_registered" apparirà nella finestra. Salvare l'immagine come file ics. Chiudere tutte le immagini sulla finestra.
3. La combinazione di pile di immagini
   NOTA: Questo passaggio è quello di combinare due pile di immagini acquisite in orientamenti ortogonali (orizzontali e frontali) in una pila alta risoluzione.
   1. Vai a Menu: plugins / Generico / Drosophila retina Registrationl; la finestra di dialogo "Drosophila Retina Registrazione v2.9" pop-up. Carica "H.ics" di immagine H, "H_transform_transform_registered" dal punto 3.2.4 in Image H-legale, "F.ics" in figura F, "GrayG_To_GrayG1.mtx" dal punto 3.1.7 in Trasformazione 1-verde (opzionale ), "HGray_transform_To_FGray.mtx" dal passo 3.1.12 in Transformation 2-affine, e "HGray_transform_register.nlt" dal punto 3.1.14 in Trasformazione a 3 non lineare (opzionale).
      1. Selezionare sqrt (Intensity-H x Intensity-F) e n rescale in "Rescale H a F." Mantenere le opzioni predefinite per i restanti parametri. Fare clic su OK; questo passo ci vorranno circa 3 min.
         NOTA: Dopo l'elaborazione, 3 set di immagini verrà generato: combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids (l'immagine finale ricombinato), greenChannelsImage-Gxreg-Gy-Gcomp.IDS (canale verde per H, F, e l'immagine ricombinato finale), e redChannelsImage- Rxreg-Ry-Rcomp.ids (canale rosso FOr H, F, e l'immagine ricombinato finale); tutti i file di output verranno ridimensionate a 512 x 512 x 512.
   2. Aperte "combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids" sotto il software di visualizzazione di immagini. Salvare la serie di immagini in formato IMS e rinominare il file; Questo file immagine ricombinato verrà utilizzata per neurite tracciamento e la registrazione.

4. neuriti Tracing e punto di riferimento Assegnazione

NOTA: Questo passaggio è di tracciare neuriti (4.1) e per assegnare i punti di riferimento per la registrazione (4.2) utilizzando il software di visualizzazione delle immagini.

1. tracciare neuriti
   1. Avviare il software di visualizzazione delle immagini. Aprire il file di immagine ricombinato. Vai a Menu: Modifica / Mostra Regolazione visualizzazione e spegnere il canale fotorecettore (rosso).
   2. Visualizza l'immagine in modalità "Surpass". Attivare "stereo" e utilizzare la modalità "Quad Buffer" per visualizzare immagini in 3D se il computer è equipped con un sistema di stereograph.
   3. Vai a Menu: Superare / Filaments per aggiungere nuovi filamenti. Fare clic su "Skip creazione automatica, modificare manualmente" scheda.
   4. Fare clic sulla scheda "Draw" e selezionare "AutoDepth."
   5. Selezionare "Impostazioni" controllare "Linea", e digitare un numero di pixel appropriato per una migliore visualizzazione (si usa una linea a 4 pixel in questo protocollo). Controllare "Mostra dendriti," "A partire Point" e "punti di ramificazione". Impostare "Render Qualità" al 100%.
   6. Selezionare la scheda "Draw" e avviare l'analisi neuriti. Inizia con l'assone e poi passare ai dendriti (Figura 2D). L'assone e dendriti dei neuroni transmedulla sono facili da differenziare.
      NOTA: Un neurone Tm estende il proprio assone dal corpo cellulare e proietta tutta la strada al centro di elaborazione visiva superiore, il lobula. Il sistema definisce automaticamente il primo filamento lungo come un assone e le rimanenti brevi filamenti comedendriti. Mantenere il punto di partenza all'inizio del filamento (assone) durante rintracciamento e assicurarsi che i neuriti tracciati sono collegati. Esaminare i punti di ramificazione e il punto di inizio. Se i dendriti non sono collegati, un nuovo punto di inizio sarà definito al filamento non-collegato.
   7. Dopo aver tracciato, tornare a "Impostazioni," deselezionare "A partire Point" e "Branching Point", e andare a Menu: Superare / Export oggetti selezionati ../. Salvare il filamento come un file di Inventor (* .iv).
2. Assegnazione dei punti di riferimento
   1. Selezionare "Mostra Regolazione Visualizzazione" e girare su entrambi i canali di imaging. In questo esempio, il canale 1 è la colorazione dei fotorecettori e il canale 2 è il neurone TM20 (GFP).
   2. Vai a Menu: Surpass / misurazione. Selezionare la scheda "Modifica" e verificare "Canale specifica:" (selezionare il canale fotorecettore [rosso]).
   3. Assegnare i punti di riferimento per lo strato superiore. Vai al menù: / Surpass / Misura PoiNTS per creare nuovi punti di misura. Segnare l'inizio dello strato M1 come strato superiore. L'ordine dei punti è la seguente: equatoriale, antero-equatoriale, anteriore, antero-ventrale, ventrale, posteriore-ventrale, posteriore, postero-equatoriale, e al centro (Figura 3F); definire il fotorecettore centro, come quella associata con i processi più dendritiche.
   4. Assegnare gli strati R8 e R7 come nel passaggio 4.2.3 (Figura 3G). Tre punti di misurazione individuali dovrebbero essere create nei passaggi 4.2.3 e 4.2.4.
   5. Esportare le coordinate dei punti per ogni strato. Fare clic sulla scheda "Statistiche", selezionare "dettagliato", "valori specifici" e "Posizione"; e fare clic su "Esporta statistiche sulla scheda Visualizzazione su file." Salva con nome "Comma Separated Values" (* .csv).
   6. Aprire i tre file CSV (da piazza 4.2.3 - 4.2.4) e combinare le coordinate dei 27 punti di riferimento in un nuovo file CSV copiando e incollando (the ordine è superiore, R8 e R7). Vedere le attrezzature / Tabella Materiali e seguire il formato del file di esempio.

5. rigido-corpo e TPS non lineare registrazione

NOTA: Questo passaggio è quello di registrare le tracce dei neuriti (in formato iv) la matrice colonna di riferimento e per generare un file SWC registrato utilizzando il programma MIPAV. Questa sezione richiede i seguenti file: la pila di immagini ricombinato (.ids) dal punto 3.3, il file di punto di riferimento (.csv) dal punto 4.2, e il file di traccia filamento neurite (.iv) dal punto 4.1.

1. Vai a Menu: plugins / generico / DrosophilaStandardColumnRegistration. La finestra "DrosophilaStandardColumnRegistration v6.6.1" pop-up.
2. Caricare i file di immagine (.ids), il file punti di riferimento (.csv), e il file di filamento (.iv).
3. Selezionare 9 punti per strato.
4. Selezionare la posizione del neurone immagine (LV / RD o camper / LD).
5. Selezionare "rigido Registratisu e TPS "e" Registrazione rigido "per, rispettivamente, non lineare e la registrazione rigida-corpo,.
6. Controllo "Crea file SWC" per generare i file di output seguente: un file di traccia neurite registrati in formato SWC (vedi specifico Materiali / Attrezzature per la definizione), un file IV registrati (.iv), le coordinate della neurite standardizzato (txt), coordinate trasformate (txt), e l'immagine combinata (.ids).
7. Cambiare il nome del file SWC. Applicare la sigla della posizione fino alla fine del nome del file (passo 1,7). Ad esempio, utilizzare "Tm20_3_RV.swc" per la TM20 neurone # 3 situato a metà ventrale del midollo destra.

6. La standardizzazione di configurazione destro-ventrale

NOTA: Questo passaggio è quello di convertire le tracce dei neuriti (in formato SWC) di RV configurazione standard (destra-ventrale) usando lo script personalizzato "RV_standardization.m." Qui, la sceneggiatura è stata scritta nella lingua di laboratorio della matrice. Ilnomi dei file SWC input deve essere nel seguente formato: "NeuronName _ _ Numero .swc Configuration" (ad esempio, Tm20_3_LV.swc).

1. Aprire lo script "RV_standardization.m".
2. Modificare i seguenti parametri nella sezione "Input utente":
   1. Digitare i nomi dei neuroni senza numerazione (ad esempio, Tm2, TM20, etc.) in "neuron_names."
      NOTA: L'impostazione predefinita in "file_end_in" è "_ * SWC,.", Che cerca i file con i nomi che contiene ( "*" è un carattere jolly che qualsiasi numero di caratteri) "_ * SWC.". Il valore predefinito di "swc_file_end_out" è "_f.swc", che andrà ad aggiungersi "_F" alla fine del nome del file dopo la normalizzazione.
   2. Specificare la directory in cui i file SWC sono in "directory_in". Specificare la directory in cui i file standardizzati andranno in "directory_swcout".
3. Eseguire lo script.
4. Osoggetto a talune: Usa Vaa3D ¹⁴ per visualizzare i file SWC e convalidare la conversione.

7. Calcolare dendritiche Branching e chiude Frequenze

NOTA: Questo passaggio utilizza rigido-corpo registrato file SWC per calcolare gli stimatori di Kaplan-Meier per la probabilità che un segmento dendritica raggiungerà una certa lunghezza senza terminare. Questo script utilizza due funzioni: Dendritic_Tree_Toolbox extractDendriticSegmentLengthDistribution e estimateDendriticSegmentLengthProbability.

1. Aprire lo script "Branch_term_P.m".
2. Modificare i seguenti parametri nella sezione "Input utente":
   1. Specificare il percorso dei file SWC rigido-corpo registrate in "pathToSWCFiles" (ad esempio, / Rigid_Registered_swc /). Specificare il percorso che conterrà l'output grafico in "pathToOutput." Specificare il nome dei neuroni o tipi neurali nel "neuron_names" (ad esempio, Tm2, Tm20, ecc).
3. Eseguire lo script; le uscite sono la curva di stima di Kaplan-Meier per la ramificazione dendritica e la terminazione.
   NOTA: Opzionale: applicare il metodo della funzione di raccordo per estrarre dalla Kaplan-Meier estimatori la probabilità locale che il segmento dendritiche si diramano o terminare.

8. tracciare la distribuzione di terminazione specifici strati di dendritiche Arbors

NOTA: Questo passaggio traccia la distribuzione dei terminali dendritiche in diversi strati midollo come grafico a barre. Questo può essere applicato a un neurone, un gruppo di neuroni, o gruppi di neuroni. Lo script utilizza la funzione extractDistributionAlongAxis da Dendritic_Tree_Toolbox.

1. Aprire lo script "Layer_term.m".
2. Modificare i seguenti parametri nella sezione "Input utente":
   1. Specificare la directory che contiene non lineari registrato file SWC in "pathToSWCFiles" (ad esempio, / Non_linear_Registered_swc /). Specificare la directory per l'uscita grafica "pathToOutput." Specificare il nome dei neuroni o tipi neuronali nel "neuron_names" (ad esempio, Tm2, TM20, etc.).
3. Eseguire lo script tutorial. L'uscita è un istogramma della percentuale di nodi terminali in strati midollo specifici.

9. Tracciare la proiezione direzione piana dei dendriti

NOTA: Questo passaggio traccia la direzione di proiezione planari di dendriti come un diagramma polare. Lo script utilizza la funzione extractAngularDistribution da Dendritic_Tree_Toolbox.

1. Aprire lo script "Planar_proj.m."
2. Modificare i seguenti parametri nella sezione "Input utente".
   1. Specificare la directory che contiene il file SWC non lineare registrati in "pathToSWCFiles" (ad esempio, / Non_linear_Registered_swc /). Specificare la directory per l'uscita grafica in "pathToOutput." Specificare il nome dii neuroni o tipi neurali nel "neuron_names" (ad esempio, Tm2, TM20, etc.).
3. Eseguire lo script; l'uscita è un diagramma polare di direzioni di proiezione planari.

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Risultati

Utilizzando la procedura di imaging dual-view qui presentato, un cervello mosca contenente neuroni TM20 scarsamente etichettati è stato ripreso in due direzioni ortogonali. Prima di imaging, il cervello era macchiato di appropriati anticorpi primari e secondari per la visualizzazione GFP e fotorecettori assoni membrana-tethered. Per l'imaging, il cervello è stato montato prima secondo un orientamento orizzontale (Figura 2A, B). Un neurone TM20 GFP-etichettati e le ...

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Discussione

Qui, mostriamo come immagine e analizzare pergole dendritiche di neuroni midollo Drosophila. La prima sezione, dual-view di imaging, descrive la deconvoluzione e la combinazione di due pile di immagine in una pila alta risoluzione. La seconda sezione, dendriti tracciamento e la registrazione, descrive il tracciamento e la registrazione dei dendriti dei neuroni midollo nella matrice colonna di riferimento. La terza sezione, analisi dendritica, descrive l'uso di script personalizzati per analizzare i modelli ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging	version 16.05	for image deconvolution (https://svi.nl).  commercial software
MIPAV		version 7.3.0	for image recombination and registration (http://mipav.cit.nih.gov/); freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophila RetinalRegistration.class			freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophilaStandard ColumnRegistration.class			freeware
Imaris	Bitplane		for tracing neurites and assigning reference points for image registration (http://www.bitplane.com); commercial software
Vaa3D			for visualizing swc files (https://github.com/Vaa3D/release/releases/); freeware
Matlab	Mathworks	R2014b	for morphometric analysis of dendrites (http://www.mathworks.com); commercial software
Matlab toolbox: TREES1.14		v1.14	for analyzing dendritic morphometric parameters (http://www.treestoolbox.org/download.html); freeware
Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox		v1.0	For calculating morphometric parameters (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware
Name	Company	Catalog number	Comments
Sample files
SWC file definition			http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html
The codes and sample files for image combination and registration			https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration
Reference point example			https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate= 1471880596000&api=v2
Name	Company	Catalog number	Comments
Computer system
MS Windows Windows 7 x64 or Macintosh OS X 10.7 or later			3GHz 64-bit quad-core processor, 16G RAM (minimal)
Optional: Quadro4000  (or above) graphic card	Nvidia		for stereographic visualization of dendrites.
Optional: NVIDIA 3D vision2	Nvidia		http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html
Optional: 120 Hz LCD display for NVIDIA 3D vision2			http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html
Name	Company	Catalog number	Comments
Reagents for imaging
24B10 antibody	The Developmental Studies Hybridoma Bank	24B10
GFP Tag Antibody	Thermofisher Scientific	G10362
Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488	Thermofisher Scientific	A11034
Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568	Thermofisher Scientific	A21124
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
Mounting Clay	Fisher	S04179
70% glycerol in 1x PBS
Cover glasses, high performance, D = 0.17 mm	Zeiss	474030-9000-000