Profilatura cellulare Redox usando la microscopia ad alto contenuto

Riepilogo

Questo documento presenta un flusso di lavoro di microscopia ad alto contenuto per la quantificazione simultanea dei livelli ROS intracellulari, nonché il potenziale e la morfologia della membrana mitocondriale - definiti congiuntamente come morfofunzione mitocondriale - nelle cellule adesive viventi utilizzando le molecole reporter fluorescenti per cellule permeanti 5- 6) clorometil-2 ', 7'-diclorodidro-fluoresceina diacetato, acetil estere (CM-H ₂ DCFDA) e tetrametilrodamina metilestere (TMRM).

Abstract

Le specie reattive di ossigeno (ROS) regolano i processi cellulari essenziali, inclusi l'espressione genica, la migrazione, la differenziazione e la proliferazione. Tuttavia, livelli eccessivi di ROS inducono uno stato di stress ossidativo, accompagnato da danni ossidativi irreversibili al DNA, ai lipidi e alle proteine. Quindi, la quantificazione di ROS fornisce un proxy diretto per la condizione di salute cellulare. Poiché i mitocondri sono tra le principali fonti cellulari e gli obiettivi della ROS, l'analisi congiunta della funzione mitocondriale e della produzione ROS nelle stesse cellule è fondamentale per una migliore comprensione dell'interconnessione in condizioni fisiopatologiche. Pertanto, è stata sviluppata una strategia basata su microscopia ad alto contenuto per la quantificazione simultanea dei livelli ROS intracellulari, del potenziale della membrana mitocondriale (ΔΨ _m ) e della morfologia mitocondriale. Si basa su microscopia automatizzata a fluorescenza a larga scala e analisi delle immagini di cellule adesive viventi, coltivate in piastre a più pozzetti e staineD con le cellule-permeabili fluorescenti reporter molecole CM-H ₂ DCFDA (ROS) e TMRM (ΔΨ _m e morfologia mitocondriale). In contrasto con la fluorimetria o la cytometria a flusso, questa strategia consente di quantificare i parametri subcellulari a livello della singola cellula con elevata risoluzione spaziale, sia prima che dopo la stimolazione sperimentale. Importante, la natura basata sull'immagine del metodo consente di estrarre parametri morfologici oltre alle intensità del segnale. Il set di funzioni combinato viene utilizzato per l'analisi dei dati multivariata esplorativa e statistica per rilevare le differenze tra sottopopolazioni, tipi di cellule e / o trattamenti. Qui viene fornita una descrizione dettagliata del dosaggio, insieme ad un esperimento di esempio che dimostra il suo potenziale per una discriminazione inequivocabile tra stati cellulari dopo la perturbazione chimica.

Introduzione

La concentrazione di ROS intracellulare è regolata minuziosamente attraverso una interazione dinamica tra i sistemi ROS e ROS. Lo squilibrio tra i due provoca uno stato di stress ossidativo. Tra le principali fonti di ROS sono i mitocondri ¹ . Considerato il loro ruolo nella respirazione cellulare, sono responsabili della maggior parte delle molecole di superossido intracellulare (O ₂ ^{- -} ) ² . Ciò è dovuto principalmente alla perdita di elettroni a O ₂ al complesso 1 della catena di trasporto di elettroni in condizioni di forte potenziale di membrana mitocondriale negativo (Δψ _m ), vale a dire l' iperpolarizzazione mitocondriale. D'altra parte, la depolarizzazione mitocondriale è stata correlata anche con l'aumento della produzione di ROS che punta a più modi di azione ^{3 , 4 , 5 ,}> 6 ^{, 7 , 8} . Inoltre, attraverso modifiche di redox nelle proteine ​​delle macchine di fusione di fissione, ROS co-regola la morfologia mitocondriale ^9. Ad esempio, la frammentazione è correlata all'aumento della produzione ROS e all'apoptosi ^{10 , 11} , mentre i mitocondri filamentosi sono stati legati alla fame nutritiva e alla protezione contro Mitophagy ¹² . Data l'intricata relazione tra ROS cellulare e morfofunzione mitocondriale, entrambi dovrebbero essere idealmente quantificati contemporaneamente nelle cellule viventi. Per fare esattamente questo, è stato sviluppato un saggio di imaging ad alto contenuto basato sulla microscopia a larga scala automatizzata e sull'analisi delle immagini delle colture cellulari aderenti colorate con le sonde fluorescenti CM-H ₂ DCFDA (ROS) e TMRM (mitocondriali Δψ _m e morfologia). L'imaging ad alto contenuto si riferisce all'estrazione di spAtiemodally ricchi ( cioè , un gran numero di funzioni descrittive) informazioni sui fenotipi cellulari utilizzando marcatori complementari multipli e analisi automatiche delle immagini. In combinazione con la microscopia automatizzata molti campioni possono essere proiettati in parallelo ( cioè ad alta velocità) aumentando così la potenza statistica del dosaggio. Infatti, un elemento principale del protocollo è che consente la simultanea quantificazione di più parametri nella stessa cella, e questo per un gran numero di celle e condizioni.

Il protocollo è suddiviso in 8 parti (descritte in dettaglio nel protocollo sottostante): 1) Celle di semina in una piastra a 96 pozzetti; 2) Preparazione di soluzioni di magazzino, soluzioni di lavoro e buffer di imaging; 3) Impostazione del microscopio; 4) Caricamento delle cellule con CM-H ₂ DCFDA e TMRM; 5) Primo biografo live per misurare i livelli basali ROS e la morfofunzione mitocondriale; 6) Secondo round di immagini in diretta dopo l'aggiunta di tert- butilePerossido (TBHP) per misurare i livelli di ROS indotti; 7) Analisi automatica delle immagini; 8) Analisi dei dati, controllo della qualità e visualizzazione.

Il dosaggio è stato originariamente sviluppato per i normali fibroblasti umani umani (NHDF). Poiché queste celle sono grandi e piatte, sono adatte per la valutazione della morfologia mitocondriale nelle immagini 2D widefield ^{13 , 14} . Tuttavia, con modifiche minori, questo metodo è applicabile ad altri tipi di cellule aderenti. Inoltre, accanto alla combinazione di CM-H ₂ DCFDA e TMRM, il flusso di lavoro è conforme a una varietà di coppie di coloranti fluorescenti con diverse specificità molecolari ^{1 , 15} .

Protocollo

Il protocollo sottostante è descritto come eseguito per le cellule NHDF e con l'uso delle piastre multivibranti specificate nel file dei materiali. Vedere la Figura 1 per una panoramica generale del flusso di lavoro.

1. Preparazione dei reagenti

1. Preparare il mezzo completo integrando Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con 10% v / v Fetal Bovine Serum (FBS) e 100 IU / mL penicillina e 100 UI / mL streptomicina (PS). Per 500 ml di media completa, aggiungere 50 ml di FBS e 5 ml di PS a 445 ml di DMEM.
2. Preparare il buffer di imaging HBSS-HEPES (HH) completando la soluzione salina equilibrata Hank (con magnesio e calcio, ma senza fenolo rosso) con 20 mM HEPES. Per 500 mL di HH, aggiungere 10 mL di soluzione 1M HEPES a 490 mL HBSS. Verificare il pH e, se necessario, regolare al pH 7,2.
3. Preparare una soluzione di stock di 1 mM CM-H ₂ DCFDA sciogliendo 50 μg di polvere liofilizzata CM-H ₂ DCFDA in 86,5 &# 181; L anidro DMSO. Mescolare vortexando o pipettare su e giù e fare 20 μL aliquote nei tubi di microcentrifuga marroni. Conservare al buio a -20 ° C e usare entro una settimana. Se conservato in atmosfera N2, la durata di conservazione può essere aumentata fino ad almeno 1 mese.
   1. Preparare una soluzione di 1 mM TMRM dissolvendo 25 mg di polvere TMRM in 50 mL di DMSO anidro. Mescolare vortexing o pipettare su e giù e fare 10 μL aliquote nei tubi di microcentrifuga marroni. Conservare al buio a -20 ° C. Questa soluzione è stabile per almeno un anno.
4. Preparare una nuova aliquota di Tert- butyl peroxide (TBHP) (~ 7 M) per ogni esperimento pipettando direttamente un volume dalla soluzione di stock del 70% (piastra da 10 μL / 96 pozzetti). Tenere questa aliquota a 4 ° C fino ad un ulteriore utilizzo.
5. Preparare la soluzione di lavoro anticorpale (AB) diluendo due anticorpi secondari (Alexa Fluor 488 asino anti-coniglio e CY3 asino anti-coniglio) 1.000 volte in 1x HH-buffer.

2. Impostazione del protocollo di microscopio e acquisizione (± 15 min)

NOTA: L'acquisizione di immagini viene eseguita con un microscopio a campo ampio dotato di uno stadio automatico e delle persiane e di un sistema di autofocus basato su hardware che utilizza un obiettivo di correzione del piano aereo 20X (NA = 0,75) e una telecamera EM-CCD. Quando si imposta la prova per la prima volta, una targa di prova contenente celle di controllo, colorate secondo le istruzioni del protocollo, viene utilizzata per calibrare la fase XY e per ottimizzare le impostazioni di acquisizione. Se le impostazioni di acquisizione sono già state determinate, la calibrazione può essere eseguita usando una piastra vuota.

1. Abbassare l'obiettivo al livello base assoluto e calibrare la fase XY seguendo le istruzioni software.
2. Assicurarsi che siano installati i cubi di filtro corretti. Per visualizzare CM-H ₂ DCFDA, utilizzare un cubo standard filtro GFP con un filtro a banda di eccitazione a 472/30 nm, un dicrofono a 495 nmIc e un filtro di emissione a banda da 520/35 nm. Per TMRM, utilizzare un filtro di cubo per TRITC con un filtro di eccitazione a banda 540/25 nm, uno specchio dicroico di taglio 565 nm e un filtro di emissione a banda 605/55 nm.
3. Creare un protocollo di imaging utilizzando il software di acquisizione.
   1. Selezionare il tipo corretto di piastra multiuso (produttore e codice) dall'elenco delle piastre disponibili all'interno del software. In alternativa, definire il proprio formato piastra multistrato utilizzando le dimensioni della piastra e delle pozzetti.
   2. Allineare la piastra di salvataggio secondo le istruzioni del software, ad esempio definendo due angoli dei quattro pozzetti d'angolo esterni. Questo passaggio copre per la variazione di orientamento della fotocamera.
   3. Selezionare i pozzetti che devono essere acquisiti. Se questa opzione non è disponibile nel software, utilizzare un insieme di posizioni XY definite manualmente che corrispondono ai pozzetti selezionati.
   4. Ottimizzare le impostazioni di acquisizione (tempo di esposizione, intensità della lampada, guadagno EM) per thE due canali separatamente utilizzando la piastra di prova. Ridurre al minimo l'esposizione e l'intensità come la luce di eccitazione della fluorescenza stessa induce ROS. Ma assicuratevi che il segnale al rapporto di sfondo sia almeno 2 per CM-H ₂ basale DCFDA e 3 per TMRM prima del trattamento TBHP e che non ci sia saturazione dopo il trattamento TBHP. Le impostazioni di acquisizione dipendono notevolmente dalla configurazione microscopica e dal tipo di cella utilizzata, ma come riferimento, le impostazioni indicative quando si utilizzano una lampadina ad alogenuri metallici di 130 W come sorgente luminosa e le cellule NHDF macchiate secondo le istruzioni del protocollo sono le seguenti: sia per CM- H ₂ DCFDA e TMRM vengono utilizzati un tempo di esposizione di 200 ms e un filtro ND 8, combinato con un guadagno EM di 15 (13 MHz; 14 bit) e 4 (27 MHz; 14 bit) rispettivamente. Una volta ottimizzata per una determinata configurazione e tipo di cella, questo passaggio può essere ignorato.
      NOTA: è essenziale che le impostazioni di acquisizione siano mantenute uguali per tutto il processo di imaging. Per esperimenti su larga scala, multi-day, lampada staDovrebbero essere garantiti dal regolare controllo della qualità.
   5. Definire un protocollo di acquisizione, costituito da un'acquisizione sequenziale di lambda (lunghezza d'onda). Selezionare il canale CM-H ₂ DCFDA _da acquisire in primo luogo per minimizzare l'esposizione della luce prima della misurazione.
   6. Definire un anello a piastra per acquisire 4 immagini non sovrapposte regolarmente distanziate posizionate attorno al centro di ciascun pozzetto della selezione del pozzo utilizzando il protocollo di acquisizione definito in 2.3.4. Scegliere l'acquisizione di immagine, ossia prima da sinistra a destra, dal pozzo B02 alla B11, poi indietro, da destra a sinistra, dal pozzo C11 al CO2 e così via ( Figura 2A ). Ciò consente di risparmiare tempo rispetto all'acquisizione di immagini da sinistra a destra. Se questa opzione non è disponibile nel software, regolare il set personalizzato delle posizioni XY create in 2.3.3 per assumere questo modello di imaging.
   7. Salvare le coordinate XY delle posizioni di imaging ( ad es. In un file xml separato) per consentire una revisione facileNg in caso di ricalibrazione del microscopio. Ciò è particolarmente importante se la lettura da questo dosaggio deve essere correlata con una colorazione post-hoc immunofluorescenza (IF) per le stesse cellule.

3 . Seeding Cells in un piatto da 96 pozzetti (45 - 90 min, a seconda del numero di linee cellulari differenti)

1. Lavorare in ambiente sterile come un armadio di sicurezza della classe 2 e guanti da usura.
2. Decontaminare tutte le superfici ei materiali utilizzando il 70% v / v etanolo in acqua distillata.
3. Prendere un pallone per la coltura di cellule con una coltura di cellule confluenti del 90% dall'incubatore e collocarla nell'armadio della biosicurezza.
4. Lavare le cellule due volte con PBS 1x.
5. Aggiungere le opportune quantità di soluzione di trysina-EDTA allo 0,05% sulle cellule, assicurandosi che la superficie cellulare completa sia coperta ( ad es. , 1 ml per una pallina T25) e incubare per 2 minuti a 37 ° C e 5% CO ₂ .
6. Se tutte le cellule sono staccate (controllare con un microscopio ), Aggiungete un mezzo di coltura (DMEM + 10% FBS + 1% penicillina-streptomicina, ± 4 mL in una tampone T25) per inattivare la soluzione di trysina-EDTA.
7. Centrifugare per 5 min a 300 xg a temperatura ambiente.
8. Scartare il surnatante e risospendere il pellet di cellule nel mezzo di coltura. Determinare la quantità di mezzo per ogni tipo di cellula per ottenere una concentrazione cellulare compatibile con il conteggio delle cellule. Tipicamente, una fiala confluente del 90% di T25 di NHDF contiene circa 1-1,5 milioni di cellule, che vengono risospese in 3-4 ml di terreno di coltura.
9. Contare le celle usando una camera di conteggio delle celle o un contatore di Coulter.
10. Sementi 8.000-10.000 cellule in ciascuno dei 60 pozzetti interni di una piastra a 96 pozzetti neri con un sottile strato di polistirolo o fondo in vetro (nero per evitare scattering e cross-talk tra i pozzi adiacenti durante l'imaging). Quando si utilizzano diverse condizioni / trattamenti / linee cellulari, distribuire le loro posizioni di semina omogeneamente sulla piastra in modo da minimizzare gli effetti della piastra (Figura 2A) I pozzetti esterni, ad eccezione del pozzetto B01 e A01, non vengono utilizzati perché sono più soggetti agli effetti del bordo.
11. Sementi 8.000-10.000 cellule in B01. Questo pozzo verrà utilizzato per la regolazione della messa a fuoco, proprio prima dell'acquisizione di immagini.
12. Riempire i pozzetti esterni vuoti con il mezzo per ridurre al minimo i gradienti (temperatura, umidità, ecc. ) Tra i pozzetti e l'ambiente.
13. Toccare delicatamente la piastra tre volte prima di riportarla nell'incubatrice per evitare che le cellule crescano in patch.
14. Coltivi le cellule per 24 ore, o fino ad un grado di confluenza di ca. 70%.
15. Salvare le informazioni di trattamento per l'esperimento in un foglio di calcolo denominato "Setup.xlsx". Il file dovrebbe contenere quattro colonne e verrà utilizzato per collegare i trattamenti con i pozzetti e le informazioni di immagine durante l'analisi dei dati. Le quattro colonne sono: 'Well', 'Treatmentnumber', 'Treatment' e 'Control' (una fila per pozzetto). Ogni trattamento è accoppiatoCon un numero di trattamento unico che viene utilizzato durante la visualizzazione dei dati per determinare l'ordine dei trattamenti sull'asse X delle trame. La colonna di controllo specifica il trattamento che funge da controllo per il trattamento sulla riga corrente. Illustrazioni di un layout sperimentale tipico e di un file di installazione corrispondente sono rappresentati in Figura 2 .

4. Carico delle cellule con CM-H ₂ DCFDA e TMRM (± 45 min)

NOTA: La movimentazione delle cellule nel giorno dell'esperimento può essere eseguita in un ambiente sterile (armadio di biosicurezza), ma questo non è obbligatorio perché le cellule saranno scartate o fissate direttamente dopo il dosaggio.

1. Riscaldare il tampone HH a 37 ° C.
2. Preparare una soluzione di lavoro TMRM da 20 μM diluendo la soluzione di stock di 1 mM 50 volte in tampone HH (aggiungere 490 μl di HH-buffer a 1 aliquota di 10 μL di soluzione TMRM).
3. Preparare un caricoSoluzione con 2 μM CM-H ₂ DCFDA e 100 nM TMRM. A tal fine, diluire la soluzione di base 1 mM CM-H ₂ DCFDA 500x e la soluzione di lavoro TMRM da 20 μM 200x in tampone HH.
   1. Tipicamente, per 60 pozzetti, preparare 7,5 ml di soluzione di carico aggiungendo 15 μL di CM-H ₂ DCFDA e 37,5 μL di soluzione TMRM a 7447,5 μL di HH.
4. Scartare il mezzo di coltura dalle cellule girando la piastra a testa in giù in un solo movimento del fluido.
5. Lavare delicatamente le cellule due volte con HH-buffer usando una pipetta multicanale (100 μL / pozzetto). Eliminare il tampone HH tra le fasi di lavaggio ruotando la piastra in giù in un solo movimento del fluido.
6. Caricare le cellule con CM-H ₂ DCFDA e TMRM aggiungendo 100 μL di soluzione di caricamento a ciascun pozzetto, utilizzando ancora una pipetta multicanale. Incubare per 25 minuti al buio, a temperatura ambiente. Non dimenticare bene il B01.
7. Durante questi 25 minuti, preparare soluzioni di lavoro dell'ossidante TBHP e assicurarsi che il microscopio e l'accessorio siano accesi.
   1. Preparare la soluzione di lavoro I: Diluire la soluzione di base 7M 70x a 100 mM (10 μL in 690 μL HH-buffer).
   2. Preparare la soluzione di lavoro II: Diluire WS I da 100 a 1 mM (10 μL di WS I in 990 μL di HH-buffer).
   3. Preparare la soluzione di lavoro III: Diluire WS III 25x a 40 μM (per 60 pozzetti aggiungere 300 μL di WS II in 7200 μL di tampone HH).
8. Dopo 25 minuti, lavare le cellule due volte con 100 μl di HH-buffer come descritto in precedenza.
9. Aggiungere 100 μl di HH-buffer a tutti i 60 pozzetti interni.

5. Primo Live Imaging Round per misurare i livelli basali ROS e la morphofunction mitocondriale (± 15 min)

1. Assicurarsi che il software di acquisizione sia operativo e che il protocollo di imaging sia caricato.
2. Installare la piastra sul microscopio, accendere l'hardwareSed autofocus e utilizzare bene B01 per regolare l'offset autofocus usando il canale TMRM. Poiché questa procedura induce un aumento dell'intensità del segnale CM-H ₂ DCFDA, questo pozzo viene escluso dall'analisi delle immagini a valle.
3. Eseguire il protocollo di imaging.

6. Secondo ciclo di imaging live dopo l'aggiunta di TBHP per misurare i livelli ROS indotti (± 20 min)

1. Rimuovere con cautela la piastra da 96 pozzetti dal microscopio.
2. Aggiungere a ciascun pozzetto 100 μl di TBHP WS III (40 μM) usando una pipetta multicanale (Ciò comporta una concentrazione di TBHP da 20 μM nei pozzetti). Questo composto viene utilizzato come un controllo positivo interno per la colorazione CM-H ₂ DCFDA (il segnale dovrebbe aumentare) così come un mezzo per misurare i livelli indotti di ROS.
   NOTA: È possibile utilizzare anche H ₂ O ₂ anziché TBHP, ma questo composto è meno stabile e quindi meno affidabile.
3. Attendere almeno 3 minuti per consentire la reazione completa di TBHP wIth CM-H ₂ DCFDA.
4. Durante questo periodo aggiungere 100 μL di soluzione anticorpale (1/1000) al pozzetto A01.
5. Montare la piastra di nuovo sul microscopio e controllare nuovamente la messa a fuoco utilizzando bene B01.
6. Acquisire le stesse posizioni come nel primo round di imaging utilizzando lo stesso protocollo di imaging.
7. Esportare i set di dati acquisiti in una singola cartella come file tiff individuali utilizzando la nomenclatura standardizzata che include il riferimento alla piastra, al trattamento pre- o post-TBHP, ben, campo e canale, separati da sottolineature, ad es . 'P01_Pre_B02_0001_C1' per la piastra 1, il trattamento pre-TBHP, anche il B02, il campo 1 e il canale 1. Queste informazioni verranno utilizzate durante l'analisi delle immagini ( ad esempio per selezionare le impostazioni di segmentazione appropriate), nonché durante l'analisi dei dati Con i trattamenti corretti).
8. Acquisire immagini a campo piatto per entrambi i canali su tutte e quattro le posizioni attorno al centro del pozzetto A01 utilizzando il protocollo di acquisizione. Salva thEm come singoli file tiff nella stessa cartella delle altre immagini usando la seguente nomenclatura standardizzata: 'P01_FF_A01_0001_C1' per la piastra 1, il campo 1 e il canale 1. Assicurarsi che i segnali siano ben all'interno della gamma dinamica; In caso di saturazione, utilizzare una minore concentrazione di soluzione anticorpale.
9. Scartare la piastra o salvare per ulteriori elaborazioni.
   NOTA: Invece di rimuovere la piastra dal microscopio e utilizzando una pipetta multicanale per aggiungere la soluzione TBHP, una pipetta automatica può essere installata sullo stadio del microscopio e collegata con il software di acquisizione in modo da funzionare alla ricezione di un trigger. Ciò consente di aggiungere TBHP ad ogni pozzetto direttamente dopo la prima acquisizione, prima di passare al pozzo successivo. In questo modo, quando il primo round di imaging è terminato, il secondo può iniziare subito e tutti i pozzi avranno avuto un tempo di incubazione uniforme con il TBHP.

7. Elaborazione e analisi delle immagini (± 30 min perPiatto da 96 pozzetti)

NOTA: Tutto l'elaborazione delle immagini viene eseguita in FIJI (http://fiji.sc), una versione confezionata di ImageJ freeware. È stato scritto uno script dedicato per l'analisi automatica dei segnali intracellulari ROS e dei mitocondriali, nonché i parametri morfologici (RedoxMetrics.ijm, disponibili su richiesta). Gli algoritmi sottostanti sono descritti in Sieprath et al. ¹ .

1. Assicurarsi che FIJI sia installato e funzionante.
2. Avviare FIJI e installare il macro (Plugins -> Macro -> Installa ...). Questo richiamerà un certo numero di nuovi comandi macro, nonché un insieme di strumenti di azione per ottimizzare le impostazioni di analisi, come mostrato nella Figura 3A .
3. Aprire l'interfaccia di impostazione per impostare le impostazioni di analisi facendo clic sul pulsante "S" ( Figura 3B ).
   1. Selezionare il tipo di immagine, il numero di canali e il pozzetto utilizzatoPer l'acquisizione di immagini piane.
   2. Indicare quale canale contiene le cellule (canale CM-H ₂ DCFDA) o mitocondriali (canale TMRM) e regolare i parametri di pre-elaborazione e di segmentazione per ciascun canale a seconda della qualità dell'immagine ( Figura 3B ). Selezionare le caselle di controllo 'Contesto' e 'Contrasto' per eseguire rispettivamente la sottrazione di sottofondo o il contrasto limitato dell'istogramma adattativo limitato ¹⁶ . Definire un sigma per la sfocatura Gaussian delle cellule e la valorizzazione laplaciana dei mitocondri. Selezionare un algoritmo automatico di soglia e compilare i limiti di esclusione di dimensioni (in pixel). Se si sceglie una soglia fissa anziché un algoritmo automatico di soglia, riempire la soglia superiore.
   3. Testare le impostazioni di segmentazione su alcune immagini selezionate dei set di dati acquisiti aprendole e facendo clic sui pulsanti 'C' o 'M' nel menu per la segmentazione cellulare o mitochondria rispettivamente,E regolare eventualmente le impostazioni. Un esempio di risultato è mostrato in Figura 3C .
4. Esegui l'analisi batch sulle cartelle interessanti facendo clic sul pulsante "#" e selezionando la cartella con le immagini. Per questa cartella verrà generata una nuova directory 'Output' contenente singoli set ROI (file zip) e file di risultato (.txt) per immagine. Per entrambi i canali il file di risultati contiene descrittori di intensità e morfologici. Il file dei risultati del canale CM-H ₂ DCFDA (cellule) contiene per ogni descrittore il valore medio dei ROI combinati all'interno di un'immagine. Per il canale TMRM, il file di risultati contiene per ogni descrittore il valore per ogni ROI mitocondriale segmentato individualmente.
5. Dopo l'analisi dei lotti, verificare visivamente le prestazioni di segmentazione su un 'stack di verifica', un hyperstack di tutte le immagini con il rispettivo overlay ROI facendo clic sul pulsante 'V'. In questo modo, artefatti come l'over-/ Undersegmentation, immagini fuori fuoco o particelle di polvere / fibre in immagini possono già essere individuate rapidamente. Ulteriori cure possono essere effettuate durante il controllo della qualità dei dati (cfr. §8).

8. Analisi dei dati, controllo qualità (QC) e visualizzazione

L'elaborazione e l'analisi dei dati grezzi avviene utilizzando freeware statistiche R (http://www.rproject.org - versione 3.3.2) e RStudio (http://www.rstudio.com/ - versione 1.0.44). Per ottenere rapidamente e visualizzare i risultati, è stata concepita un'intuitiva applicazione lucida ¹⁷ (disponibile su richiesta) che integra e visualizza i dati in calore e boxplots e svolge anche analisi statistiche. In generale, il flusso di lavoro comprende due passaggi consecutivi. In primo luogo, i dati vengono elaborati e ispezionati per piastra da 96 pozzetti per rilevare punti dati aberranti. In secondo luogo, i dati curati da tutte le piastre di un determinato esperimento vengono combinati e analizzati utilizzando multi non parametricheVariano i test ¹⁸ e un'analisi dei componenti principali.

1. Assicurarsi che R e RStudio siano installati e funzionanti.
2. Avviare RStudio.
3. Apri l'applicazione lucida di RedoxMetrics e fai funzionare l'applicazione (scelga di eseguirla in un browser esterno).
4. Nella pagina "input", selezionare la directory in cui si trovano i file di risultati di RedoxMetrics.ijm.
5. Assicurarsi che 'Setup.xlsx' (creato nello step 3.15) sia presente anche all'interno di questa directory.
6. I file di risultati e le informazioni di installazione vengono automaticamente importati, riorganizzati e visualizzati.
   1. La pagina "installazione sperimentale" mostra il layout dell'esperimento. Utilizza questa pagina per verificare.
   2. La pagina successiva "risultati per piastra" mostra i dati di ciascuna piastra separatamente in un layout a piastra multi-well e in boxplots con outliers etichettati con ben nome e numero di immagine. Quest'ultimo consente un'ispezione facile e identIficazione di punti dati aberranti (valori estremamente alti o bassi rispetto ai valori medi misurati per quel trattamento specifico - vedere la figura 4 per un esempio).
      Usando queste informazioni, verificare le immagini corrispondenti ai punti aberranti. Se vengono rilevate anomalie, devono essere rimosse dall'analisi. La maggior parte delle anomalie sono causate da una segmentazione impropria quando la parte (parte) dell'immagine è fuori fuoco o quando particelle di polvere altamente fluorescenti disturbano la corretta segmentazione. I casi estremi possono essere già individuati rapidamente utilizzando lo strumento di verifica dello stack (passaggio 7.5), ma in questo passaggio vengono rilevati eventi più sottili. Quando non si trova alcuna ragione apparente o tecnica per il valore aberrante, l'immagine non deve essere rimossa dall'analisi.
   3. Facoltativo: crea un nuovo foglio di lavoro denominato "Drop.xlsx" con solo una colonna chiamata "Drop". In questa colonna elenca i nomi dei file (incluso l'estensione ".tif") di tutte le immaginiChe devono essere rimossi dall'analisi (identificati nel passaggio 7.5 o 8.6.2). Carica questo file utilizzando la pagina "input".
   4. La pagina "Risultati dell'esperimento intero" mostra i risultati di tutte le piastre combinate. Se è stato caricato un file di rilascio, questo file viene utilizzato per rimuovere i punti dati specificati dall'analisi.
      Per ogni parametro singolarmente, i dati vengono normalizzati per piastra in base ai rispettivi comandi. I dati di tutte le piastre vengono quindi combinati, seguiti da test multivariati non parametrici dal pacchetto nparcomp ¹⁸ . Se vengono confrontati solo 2 trattamenti vengono eseguiti due campioni per il problema non parametrico Behrens-Fisher. Per più di 2 trattamenti, viene utilizzato un test di confronto multiplo basato sul contrasto non parametrico. I risultati vengono visualizzati utilizzando i boxplots.
   5. La pagina "analisi cluster" mostra i risultati di un'analisi dei componenti principali (pacchetto PCA - R core 'stats'). Dati da 5 parametri (baSal & inducibile ROS e potenzialità della membrana mitocondriale, dimensioni e circolarità) sono combinati per discriminare i diversi trattamenti basati su un profilo redox sensibile. A tal fine, viene eseguita un'analisi dei componenti principali (PCA) (pacchetto R core 'stats'). I risultati vengono visualizzati utilizzando un biplot (pacchetto ggbiplot - http://github.com/vqv/ggbiplot).
   6. Utilizza la pagina "dati di download" per scaricare i frame di dati del backend che contengono i dati elaborati e riorganizzati in modo che possano essere riutilizzati per visualizzare visivamente i dati o analizzare statistiche più avanzate.
      NOTA: Le tipiche insidie ​​e soluzioni potenziali sono elencate nella tabella 1 .

Risultati

Il dosaggio è stato valutato utilizzando diversi esperimenti di controllo, i cui risultati sono descritti in Sieprath et al. ¹ . In breve, la risposta di fluorescenza di CM-H ₂ DCFDA e TMRM a variazioni indotte in modo estraneo nei ROS intracellulari e in ψ _m, è stata quantificata per determinare la gamma dinamica. Per CM-H ₂ DCFDA, NHDF ha mostrato un aumento lineare nel segnale di fluorescenza quando trattato con conc...

Discussione

Questo documento descrive un metodo di microscopia ad alto contenuto per la quantificazione simultanea dei livelli ROS intracellulari e morfofunzione mitocondriale in NHDF. La sua performance è stata dimostrata con un caso di studio sul NHDF trattato con SQV. I risultati supportano evidenze precedenti dalla letteratura in cui sono stati osservati livelli aumentati di ROS o disfunzione mitocondriale dopo il trattamento con inibitori della proteasi HIV di tipo 1, anche se in esperimenti separati ¹⁹

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM)	ThermoFisher Scientific	T668
CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator)	ThermoFisher Scientific	C6827
Dimethyl sulfoxide	Sigma)Aldrich	D8418
MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded	Brooks life science systems	MGB096-1-2-LG-L
HBSS w/o Phenol Red 500 mL	Lonza	BE10-527F
DMEM high glucose with L-glutamine	Lonza	BE12-604F
Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg	Lonza	BE17-516F
HEPES 1 M 500 mL	Lonza	17-737F
Trypsin-Versene (EDTA) Solution	Lonza	BE17-161E
Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson	711-166-152	Antibody used for acquiring flat-field image
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson	711-546-152	Antibody used for acquiring flat-field image
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Nikon Ti eclipse widefield microscope	Nikon
Perfect Focus System (PFS)	Nikon		hardware-based autofocus system
CFI Plan Apo Lambda 20X objective	Nikon
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module	Nikon		This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol
ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g
RStudio Version 1.0.44	Rstudio
R version 3.3.2