Un metodo versatile di patterning proteine ​​e cellule

Riepilogo

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Abstract

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

Introduzione

In ingegneria dei tessuti e biosensori, la capacità di controllare l'organizzazione spaziale delle proteine e cellule su scala micron, è diventato sempre più importante negli ultimi quarant'anni ^{1, 2, 3.} Precise organizzazione spaziale delle proteine e cellule ha permesso ai ricercatori di esaminare l'interazione tra cellule e substrati contenenti tipi simili o diversi di cellule, per guidare la crescita cellulare, e immobilizzare biomolecole per la fabbricazione di biosensori ^{4, 5, 6, 7, 8, 9.}

Gli attuali metodi di proteine ​​patterning includono photopatterning e stampa microcontact. Photopatterning utilizza materiale sensibile alla luce, che viene reticolato in seguito all'esposizione ad ultruna viola (UV). Luce UV diretta a un fotomaschera (costituito da aree trasparenti con le regioni più scure per prevenire la trasmissione della luce UV) provoca la reticolazione in regioni specifiche che possono poi essere utilizzati per successivo fissaggio dei biomateriali o celle ^{10, 11.} Mentre questo schema è molto preciso e consente un controllo preciso della topografia della superficie cultura, è limitato a biomolecole sensibili ai raggi UV che possono essere modellati da radiazione UV ^12. Stampa microcontact è un altro metodo popolare di patterning proteine specifiche ^{13, 14.} In questo metodo, un silossano (PDMS) timbro poli-dimetil viene trattata con una varietà di reagenti modifica della superficie prima di essere stati immersi in una soluzione del substrato biomolecolare prescelto. E 'poi delicatamente pressato su un vetrino di vetro o di altra superficie così "stamping" biomolecole sulla superficie cultura. However, stampaggio è limitata al tipo di materiale che può essere trasferito, nonche la bagnabilità di biomolecole alla superficie del timbro PDMS ^15.

Patterning diretto delle cellule può essere più difficile e si basa su metodi complessi come substrati commutabili, metodi basati stencil, o patterning con specifiche molecole di adesione cellulare ^{16, 17.} Questi metodi sono limitati nella loro capacità di cellule modello a causa della mancanza di substrati di adesione cellulare compatibili, incompatibilità del processo di lavorare con cellule sensibili biologiche e vincoli, incoerenza nel riprodurre il patterning e complessità della procedura. Ad esempio, con i substrati commutabile, substrati personalizzati devono essere progettati per ogni tipo di cellula, per passare la loro adesione a specifici tipi cellulari senza degradazione per esposizione alla luce UV e calore utilizzato nel processo ^17, < class = sup "xref"> ^{18, 19, 20.} metodi di patterning basata Stencil sono versatili nella loro capacità di cellule del modello; Tuttavia, è difficile produrre matrici PDMS a spessori adeguati per l'utilizzo ^{16, 21.} L'iniezione diretta di cellule in canali microfluidica PDMS hanno alcuni vantaggi quali: 1) facilità di fabbricazione di canali microfluidica e 2) di idoneità per molte cellule e substrati diversi. Tuttavia, il problema prevalente di cattura bolla d'aria durante il processo di iniezione a causa della idrofobicità del PDMS senza l'uso di pulizia al plasma, o altri metodi per ridurre bolle d'aria, rende difficile creare costantemente cellule modellata su superfici di vetro o di plastica ^21.

Questo lavoro si espande su capillare micromolding ^{22, 23,}lass = "xref"> ^{24, 25, 26} e riporta un metodo per iniettare proteine e cellule sospensioni in microcanali. Il metodo utilizzato qui dimostra la patterning dei substrati ed entrambi patterning diretto e indiretto di specifici tipi cellulari. Questa tecnica supera l'elevata idrofobicità di PDMS ed elimina la presenza di bolle durante l'iniezione del substrato o da cellule sfruttando la permeabilità ai gas di PDMS ^27. Questo documento dimostra l'uso della tecnica con diversi substrati diversi e tipi di cellule. L'articolo evidenzia anche la fabbricazione di stampi per la litografia morbido utilizzando la fotolitografia convenzionale nonché una semplice ed adesivo a basso costo metodo nastro utile risorse limitate impostazioni ^{28, 29.}

Protocollo

NOTA: Si prega di consultare tutte le schede di sicurezza materiale pertinente (MSDS) prima dell'uso. Alcune delle sostanze chimiche utilizzate in questo protocollo sono tossici e cancerogeni. Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza adeguati (cappa, cassetto portaoggetti) e dispositivi di protezione individuale (occhiali, guanti, camice da laboratorio, pantaloni a figura intera, scarpe chiuse) quando si usano materiali tossici o acido / base.

1. Realizzazione del Maestro Stampo per Soft litografia mediante fotolitografia

1. Disegnare il layout delle microcanali utilizzando uno strumento di disegno computer-aided design (CAD).
2. Stampa il layout su un piatto maschera vuoto utilizzando la maschera laser scrittore.
3. Risciacquare un wafer di silicio da 4 pollici con acetone mediante isopropanolo e asciugare con una pistola ad aria azoto per garantire che nessun solvente viene lasciato sul wafer.
4. Disidratare wafer mediante cottura su una piastra calda a 200 ° C per 5 min.
5. Selezionare un fotoresist negativo progettata per l'altezza desiderata dei microcanali. Fo esempio, utilizzare fotoresist negativo SU-8 50 per ottenere microcanali con un'altezza di 50 micron.
6. Lasciare il wafer raffreddare a temperatura ambiente, e quindi allineare il wafer sul mandrino di coater rotazione.
7. Dispensare 4 ml (1 mL diametro / pollice della fetta) di fotoresist negativo sul centro della fetta.
8. Spin cappotto il wafer con un ciclo di centrifuga in due fasi utilizzando un filatore. Innanzitutto, applicare un ciclo di diffusione di 500 rpm con un'accelerazione di 100 rpm / s per 10 s. Quindi applicare un ciclo di centrifuga di 2000 giri con un'accelerazione di 300 rpm / s ² per 30 s per ottenere un rivestimento 50 micron di photoresist su un wafer.
9. Morbido cuocere il wafer in due fasi su un piatto caldo secondo le istruzioni del produttore. Per un rivestimento 50 micron di photoresist, prima pre-cuocere il wafer a 65 ° C per 6 minuti e poi subito rampa della temperatura della piastra calda per lasciare cuocere il wafer a 95 ° C per 20 min.
10. Lasciare il wafer raffreddare a temperatura ambiente e quindi caricare ilwafer sul palco litografia.
11. Allineare la maschera sul wafer utilizzando maschera allineatore ed esporre la fetta di luce UV (come da istruzioni del produttore) ad una intensità di 1,5 mW / cm ² per 146 s per applicare la dose totale UV di 220 mJ / cm ² necessario per un 50 micron di spessore strato di resina fotosensibile.
12. Applicare dopo l'esposizione cuocere al wafer in due fasi su un piatto caldo. Per un rivestimento di 50 micron di photoresist, prima pre-cuocere il wafer a 65 ° C per 1 min e immediatamente rampa della temperatura della piastra calda per lasciare cuocere è a 95 ° C per 5 min.
13. Sviluppare il wafer in immergendo il wafer di SU-8 sviluppatore e scuotendo delicatamente fino a quando le caratteristiche diventano chiari sul wafer. Sviluppare il wafer per ~ 6 min per il photoresist spessore 50 micron.
14. Risciacquare eccesso sviluppatore con isopropanolo ed etanolo, quindi asciugare il wafer con una pistola ad aria azoto.
15. Duro cuocere il wafer di silicio su una piastra calda a 150 ° C per 15 min.
16. Posiziona ilwafer in un essiccatore con 25 ml di agente silanizzazione tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-triclorosilano.
    NOTA: L'agente silanizzazione è corrosivo, quindi dovrebbe essere utilizzato in un cappa acido / base, con attrezzature adeguate di protezione individuale (occhiali, guanti, camice, pantaloni a figura intera, chiuso-toe scarpe).
17. Applicare il vuoto per 5 minuti ed esporre il wafer ai vapori di silano per 30 minuti senza rilasciare il vuoto.
18. Trasferire il wafer in una capsula di Petri opportunamente dimensionato.

2. Realizzazione del Maestro Stampo per Soft litografia con nastro adesivo

1. Disegnare il layout delle microcanali utilizzando uno strumento di disegno CAD e stampare il disegno su carta bianca.
2. Pulire un vetrino abbastanza grande per ospitare il disegno con isopropanolo e poi asciugare il vetrino con un fucile ad aria.
3. Attaccare il nastro adesivo sul vetrino pulito. Non essere attenti a intrappolare eventuali bolle d'aria.
4. Nastro lati della glass scivolare sulla carta con il disegno, con il nastro rivolta verso l'alto.
5. Utilizzare un bisturi per tagliare il nastro sul vetrino utilizzando il disegno di carta come riferimento e quindi rimuovere il nastro da aree indesiderate del vetrino.
6. Sciacquare il vetrino con isopropanolo e asciugare con un fucile ad aria. Cuocere il vetrino in stufa a 65 ° C per 30 min.
7. Delicatamente rotolare sopra il nastro con un rullo di gomma per rimuovere le bolle d'aria e consentire la slitta raffreddare a temperatura ambiente.

3. soft litografia fabbricazione dei dispositivi PDMS

1. Mescolare PDMS elastomero e il suo agente di indurimento in un rapporto di 10: 1 (w: w), agitare la miscela vigorosamente, e quindi degassare la miscela ponendolo in una camera a vuoto fino bolle d'aria vengono visualizzati nella miscela.
2. Versare il composto su uno stampo di silicone silanizzata o muffa nastro adesivo in una capsula di Petri per ottenere un ~ 2 spesso strato di PDMS e Degas mm fino a quando tutta l'aria bolle scompaiono.
3. Curare il PDMS in un fornoa 65 ° C per 2 h.
4. Utilizzare un bisturi per tagliare lo strato PDMS di almeno 5 mm di distanza dalle caratteristiche e poi sbucciate le PDMS curato fuori lo stampo con pinzetta.
5. Effettuare un singolo foro di ingresso con una biopsia 1 millimetro punzone ovunque sul microcanali, preferibilmente al termine di una rete di microcanali, come mostrato nella figura 2a e 4b.
6. Pulire i PDMS espressi con del nastro adesivo per rimuovere le particelle di polvere adsorbiti sul dispositivo. Sterilizzare il dispositivo microcanali PDMS (PDMS Cast) risciacquando con una soluzione di etanolo al 70% seguita da deionizzata sterile dell'acqua (DI), e esporre a UV per 30 min.
7. Tenere il dispositivo PDMS sterile in una capsula di Petri sterile fino al momento dell'uso.

4. substrato Patterning

1. Posizionare il PDMS sterili espressi con una pinzetta su un vetrino di vetro sterile o capsula di Petri e applicare una leggera pressione con la punta delle pinzette.
   NOTA: Il cast PDMS fa una conforme, ma tenuta reversibili con la glass vetrino o una scatola Petri formando microcanali senza l'uso di alcun adesivo.
2. Posizionare una goccia (20 - 40 ml) della soluzione di substrato sull'ingresso copre completamente il foro di immissione. Motivo Poly-D-lisina (PDL) posizionando una goccia 20 ml di PDL in tampone sodio tetraborato in ingresso dei microcanali.
3. Mettere la capsula di Petri in un vuoto di ~ 254 mmHgA (equivalente ad alloggiare vuoto in laboratori biologici) per 10 minuti, e osservare l'aria che esce dal canale nella forma di bolle.
4. Rilasciare il vuoto e osservare la soluzione di substrato che scorre nel microcanali.
5. Incubare il piatto alle condizioni adeguate per il substrato aderenza. Vedere Tabelle 1 e 2 per le condizioni di incubazione (questi variano a seconda del substrato). Per PDL patterning, incubare per 1 ora a 37 ° C.
6. sbucciare con cautela il timbro PDMS con una pinzetta sterile e lavare il modello sul vetrino di vetro tre volte con acqua deionizzata.
7. Aggiungere una soluzione 1% di siero albumina bovina (BSA) per capsula di Petri per coprire il piatto o vetro coprioggetto e incubare una notte a 37 ° C.
   NOTA: Ciò consentirà di ridurre l'aderenza non specifico nelle regioni non rivestiti.
8. Aspirare off la soluzione BSA 1% e il substrato modellato è ora pronto per l'uso.

5. Patterning indiretta di celle

1. Preparare la sospensione cellulare in terreno di coltura privo di siero. Il tipo di cellula e densità cellulare sono elencati nella Tabella 1.
2. Aggiungere la sospensione cellulare al piatto modellato Petri e sommergere completamente la regione modellata in sospensione cellulare.
3. Incubare la piastra di Petri a 37 ° C in un incubatore per 15 minuti per permettere alle cellule di allegare al substrato modellato.
4. Aspirare la sospensione cellulare in eccesso dalla piastra di Petri e lavare le cellule fantasia tre volte con tampone fosfato (PBS) mentre delicatamente agitazione per 10 s per rimuovere le cellule senza legami.
5. Aggiungere l'unamezzo di coltura ppropriate alle colture cellulari fantasia e incubare le cellule modellata a 37 ° C in un incubatore CO _2.

6. Patterning diretta delle cellule

NOTA: Questa tecnica è un'alternativa al patterning cella indiretta descritto nel passaggio 5. Tuttavia, a differenza del passaggio 5, in questa tecnica cellule sono modellati su superfici coltura tissutale con o senza rivestimento substrato.

1. Sterilizzare il dispositivo microfluidico risciacquando con una soluzione di 70% di etanolo seguito da acqua DI.
2. Immergere il dispositivo notte in una soluzione di 1% BSA per impedire l'adesione cellulare ai PDMS.
3. Essiccare il dispositivo a temperatura ambiente e fissarlo al fondo del piatto Petri coltura di tessuti trattati.
4. Preparare la sospensione cellulare in terreni di coltura privo di siero. Il tipo di cellula e densità cellulare sono elencati nella Tabella 2.
5. Inserire una gocciolina (4 - 8 ml) della sospensione cellulare, sufficiente a riempire lamicrocanali, sull'ingresso coprendo completamente il foro di immissione.
6. Mettere la capsula di Petri in un vuoto per 10 minuti e osservare aria proveniente dal canale in forma di bolle. Il vuoto e osservare la sospensione cellulare scorre nel microcanali.
7. Incubare la piastra di Petri in un incubatore per favorire l'adesione delle cellule secondo le condizioni di incubazione (dipende dal tipo di cellula modellata) indicato nella Tabella 2. Aggiungere PBS alla capsula di Petri immergendo il dispositivo PDMS.
8. Sbucciare la PDMS con cautela la capsula di Petri con una pinzetta e lavare il modello con PBS. Aggiungere terreni di coltura cellulare per la piastra di Petri e posizionare la coltura cellulare in incubatrice.

Risultati

Questo metodo consente di patterning di proteine ​​e patterning indiretta di cellule utilizzando dead-end canali microfluidica con dimensioni piccole come 10 micron e le attrezzature disponibili in quasi tutti i laboratori biologici una volta lo stampo maestro è fatto. Questa tecnica può essere utilizzata con canali microfluidici PDMS creata usando fotolitografia tradizionali morbido, o con canali microfluidici PDMS creati con nastro adesivo di fabbricazione (Figura 1)

Discussione

Mentre fotolitografia convenzionale è una tecnica ben consolidata per la realizzazione di stampi per litografia soft, attrezzature, materiali e competenze necessarie per utilizzare fotolitografia convenzionale non sono facilmente disponibili al maggior parte dei laboratori. Per i laboratori senza accesso a queste risorse, abbiamo presentato adesivo fabbricazione nastro come un metodo per creare stampi con caratteristiche relativamente semplici per dispositivi microfluidici. Questo metodo permette qualsiasi laboratorio ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools	Corel Corporation, Canada	X4 Version 14.0.0.701	CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device
Laser Printer HP	Hewlett Packard, CA	1739629	Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique
Bel-Art Dessicator	Fisher Scientific, MA	08-594-16B	Used to degass the PDMS mixture
Adhesive Scotch Tape	3M Product, MN	Tape 600	Used to fabricate adhesive tape Master
PDMS Sylgard 184	Dow Corning, MI	1064291	Casting polymer
Petri Dish	Fisher Scientific, MA	08-772-23	Used to keep the mold to cast with PDMS
Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11)	Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan	2976#11	Used to cut the PDMS
Tweezers	Ted Pella, CA	5627-07	Used to handle the PDMS cast during peeling
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-546-2	Used as surface to pattern the Substrate
Glass slides	Fisher Scientific, MA	12-544-4	Used as surface to pattern the Substrate
Rubber Roller	Dick Blick Art Materials, IL	40104-1004	Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles
Laser Mask Writer	Heidelberg Instruments, Germany	DWL66fs	Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process
EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool)	EV Group, Germany	EVG 620T(B)	Used to expose the photoresist to UV light
Spin Coater Headway	Headway Research Inc, TX	PWM32-PS-CB15PL	Used to spin coat the photoresist on silicon wafer
Photoresists SU-8 50	MicroChem, MA	Y131269	Negative photoresist used for mold fabrication
SU-8 Devloper	MicroChem, MA	Y020100	Photoresist developer
Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane	UCT Specialties, PA	T2492-KG	Coat mold to avoid PDMS adhesion
Isopropanol	Sigma-Aldrich, MO	190764	Cleaning Solvent
Ethanol	Sigma-Aldrich, MO	24102	Sterilization Solvent
Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)	Sigma-Aldrich, MO	P0899-10MG	PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer
Laminin	Sigma-Aldrich, MO	L2020	Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use
BSA	Fisher Scientific, MA	BP1605100	Cell culture
C2C12 Myoblast cell lline	ATCC, VA	CRL-1722	Used to demonstrate C2C12 patterning
PC12 Cell Line	ATCC, VA	CRL-1721	Used to demonstrate PC12 patterning
Collagen type 1, rat tail	BD Biosciences	40236	Cell culture
DMEM	GIBCO, MA	11965-084	Cell culture
Horse Serum, heat inactivated	Fisher Scientific, MA	26050-070	Cell culture
Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC)	Sigma-Aldrich, MO	P1951	To label cells
Calcein-AM live dead cell Assay kit	Invitrogen, MA	L-3224	Cell viability Assay
Biopsy Hole Punch	Ted Pella, CA	15110-10	Punched hole in PDMS