Singolo Analisi Molecola di laser localizzati psoraleni addotti

Riepilogo

I laser sono spesso utilizzati in studi di risposta cellulare al danno del DNA. Tuttavia, essi generano lesioni la cui spaziatura, frequenza, e collisioni con forcine di replicazione sono raramente caratterizzati. Qui, descriviamo un approccio che consente la determinazione di questi parametri con laser localizzato legami crociati interstrand.

Abstract

La risposta al danno del DNA (DDR) è stato ampiamente caratterizzato in studi di rotture dei filamenti doppi (DSB) indotta dal laser micro irradiazione con fascio di cellule vive. DDR a Helix distorsione modificazioni covalenti DNA, tra interstrand legami crociati DNA (ICL), non è così ben definita. Abbiamo studiato la DDR stimolato da ICL, localizzato dalla fotoattivazione laser di psoraleni immunotagged, nei nuclei delle cellule vive. Per affrontare domande fondamentali sulla distribuzione addotto e incontri replica forcella, abbiamo combinato localizzazione laser con altre due tecnologie. fibre di DNA sono spesso utilizzati per visualizzare l'avanzamento delle forche di replicazione mediante immunofluorescenza di analoghi nucleosidici, incorporati durante impulsi brevi. puntini Immunoquantum sono stati ampiamente utilizzati per l'imaging singola molecola. Nel nuovo approccio, fibre di DNA da cellule portatrici laser localizzato ICLs sono distribuite su vetrini da microscopio. Le targhette ICL vengono visualizzati con punti immunoquantum e the distanze tra le lesioni determinate. collisioni replica forcella con ICL possono essere visualizzati e diversi modelli incontro identificate e quantificate.

Introduzione

DNA è sotto costante aggressione dagli agenti esogeni come radiazione, luce ultravioletta, tossine ambientali, prodotti di combustione, ecc Inoltre, è attaccato anche da specie radicaliche endogene prodotte dal metabolismo ossidativo. Tutti questi hanno il potenziale di distruggere chimicamente o fisicamente l'integrità del DNA ^1. Perturbazioni nel genoma possono attivare la risposta al danno del DNA (DDR), un reclutamento e post traslazionale modifica a cascata con centinaia, se non migliaia, di proteine ​​e microRNA coinvolti nella riparazione della lesione, regolazione del ciclo cellulare, apoptosi, senescenza e vie infiammatorie ^2.

La maggior parte delle nostre informazioni sulla DDR viene da studi con DSB. Ciò è in gran parte a causa della disponibilità di tecnologie per introdurre le pause, comprese le pause sequenza specifica, nel DNA genomico nelle cellule viventi ^3. Inoltre, il propensity di pause per indurre foci di proteine ​​DDR, che possono essere visualizzati mediante immunofluorescenza, è stato molto utile per identificare la cinetica ei requisiti di proteine ​​rispondere. Una delle tecnologie chiave per lo studio della DDR è stato introdotto da Bonner e colleghi, che ha usato un raggio laser per dirigere una striscia di DSB in una "regione di interesse" (ROI) nei nuclei delle cellule viventi ^4. In effetti, hanno creato un lungo fuoco in cui le proteine ​​del DDR potevano essere identificati mediante immunofluorescenza. Ciò è stato illustrato dalla loro dimostrazione della forte banda di fosforilata H2AX istone (γ-H2AX) nelle cellule esposte laser. Da allora, l'approccio laser è stata impiegata in numerosi studi della DDR indotti da DSBs. Anche se potente e popolare, e la fonte di immagini di immunofluorescenza drammatiche, va notato che nella maggior parte degli esperimenti l'intensità del laser viene regolata in modo da produrre risultati osservabili, senza preoccupazione per l'identità della lesione,densità, o spaziatura. In effetti, può essere difficile fare queste stime. Così essi sono in gran parte ignorati, nonostante la molteplicità delle lesioni introdotte nel DNA da laser ^5. Ciò contribuisce a molte contraddizioni nella letteratura ^6.

In contrasto DSB, la maggior parte delle modificazioni chimiche del DNA non stimolano la formazione di foci discreta di proteine ​​DDR. Questo è importante alla luce della nostra attuale comprensione delle frequenze lesione. È stato stimato che le cellule umane in coltura incorrere ben 50 DSBs per ciclo cellulare, formati principalmente durante la fase S ^{7, 8, 9.} Meno sono formate in cellule non proliferanti. Ciò contrasta con il numero di perdite nucleobase o eventi di modifica, che sono nell'ordine delle decine di migliaia per cellula / giorno ^{1, 10.} Così, sappiamo di più diDDR indotta da eventi che sono relativamente rare, e molto meno di quelli indotti dalla elica distorsione lesioni, che complessivamente sono molto più comuni.

Per affrontare domande circa la risposta cellulare al modificazioni covalenti di DNA genomico, abbiamo voluto lavorare con un'elica distorcere addotto del DNA che ha avuto l'attività DDR induzione intrinseca. Inoltre, per facilitare la progettazione sperimentale e interpretazione che sono interessati una struttura la cui introduzione potrebbe essere controllato rispetto al tempo ed era suscettibile di visualizzazione. Di conseguenza, abbiamo sviluppato una strategia basata su psoraleni. Psoraleni sono ben caratterizzati intercalanti del DNA fotoattivi favorendo 5' TA: AT siti. A differenza di altri agenti reticolanti quali mostarde azotate e mitomicina C (MMC) non sono DNA reattivi meno esposta a onde lunghe luce UV (UVA). Le molecole intercalate reagiscono con basi timina su filamenti opposti per produrre elica distorsione reticolazioni interstrand (ICL) ^11. Con la psoralen trimetil utilizzato nei nostri esperimenti maggior parte dei prodotti sono ICL, relativamente pochi monoadducts vengono generati (meno del 10%), ¹² e reticola intraelicoidali tra basi adiacenti su un filo non si formano. Perché sono potenti blocchi di replicazione e la trascrizione, psoraleni e altri agenti di reticolazione, come cis-platino e MMC, sono comunemente utilizzati in chemioterapia. Così psoralen abilitato studi che hanno seguito l'attivazione del DDR da una struttura distorsione elica, e anche fornito informazioni sulla risposta cellulare ad un composto con importanza clinica.

Abbiamo sintetizzato un reagente in cui trimetil psoraleni era legato alla digossigenina (DIG), uno steroli vegetali non trovato nelle cellule di mammifero e spesso usato come immunotag. Il requisito di fotoattivazione consente localizzazione dalla luce laser (365 nm) di ICLs psoraleni in ROI definita nei nuclei nelle cellule viventi. Questi possono essere visualizzati immunofluorescence contro il tag Dig. La riparazione del DNA e le proteine DDR apparsi nelle strisce di laser localizzati ICL ^{13, 14.}

DDR attivato dalle intensità laser elevate utilizzate per produrre DSB potrebbe essere causa di danni isolati o cluster ^{15, 16.} Di conseguenza, la pertinenza dei risultati di questi esperimenti presenti in natura, lesioni presenti a concentrazioni molto più basse, è incerto. Per far fronte a domande simili sulla frequenza addotto psoraleni e spaziatura in DNA, abbiamo approfittato della tecnologia in fibra DNA ¹⁷ e puntini immunoquantum. punti quantici sono molto maggiori coloranti fluorescenti e non sono sbiancati dall'esposizione alla luce. Così essi sono spesso utilizzati per l'imaging singola molecola ^18, un'applicazione per cui coloranti fluorescenti sono sufficientemente brillante. fibre di DNA individuali possono essere allungati su gscivoli lass e possono essere visualizzati mediante immunofluorescenza contro analoghi nucleosidici incorporati durante l'incubazione prima alla cella raccolto. Abbiamo trattato cellule con Dig-psoralene e esposti ROI fino micro laser irradiazione. Fibre sono state preparate dalle cellule e singoli addotti Dig-psoralene potrebbe essere visualizzato con i puntini immunoquantum. Esponendo le cellule ad analoghi nucleosidici per tempi relativamente brevi (20-60 min) permette la visualizzazione dei tratti di replica in prossimità del laser localizzato ICL.

Protocollo

1. Preparazione di Dig-TMP

1. Mescolare 50 mg (0,18 mmoli) di 4'-clorometil-4,5' , 8-trimethylpsoralen e 590 mg (2,7 mmoli) di 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-ammina in 25 mL asciutto rotondo pallone -bottom sotto azoto. Aggiungere 10 ml di toluene e riflusso per 12 ore. Rimuovere il solvente in un evaporatore rotante sotto pressione ridotta.
   1. Purificare il residuo da cromatografia flash su colonna su gel di silice. Eluire la colonna con cloroformio, metanolo, e la soluzione di ammoniaca al 28% (9: 1: 0,5). Evaporare il solvente in un evaporatore rotante sotto pressione ridotta, e recuperare il puro 4 '- [N- (13-ammino-4,7,10-trioxatrideca)] amminometil-4,5', 8-trimethylpsoralen come giallo paglierino viscoso liquido.
   2. Mescolare 5,5 mg (0,012 mmoli) di 4 '- [N- (13-ammino-4,7,10-trioxatrideca)] amminometil-4,5', 8-trimethylpsoralen con 5 mg (0,008 mmoli) di estere NHS in digossigenina asciutto pallone a fondo tondo sotto azoto. Aggiungere 0,5 ml di dimetil formammide anidra (DMF) und 3.4 ml di trimetilammina e agitare a 50 ° C per 18 h.
   3. Rimuovere il solvente in un evaporatore rotante sotto pressione ridotta.
   4. Sciogliere il residuo in quantità minima di diclorometano. Applicare la soluzione in 2 punti uL orizzontalmente lungo la parte inferiore di una piastra preparativa su strato sottile di gel di silice come fase stazionaria. Eseguire il TLC preparativa in cloroformio: metanolo: ammoniaca 28% (8: 1: 0,1).
   5. Mascherare la piastra tranne per i bordi verticali e identificare la banda di prodotto con lunghezza d'onda corta UV 254 nm lampada. Raschiare il prodotto dalla piastra con una spatola e isolare il prodotto puro con cloroformio: metanolo: idrossido di ammonio 28% (8: 1: 0,1) miscela.
   6. Rimuovere solventi in evaporatore rotante sotto pressione ridotta. Sciogliere il pellet residuo in 1 ml di 50% EtOH: H ₂ O, dispensare in aliquote di 50 microlitri in provette da 1,5 mL (~ 20 Aliquote) e secco in un evaporatore centrifugo finché tutto il solvente è evaporato (~ 3 h).
   7. Riprendere ciascuna aliquota in 200 microlitri di 50% EtOH: H ₂ O e asciugare nuovamente in un evaporatore centrifugo. Sciogliere ciascuna aliquota di nuovo in 200 ml di 50% EtOH: H ₂ O, secco in un evaporatore e conservare centrifughe pellet a -20 ° C per una conservazione a lungo termine.
2. Per l'uso, sciogliere il precipitato in 50 ml di 50% EtOH: H ₂ O. Preparare una diluizione 1: 100 del disciolto Dig-TMP in H ₂ O e misurare OD a 250 nm. Il coefficiente di estinzione di Dig-TMP è 25.000. La soluzione è stabile per circa un mese se conservato a -20 ° C. Verificare la concentrazione misurando OD a 250 nm prima di ogni uso.
   1. Calcola concentrazione stock: Abs x 100 x10 ⁶ / 25.000 = concentrazione (in micron). In genere la soluzione di riserva è di circa 3 mm. È importante essere in questo intervallo per ridurre al minimo il volume di EtOH aggiunto al mezzo.

2. Laser localizzati Dig-TMP ICL

1. Perform localizzazione laser con un microscopio confocale con un laser ad azoto SRS (337 nm) pompato attraverso una cella colorante che emette una linea di 365 nm e cottura 3 ns impulsi a 10 Hz, con una potenza di 0,7 nW.
2. Fare un segno verticale sul lato di un vetro 35 millimetri a fondo piatto di coltura cellulare con un pennarello. Graffiare il cross al centro del vetro sulla superficie cultura con una penna diamante tale che la striscia nera sul lato del piatto è nella parte superiore di un braccio della croce. La croce è segnata sulla superficie di crescita del vetro in modo che le cellule e sarà nello stesso piano focale.
3. Sterilizzare la piastra dopo marcatura con un risciacquo di 70% EtOH. Asciutto prima placcatura le cellule.
4. cellule piastra (ceppi di laboratorio standard come HeLa o U2OS) nella croce assegnati in piatti di coltura di uno o due giorni prima. Cellulare dovrebbe essere attivamente dividendo e il 50-70% confluenti il ​​giorno dell'esperimento. Incubare 24 h con 1 uM 5-cloro-2-deossiuridina (CldU) per DNA etichetta uniformemente.
5. InserisciDig-TMP in 50% EtOH: H ₂ O per mezzo di coltura cellulare ad una concentrazione finale di 20 pM. Portare il mezzo a 37 ° C. Cambiare il mezzo sulle cellule e posto in incubatore (37 ° C, 5% CO ₂₎ per 30 min per permettere il Dig-TMP equilibrare.
6. Mentre le cellule sono incubando, stabilire le coordinate x / y del campo visivo in cui il laser è attivo. Seguire la procedura di calibrazione del produttore, in cui il laser è diretto dal software per incidere un vetrino a specchio lungo una linea orizzontale e diagonale. Le due linee definiscono i confini del campo in cui il laser può colpire un bersaglio.
7. Si pone la placca nella camera ambientale, a 37 ° C con controllata CO ₂ ed umidità, sul palco microscopio e mettere a fuoco con l'obiettivo 60X olio sulla intersezione della croce.
8. Dirigere il fascio laser 365 nm ad una ROI, stabilita dallo sperimentatore con lo strumento forma nel software, per formare una striscia di 3 &# 181; mx 0,6 micron. Il contorno della ROI viene collocata dal cursore in nuclei delle cellule situate nelle immediate vicinanze dell'intersezione della croce. Regolare il piano focale z per indirizzare la metà laser attraverso il nucleo. Utilizzare un laser nel range di 350-370 nm. 405 nm laser non possono indurre reticolazioni ^19.
   NOTA: Noi individuare il ROI nelle zone nucleoplasmic fuori della nucleoli, che può essere distinto da nucleoplasm in contrasto interferenziale differenziale (DIC) imaging.
9. Verificare il focus e l'attività del laser, aumentando l'impostazione di potenza ad un livello sufficiente per cancellare una cella (la cella si scurisce e quindi scompaiono). Questo è un importante diagnostico per un percorso ottico senza ostacoli per il laser attraverso il microscopio e poi attraverso il vetrino e nelle cellule.
   1. Abbassare l'impostazione della potenza di appena sufficiente per attivare il psoraleni e l'ICL indotta DDR (questo deve essere determinato empiricamente per ogni laser / microfonoROSCOPE combinazione). Utilizzare un'intensità del laser impostazione (1,7% qui) che non attiva il DDR in assenza di psoralene (monitorato dalla formazione di γ-H2AX).
      NOTA: Questa è una determinazione importante e le impostazioni possono richiedere una regolazione se la sorgente laser o di un componente nel percorso ottico è cambiato. Seguire l'accumulo di GFP tag proteine ​​di riparazione come XPC o FAN1, entrambi i quali sono rapidamente reclutati (in secondi) alle strisce psoraleni laser, ma non al ROI esposto al solo laser. Alcune proteine ​​del DDR appaiono in pochi secondi, mentre diversi minuti possono essere richiesti per gli altri. E 'necessario effettuare determinazioni corso di tempo per ogni proteina di interesse. Si segnala altresì che in cellule che non sono stati esposti al laser non ci sono strisce di proteine ​​rispondere.
10. Dopo che tutte le celle in un campo sono stati indirizzati spostare la piastra in un campo, rimanendo vicino alla intersezione della croce.
11. Negli esperimenti progettati per determine la distribuzione delle distanze tra l'lesione esporre cellule al laser in 20-25 campi (4-5 cellule / campo) intorno all'intersezione. Al fine di analizzare i modelli di replica in prossimità delle ICL localizzate incubare le cellule con 10 micron 5-iodo-2-deossiuridina (IDU) dopo la cottura del laser.
    NOTA: Il tempo di incubazione con Idu è un po 'arbitraria. Abbiamo usato il più corto di 20 minuti e fino a 60 minuti (vedi sotto). impulsi più lunghi (poche ore) spesso sfociano in molteplici tratti di replica coalescenza, perdendo così l'opportunità di immagine il progresso di singole forcelle. In alcuni esperimenti ces sono etichettati con CldU per 24 ore in maniera uniforme DNA etichetta prima dell'esposizione a Dig-TMP seguita da etichettatura impulso di tratti di replica.

3. Raccolta di cellule e di fibre Stretching DNA

1. Rimuovere la piastra dal palco, rimuovere il terreno, e lavare con tampone fosfato (PBS). Rimuovere la soluzione PBS. Mettere una goccia 10 ml di un tripsina commerciale/ EDTA sulla intersezione della croce al centro della superficie del vetro.
2. Incubare per 3-4 minuti a temperatura ambiente (RT) e quindi disegnare la soluzione di tripsina con le cellule staccate nella punta della pipetta. Non v'è alcuna necessità di neutralizzare la tripsina.
3. Posizionare la goccia di tripsina / EDTA con le cellule ad un'estremità di un silanizzata vetrino per microscopio. Lisare le cellule e rilasciare il DNA mediante aggiunta di 10 ml di soluzione 0,5% SDS e incubare per 3-4 minuti a temperatura ambiente mescolando delicatamente con la punta della pipetta, consentendo la periferia della piscina ad asciugare.
4. Inclinare il vetrino 20 ° e consentire al liquido di scorrere fino alla fine. Le fibre di DNA vengono estesi / allungato dalle forze idrodinamiche del liquido che scorre. Lasciare asciugare i vetrini all'aria (~ 10 min) e fissare in 3: 1 metanolo / acido acetico per 10 min. Rimuovere i vetrini dalla soluzione correzione e l'aria secca di nuovo. A questo punto si possono conservare indefinitamente in 70% EtOH a -20 ° C. Rimozione dal EtOH 70% lasciare asciugare all'aria prima della nestep xt.
5. Lavare i vetrini in PBS, e quindi denaturate in 2.5 M HCl per 1 ha RT. Questo trattamento depurinates messa nucleobasi alogenati incorporate accessibili agli anticorpi DNA.
6. Neutralizzare i vetrini in 0,4 M Tris-HCl, pH 7,4. Lavare due volte in PBS / 0.5% Tween-20 (PBST) per 5 minuti ciascuna.
7. Blocco vetrini con 5% di albumina sierica bovina (BSA) e 10% siero di capra in PBS. Coprire i vetrini delicatamente con un parafilm per diffondere la soluzione di saturazione uniformemente sul vetrino e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
8. Pipettare 100 ml di 1: 200 diluizione in soluzione bloccante di ratto anti-bromodeossiuridina (rileva specificamente CldU) anticorpo primario per ogni diapositiva. Coprire i vetrini delicatamente con un parafilm per diffondere la diluizione uniformemente sul vetrino e incubare in una camera umidificata per 1 ha RT. Rimuovere il parafilm e lavare i vetrini tre volte in PBST per 5 minuti ciascuna.
9. Pipettare 100 ml di diluito (1: 100) di capra anti-topo Alexa Fluor 647 in soluzione bloccante per ogni diapositiva. coprire ilscivola delicatamente con un parafilm e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente. Lavare i vetrini tre volte in PBST per 5 minuti ciascuno.
10. Pipettare 100 ml di diluito (01:40) topo anti-bromodeossiuridina (rileva ldu e CldU Questa doppia specificità richiede il blocco CldU dal ratto contro BrdU in incubazione precedente.) Anticorpo primario e coniglio anti-DIG anticorpi (1: 200 ) in soluzione bloccante per ogni diapositiva. Coprire i vetrini delicatamente con un parafilm e incubare in una camera umidificata per 1 ha RT. Lavare i vetrini tre volte in PBST per 5 minuti ciascuno.
11. Dispensare 100 ml di diluito (1: 100) capra anti-topo Alexa Fluor 488 ec (1: 5.000) sonda anti-coniglio di capra (ad esempio, Qdot 655) in soluzione bloccante per ogni diapositiva. Coprire i vetrini delicatamente con parafilm e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente. Lavare i vetrini tre volte in PBST per 5 minuti ciascuno.
12. Drenare eccesso PBST su un tovagliolo di carta. Aggiungere 50 ml di antifade mezzo di montaggio su ciascun vetrino e coprire con un coprioggetto. Immagine o negozio pernon più di 48 ore a -20 ° C.

4. Imaging fibra da microscopia a fluorescenza

1. Eseguire l'acquisizione di immagini attraverso un obiettivo 63X su un microscopio invertito con annessa ruota portafiltri completamente motorizzato con FITC, Cy5 e Q Dot 655 rilevamento. Il filtro di eccitazione è 425 nm, e il filtro di emissione è 655 nm con 20 nm centrata in corrispondenza del picco di emissione ^20.

Risultati

Localizzate Dig-TMP (Figura 1A) ICLs laser possono essere visualizzati mediante immunofluorescenza contro la Dig-tag collegato al psoraleni. Anche se il laser può essere diretto a colpire in un'area di qualsiasi contorno, le strisce non sono forme "naturali" nelle cellule, e segnali legittimi possono essere facilmente distinguibili da artefatti dovuti al legame non specifico degli anticorpi primari o secondari. Questa funzione è utile quando si utilizzano...

Discussione

La tecnologia di localizzazione laser richiede l'uso di cellule aderenti con nuclei che sono visibili in microscopia in campo chiaro. Abbiamo cercato di attaccare le cellule non aderenti, quali linfociti primari o cellule coltivate debolmente aderenti come AD293, alla superficie di vetro con preparazioni adesive cella come polilisina o collagene, o miscele più complesse. Anche se questi trattamenti possono legarsi alle cellule di superficie, troviamo che essi rimangono generalmente arrotondata che rende molto diffi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digoxigenin NHS ester	Sigma-Aldrich	11333054001
Chloro-psoralen	Berry and Associates	PS 5000
diaminoglycol	Sigma-Aldrich	369519	4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine
Chloroform	Acros Organics	423550040
Methanol	Fisher Scientific	A4524
Ammonium solution	Sigma-Aldrich	5002
TLC plates	Analtech, Inc.	P02511
Flass glass column 24/40, 100 mL	Chemglass Life Sciences	CG-1196-02
Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder	Perkin Elmer		With Volocity Software
Micropoint Galvo	Andor Technologies		with a Nitrogen pulsed laser
dye cell	Andor Technologies	MP-2250-2-365
365 dye	Andor Technologies	MP-27-365-DYE
IdU	Sigma-Aldrich	17125
35 mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10 mm glass diameter, uncoated	Matek	P35G-1.5-10-C
microscope slides	New Comer Supply	Part # 5070	New Silane Slides
Mouse anti BrdU antibody (IdU)	BD Biosciences	347580	1 in 40
Rat anti BrdU Antibody (CldU)	Abcam	ab6326	1 in 200
Rabbit anti Dig antibody	ThermoFisher Scientific	710019	1 in 200
Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG	ThermoFisher Scientific	Q-11421MP	1 in 5,000
AF647- goat anti Rat IgG	Jackson Immunoresearch	112-605-167	1 in 100
AF488-goat anti mouse IgG	Jackson Immunoresearch	115-545-166	1 in 100
Zeiss epifluorescent microscope A200	Zeiss		with Axiovision software
Q-dot 655 filter	Chroma	39107