Metodi in vitro per il confronto obiettivo vincolante e CDC induzione Tra terapeutiche Anticorpi: Applicazioni nel Analisi Biosimilarity

Riepilogo

Questo protocollo descrive il confronto in vitro di due funzionalità funzionali chiave di rituximab: indotta da bersaglio e da induzione a dipendenza della citotossicità (CDC). I metodi sono stati impiegati per un confronto tra rituximab di riferimento e biosimilar di rituximab. Questi test possono essere impiegati durante lo sviluppo biosimile o come controllo di qualità nella loro produzione.

Abstract

Gli anticorpi monoclonali terapeutici (mAb) sono rilevanti per il trattamento di diverse patologie, inclusi i tumori. Lo sviluppo di mAb biosimilar da parte delle aziende farmaceutiche è un'opportunità di mercato, ma è anche una strategia per aumentare l'accessibilità dei farmaci e ridurre i costi associati alla terapia. I protocolli qui descritti descrivono la valutazione della binding target e l'induzione del CDC da rituximab nelle cellule Daudi. Queste due funzioni richiedono diverse regioni strutturali dell'anticorpo e sono rilevanti per l'effetto clinico indotto da rituximab. I protocolli permettono il confronto side-by-side di un rituximab di riferimento e un biosimilar di rituximab commercializzato. I prodotti valutati hanno mostrato differenze sia in associazione target e induzione CDC, suggerendo che esistano differenze fisico-chimiche che sottendono e evidenziano la necessità di analizzare l'impatto di tali differenze nell'ambiente clinico. I metodi qui riportati sono semplici e poco costosi in vitro/ Em> modelli per la valutazione dell'attività dei biosimilari rituximab. Così, essi possono essere utili durante lo sviluppo biosimilare, nonché per il controllo della qualità nella produzione biosimilare. Inoltre, i metodi presentati possono essere estrapolati ad altri anticorpi monoclonali terapeutici.

Introduzione

Anticorpi terapeutici sono anticorpi monoclonali ricombinanti (mAbs) sviluppati per il trattamento di diverse patologie, incluso il cancro, autoimmuni e malattie croniche, disturbi neurologici, e altri ^1. Attualmente, la FDA ha concesso l'approvazione a più di 40 anticorpi monoclonali terapeutici, e più si prevede di raggiungere il mercato nei prossimi anni.

Rituximab è un anticorpo monoclonale chimerico IgG1 ad alta affinità approvato per il trattamento del linfoma CD20 ⁺ cellule B non-Hodgkin (NHL), CD20 ⁺ NHL follicolare, leucemia linfatica cronica, e l'artrite reumatoide ^{2, 3.} Il riconoscimento del CD20, che è sovraespressa in cellule B, da Rituximab induce apoptosi; attivazione del complemento; e cellule anticorpo-dipendente citotossicità mediata (ADCC) ^3. I brevetti di questo farmaco sono scaduti in Europa e negli Stati Uniti nel 2013 e 2016, Rispettivamente. Così, le aziende farmaceutiche di tutto il mondo stanno sviluppando biosimilari rituximab. Come in qualsiasi altro farmaco per il consumo umano, biosimilari richiedono l'approvazione da agenzie di regolamentazione. Le linee guida internazionali indicano che per anticorpi monoclonali, biosimilarity deve essere dimostrata confrontando le caratteristiche fisico-chimiche, la farmacocinetica, l'efficacia e la sicurezza dei nuovi prodotti e di riferimento ^4.

Di conseguenza, le metodologie utilizzate per le comparazioni devono valutare le caratteristiche strutturali e funzionali dei mAbs, in particolare quelli con rilevanza clinica. A tal fine, saggi in vitro mostrano diversi vantaggi rispetto esperimenti in vivo (recensiti Chapman et al.) ^5: i) in vitro sono più sensibili alle differenze tra il prodotto biosimilare e il riferimento proposto; ii) studi in vivo devono essere eseguite in specie, le quali sono per vari mAbsprimati non umani; e iii) poiché il meccanismo d'azione, la tossicologia preclinica, e gli effetti clinici del prodotto di riferimento sono ben noti, in studi in vivo con biosimilari non possono fornire ulteriori informazioni utili. Di conseguenza, guida dell'Unione europea per biosimilari consente ai candidati di entrare in studi clinici basati su robusti dati in vitro solo ^6.

Qui vi presentiamo due saggi veloci, economiche e semplici che valutano l'attività biologica di rituximab utilizzando cellule in coltura CD20 ^+. Questi test possono essere inclusi come parte dell'esercizio di comparabilità per i candidati biosimilari rituximab.

Protocollo

1. Valutazione del legame di target mediante citometria a flusso

1. Preparazione di materiali biologici e reagenti
   1. Realizzare 500 ml di terreno di coltura RPMI integrato con 10% di siero di bovini fetali inattivati ​​termicamente (H-IFBS).
   2. Cultura Le cellule del linfoma di Daudi Burkitt (Daudi) e le cellule di Daudi GFP ⁺ utilizzando RPMI e colaschi di coltura da 75 cm. Mantenere le colture a 37 ° C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO ₂ fino a raggiungere 6 - 9 x 10 ⁵ cellule / ml.
   3. Creare 50 ml di tampone di colorazione diluendo 1/100 H-IFBS in PBS; Questo tampone è stabile a 2 - 8 ° C per almeno un mese.
   4. Preparare le soluzioni di prova per il riferimento e mAb biosimilar. Effettuare dieci diluizioni seriali 1: 2 (500 μL ciascuna) nel tampone di colorazione, a partire da 5 μg / mL.
   5. Utilizzare il tampone di colorazione per diluire IgG umano (controllo isotipo) a 5 μg / mL e IgG anti-umano del mouse PE-Cy5 (anticorpo secondario) al concentratura suggerito dal produttore.
   6. Preparare 4% paraformaldeide in PBS (tampone di fissaggio).
2. obiettivo vincolante
   1. Raccogliere il Daudi e sospensioni cellulari Daudi GFP ⁺ dai palloni di coltura da 75 cm ² e trasferirli in una provetta da centrifuga da 15 ml. Centrifugare a 400 xg per 5 min.
   2. Lavare le cellule aggiungendo 5 ml di PBS e centrifugare la sospensione cellulare a 400 xg per 5 min.
   3. Risospendere le cellule in PBS ed eseguire un numero di celle e analisi redditività con trypan blu. Utilizzare culture con livelli vitalità cellulare ≥ 95% per l'analisi.
   4. Diluire la sospensione cellulare a 4 x 10 ⁶ cellule / ml con tampone di colorazione fredda.
   5. In tubi da microcentrifuga da 1,5 ml, aggiungere 50 ml di sospensione cellulare a 100 ml di differenti concentrazioni di prova per il riferimento o mAbs biosimilari. Includere repliche per ogni condizione sperimentale.
   6. Preparare le provette aggiuntive per ilControllo isotipo (IgG1 umano invece di rituximab) e controllo negativo (anticorpo secondario senza anticorpo primario).
   7. Incubare a 4 ° C per 20 - 30 min.
   8. Lavare le cellule aggiungendo 1 mL di PBS e centrifugando la sospensione cellulare a 400 xg per 5 minuti a 10 ° C. Scartare il surnatante.
   9. Sospendere le cellule in 100 μL dell'anticorpo secondario e incubare per 20-30 minuti a 4 ° C, protetto dalla luce.
   10. Lavare le cellule due volte con PBS e sospendetele in 200 μl di buffer di fissaggio.
   11. Analizzare le celle su un citometro di flusso.
       NOTA: Il segnale rimane stabile per diversi giorni se i campioni sono memorizzati a 4 ° C e protetti dalla luce.
3. Acquisizione dei dati
   1. Aprire due diagrammi a punti in un foglio di lavoro del software operativo del flusso citometrico. Imposta l'FSC-A nei confronti di FSC-H nel primo e l'FSC-A nei confronti di SSA-A nel secondo. Aprire un istogramma per il canale PE-Cy5.
   2. Nella trama FSC-A e FSC-H fare una porta (R1) che seleziona gli eventi singoli ( Figura 1A ).
   3. Impostare la popolazione R1 nel punteggio FSC-A e SSA-A e quindi fare una nuova porta (R2) selezionando le cellule target ( Figura 1B ). Impostare la popolazione R2 nell'istogramma di intensità PE-Cy5 per visualizzare la distribuzione di frequenza delle celle.
   4. Regolare il limite inferiore di intensità di fluorescenza (FI) per il canale PE-Cy5 usando il controllo negativo e isotipo ( Figura 1C ).
   5. Acquisire 10.000 eventi all'interno di R2 dal campione con la concentrazione più elevata del prodotto di riferimento. FI di questo campione dovrebbe essere il più alto atteso ( Figura 1C ).
   6. Acquisire il resto dei campioni.
   7. Per ogni campione, ottenere l'intensità media di fluorescenza (MFI) nel canale PE-Cy5.
   8. Per i campioni con riferimento o mAb biosimilar, calcolare la differenza tra il campione MFI e quello del controllo isotipo (ΔMFI).

2. Valutazione del CDC

1. Preparazione di materiali biologici e reagenti
   1. Preparare il terreno di coltura cellulare e coltivare le cellule Daudi e Daudi GFP ⁺ come descritto in precedenza (passaggi 1.1.1 - 1.1.2).
      NOTA: Inoltre, il dosaggio CDC richiede RPMI senza siero.
   2. Diluire il normale complemento umano umano (NHSC) 1: 2 con RPMI senza siero. Preparare 2,5 ml.
   3. Preparare 1 mL di NHSC disattivato a caldo (30 min / 56 ° C) diluito 1: 2 con RPMI.
   4. Preparare set di soluzioni di test per il riferimento e mAbs biosimilar in RPMI senza siero. Fate dieci diluizioni (200 μL ciascuna) da 1 a 0,025 μg / ml.
2. Esame CDC
   1. Raccogliere le cellule Daudi e Daudi GFP ⁺ dalle culture e quantificare la vitalità cellulare (vedere punti 1.2.1 - 1.2.3).
   2. Preparare una sospensione cellulare con 4 x 10 ⁵ cellule / mL in RPMI senza siero.
   3. Inserisci50 ml di sospensione cellulare a 50 microlitri di ogni riferimento o concentrazione biosimilare prova mAb a 96 pozzetti conico (V) -bottom micropiastre. Includere repliche per ogni condizione sperimentale.
   4. Preparare pozzi addizionali per il controllo negativo (cioè senza mAb), controllo morte basale (cioè, inattivato al calore NHSC in presenza di mAb), ed il controllo positivo di colorazione (ossia, cellule esposte a 50 ml di 70% EtOH).
   5. Incubare le cellule per 20 - 30 min a 37 ° C in un'atmosfera umidificata CO ₂ 5%.
   6. Aggiungere 50 ml di NHSC (diluito 1: 2) a ciascun pozzetto e incubare le cellule opsonizzati per 2,5 ore a 37 ° C in un'atmosfera umidificata CO ₂ 5%. Utilizzare NHSC inattivato al calore nei pozzetti di controllo della morte basali.
   7. Centrifugare a 400 xg per 5 min a 10 ° C. Eliminare il surnatante.
   8. Lavare le cellule aggiungendo 150 ml di PBS e centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 400 xg e 10 ° C. diScardare il surnatante.
   9. Stain i campioni con 7-aminoactinomycin (7-AAD), come precedentemente descritto ^{7 , 8} .
   10. Analizzare le cellule su un citometro di flusso nello stesso giorno.
3. Acquisizione dei dati
   1. Aprire due diagrammi a punti in un foglio di lavoro del software operativo del flusso citometrico. Impostare i diagrammi come nei passaggi 1.3.1 - 1.3.3 ( Figura 2A-B ). Creare una terza trama che è un punto-plot per GFP rispetto a 7-AAD nella popolazione R2.
   2. Definire i limiti FI adeguati utilizzando le cellule Daudi, le cellule Daudi GFP ⁺ e il controllo positivo di morte ( Figura 2C ).
   3. Per ogni campione, misurare la percentuale di celle target 7-AAD ⁺ . Acquisire almeno 5.000 eventi da R2.
   4. Calcolare la citotossicità specifica indotta da mAb sottraendo la percentuale di 7-AAD ⁺ nel controllo della morte basale dalla percentuale trovata nei campioni con differenteConcentrazioni di mAbs ( Figura 2D ).

3. Analisi della biosimilarità

1. Inserisci i valori di concentrazione e risposta in un software di grafica.
2. Generare grafici e calcolare regressioni non lineari con le seguenti considerazioni: i) utilizzare la trasformazione log della concentrazione mAb come "X"; Ii) utilizzare il modello matematico a pendenza variabile (Y = risposta minima + (risposta massima - risposta minima) / 1 + 10 ^ ((LogEC ₅₀ -X) * pendenza della collina)); E iii) vincolare i valori inferiori a zero, poiché la risposta basale è stata sottratta.
   NOTA: si prevedono curve con forma sigmoidale simmetrica.
3. Confronta entrambi i dispositivi non lineari con una configurazione globale utilizzando un test F (molti programmi software grafici includono questa funzione).
   NOTA: Tali test stabiliscono l'ipotesi nullo che la risposta massima, logEC ₅₀ e la pendenza Hill sono uguali per i due set di dati, che corrispondono adomanda biologica destinato ad essere affrontato.

Risultati

Usando i protocolli sopra descritti, il binding obiettivo e l'induzione CDC di rituximab di riferimento sono stati confrontati in parallelo con quelli di un rituximab biosimilar prodotto e commercialmente disponibile in Asia.

Nelle cellule di Daudi, entrambi i mAb hanno legato CD20 in modo dipendente dalla concentrazione ( Figura 1D ). Le regressioni non lineari dei dati di legame hanno mostrato una r

Discussione

La scadenza brevettuale di un mAb terapeutico sta promuovendo lo sviluppo di biosimilari. Pertanto, vi è la necessità di metodi semplici che possono identificare le differenze nelle attività clinicamente rilevanti di questi prodotti. Le cellule colture CD20 ⁺ sono state impiegate per la valutazione di due funzioni funzionali chiave di rituximab: binding target e induzione CDC. L'attività precedente richiede il riconoscimento di CD20 dalla regione Fab della mAb, mentre quest'ultima dipende principa...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640 medium	ATCC	30-2001	Modify the culture depending on the cell line
Trypan Blue solution	Sigma	T8154	0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Daudi Burkitt's Lymphoma Cells	ATCC	CCL-213	You can modify the cell line depending on the antibody of interest
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO	16000-044	You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line
Normal Human Serum Complement	Quidel	A113	It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications
7AA-D	BDPharmigen	559925	You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability.
PECy5 Mouse Anti-human IgG	BDPharmigen	551497	Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer
Human IgG Isotype Control	ThermoFisher Scientific	07-7102	Change depending to mAb
BDCytofix	BDPharmigen	554655	Flow Cytometry Fixation Buffer (1 - 4% formaldehyde or paraformaldehyde )
PBS pH 7.4 10x (Phosphate buffer saline)	GIBCO	70011-044	Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free.
Cell culture plates 96 well, V-bottom	Corning	29442-068	12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U-bottom microtiter plates
MabThera (Rituximab)	Roche	—	Reference product
Rituximab	Indian	—	Biosimilar product
15- or 50-mL conical centrifuge tubes	Corning	430290 or 430052	—
Pipette Tips	Eppendorf	—	Multiple volume configurations are necessary
Pipettes	Eppendorf	—	Adjustable-volume pipettes are necessary
Centrifuge 5430/ 5430R model	Eppendorf	—	Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 °C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g
Flow cytometer	BD Dickinson	—	BD FACSAria III or other flow cytometer
Olympus optical and light microscope	Olympus	—	To quantify and evaluate cell growth
Incubator	SANYO	—	Incubatorfor temperature and CO2 control to culture cells
Biological Safety Cabinet	CHC BIOLUS	—	Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment.