Una perlina accoppiato e matrice di magnete per lo stampaggio di micropozzetti con geometrie variabili concavi

Riepilogo

Questo manoscritto presenta un metodo affidabile di fabbricare micropozzetti concavi senza la necessità di complesse strutture di costi elevati. Usando la forza magnetica, perline in acciaio e una matrice di attraverso-foro, diverse centinaia micropozzetti sono stati formati in un substrato di polidimetilsilossano (PDMS) 3 x 3 cm.

Abstract

Una cultura di sferoide è uno strumento utile per comprendere il comportamento cellulare in quanto fornisce un in vivo-come ambiente tridimensionale. Vari metodi di produzione di sferoide come superfici non-adesivo, boccette filatore, impiccagione gocce e micropozzetti sono stati utilizzati in studi di interazione della cellula--cellula, immunitario-attivazione, lo screening, staminali differenziazione cellulare e generazione organoid. Tra questi metodi, micropozzetti con una geometria tridimensionale concava hanno guadagnato l'attenzione di scienziati e ingegneri, dati loro vantaggi di generazione sferoide uniforme di dimensioni medie e la facilità con cui possono essere le risposte di sferoidi individuali monitorati. Anche se sono stati proposti metodi economici come l'uso di membrane flessibili e ghiaccio Litografia, queste tecniche comportano gravi inconvenienti quali difficoltà nel controllare le dimensioni del reticolo, raggiungimento di elevati rapporti di aspetto e la produzione di aree più grandi di micropozzetti. Per superare questi problemi, vi proponiamo un metodo affidabile per la realizzazione di micropozzetti concavi senza la necessità di complesse strutture di costi elevati. Questo metodo utilizza una matrice di foro passante 30x30, diverse centinaia di micrometro-ordine acciaio perle e la forza magnetica per fabbricare 900 micropozzetti in un substrato di polidimetilsilossano (PDMS) 3 x 3 cm. Per dimostrare l'applicabilità del nostro metodo per applicazioni biologiche delle cellule, abbiamo coltivate cellule staminali adipose per 3 giorni e prodotto con successo utilizzando la nostra piattaforma microtiter sferoidi. Inoltre, abbiamo effettuato una simulazione di magnetostatica per studiare il meccanismo, per cui la forza magnetica è stato utilizzato per intrappolare le sfere d'acciaio nei fori. Noi crediamo che il metodo di fabbricazione microtiter proposto potrebbe essere applicato a molti studi cellulari basati su sferoide quali lo screening di stupefacenti, rigenerazione tissutale, differenziazione delle cellule staminali e metastasi del cancro.

Introduzione

Le cellule coltivate in una forma sferoide sono più simile a tessuto reale nel corpo di una coltura planare bidimensionale¹. Dato questo vantaggio, l'uso di sferoidi è stata adottata per migliorare lo studio della interazione cellula-cellula^2,3, immunitario-attivazione⁴,⁵e⁶di differenziazione di screening di stupefacenti. Inoltre, sferoidi incorporando più tipi di cellule sono stati applicati recentemente a organoids (quasi-fisiologiche tessuto tridimensionale (3D)), che sono molto utili per studiare lo sviluppo e la malattia umana⁷. Diversi metodi sono stati utilizzati per produrre sferoidi. Il metodo più semplice prevede l'utilizzo di una superficie non-adesivo, tale che le cellule di aggregazione con gli altri e sferoidi di forma. Una capsula di Petri può essere trattata con albumina di siero bovino, pluronic F-127 o un polimero idrofobico (ad es. in metacrilato di 2-hydroxyethl poli) per rendere la sua superficie non adesivo⁸⁹. Il metodo del filatore-pallone è un altro ben noto mezzo di produrre grandi quantità di sferoidi^10,11. In questo metodo, le cellule sono tenute in sospensione da mescolando per impedire loro di diventare attaccato al substrato. Invece, il galleggiante cellule aggregato di sferoidi di forma. Il metodo superficiale non adesivo e il filatore boccetta metodo può produrre grandi quantità di sferoidi. Tuttavia, essi sono soggetti a limitazioni compreso le difficoltà nel controllare la dimensione della sferoide, come pure il tracciamento e monitoraggio di ogni sferoide. Come rimedio a tali problemi, un altro metodo di produzione della sferoide, vale a dire, l'impiccagione metodo drop può essere autonomo¹². Si tratta di deposito di gocce di sospensione cellulare sulla parte inferiore del coperchio di una piastra di coltura. Queste gocce sono di solito da 15 a 30 µ l di dimensioni e contengono circa 300 a 3000 cellule¹³. Quando il coperchio viene invertito, le gocce sono tenute in posizione dalla tensione superficiale. L'ambiente di microgravità in ogni goccia si concentra le cellule, che poi formano sferoidi singoli presso l'interfaccia liquido-aria libera. I vantaggi dell'impiccagione metodo drop sono che offre una distribuzione delle dimensioni ben controllato, mentre è facile da tracciare e monitorare ogni sferoide, riguardante i metodi di boccetta di superficie e spinner non adesivo. Tuttavia, questo metodo comporta uno svantaggio in quanto la produzione massiccia di sferoidi e il processo di produzione stesso è eccessivamente labor intensive.

Una matrice di micropozzetti è un piatto piatto con molti micro-dimensione pozzi, ciascuno con un diametro che varia da 100 a 1000 µm. Il principio di produzione di sferoide quando utilizzando micropozzetti è simile a quella del metodo superficiale non adesivo. I benefici includono il fatto che i micropozzetti forniscano spazi tra i micropozzetti per separare le cellule o sferoidi, tale che è facile controllare la dimensione di sferoide, mentre anche lo rende facile da monitorare ogni singola sferoide. Con un gran numero di micropozzetti, produzione di alto-rendimento sferoide è anche possibile. Un altro vantaggio di micropozzetti è l'opzione per pozzi di forma di diverse forme (hexahedral, cilindrico, trigonal prismatico) a seconda di unici scopi sperimentali degli utenti. In generale, tuttavia, una forma di tridimensionale (3D) concava (o emisferica) è considerata come essendo il più adatto per la produzione di uniforme-dimensioni singoli sferoidi. Di conseguenza, l'utilità di micropozzetti concavi è stato segnalato per molti studi di biologia cellulare come quelli esame del cardiomyocyte differenziazione delle cellule staminali embrionali¹⁴, la secrezione dell'insulina delle cellule dell'isolotto cluster¹⁵, la attività enzimatica di epatociti¹⁶e la farmacoresistenza tumorale sferoidi¹⁷.

Purtroppo, la fabbricazione di micropozzetti spesso richiede strutture specializzate micropatterning; metodi convenzionali basati su fotolitografia richiedono esposizione e strutture in via di sviluppo mentre metodi basati su ion-acquaforte reattive bisogno apparecchiature plasma e il fascio di ioni. Tale attrezzatura è costosa che, insieme con il processo di fabbricazione complicati, presenta un'elevata barriera all'entrata per i biologi che non hanno accesso alla microtecnologia. Per superare questi problemi, altri metodi economici come ghiaccio Litografia¹⁸ (con le goccioline di acqua congelata) e il metodo di membrana flessibile¹⁴ (utilizzando una membrana, substrato del attraverso-foro e un vuoto) sono stati suggeriti. Tuttavia, questi metodi inoltre incorrere in seri inconvenienti come fosse difficile controllare le dimensioni del modello, il raggiungimento di elevati rapporti di aspetto e la produzione di più grande zona micropozzetti.

Per superare i problemi di cui sopra, stiamo proponendo un metodo di fabbricazione del romanzo concavo microtiter utilizzando un substrato del attraverso-foro, le perline in acciaio e una matrice di magnete. Utilizzando questo metodo, centinaia di micropozzetti sferici concavi può essere fabbricato sfruttando il meccanismo di perline metalliche autobloccanti magnetico-forza-assistita (Figura 1). Il processo di fabbricazione prevede l'utilizzo di pochissimi servizi costosi e complicati e non richiede molte competenze avanzate. Come tale, anche addestrato può facilmente intraprendere questo metodo di fabbricazione. Per illustrare il metodo proposto, umano-adiposo-ha derivato le cellule staminali sono state coltivate nei pozzetti concavi per produrre sferoidi.

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Protocollo

1. preparazione del attraverso-foro alluminio piastra e magnete una matrice

1. Preparare due 50 mm x 50 mm (o superiore) piastre in alluminio. Lo spessore di ogni piatto era 300 µm che è la metà del diametro del tallone.
2. Costituiscono una matrice di attraverso-foro di 30 x 30 su una delle piastre in alluminio utilizzando un incisore rotativo di CNC con un po' di micro punta Φ550-µm con 30 mm/s di tasso di tuffo e 8000 RPM di velocità dell'alberino. La distanza tra ogni foro (da centro a centro) era 1 mm (Figura 1a e 2a Figura, io).
3. Costituiscono una matrice di 30 x 30 di fori Φ750-µm sull'altra piastra di alluminio, utilizzando la stessa procedura come descritto nella 1.2 (Figura 1a e 2a Figura, ii).
4. Collegare le due piastre vicenda utilizzando un nastro adesivo e formare fori di allineamento di mm Φ3 a ciascuno dei quattro angoli di entrambe le piastre in alluminio.
5. Immergere le piastre di alluminio in 15% di acido solforico per 12 h pulire le superfici. Dato che il sottile strato di ossido di alluminio sulla superficie dell'alluminio lo rendono resistente alla corrosione, il diametro del foro e lo spessore della piastra non vengono modificate da questo trattamento acido.
6. Costituiscono una matrice di 30 × 30 di 1 x 1 x 1 magneti di neodimio mm (con una forza magnetica di 0.363 N). Garantire che ogni magnete è la polarità opposta al suo vicino. Per evitare la rottura o la dispersione della matrice magnete, attaccare una piastra di alluminio di 30 x 30 mm sul fondo della matrice magnete utilizzando nastro biadesivo (Figura 2a, iii e inserto in Figura 2).

2. processo di registrazione dei colori perlina

1. Allineare e impilare le due piastre di alluminio (piastra superiore: 750-µm-foro piastra, piastra inferiore: 550-µm-foro piastra) utilizzando i fori di allineamento preparati ai quattro angoli di ciascuna piastra (Figura 1b).
2. Bloccare le due piastre insieme inserendo M3 bulloni nei fori di allineamento e quindi fissare i bulloni con dadi (Figura 1b).
3. Impilare la piastra di alluminio sulla matrice preparato magnete (Figura 1b, 2be 2C). Allineare la matrice dei magneti e la matrice di attraverso i fori nella piastra di alluminio durante il processo di sovrapposizione. Quindi utilizzare un nastro adesivo per fissare la posizione della matrice magnete.
4. Posto un numero sufficiente di acciaio mm SUJ2 Φ600 perline sull'Assemblea di piatto e manipolare le perle utilizzando un acryl (o non-metallici) piastra tali che una perlina diventa intrappolata in ogni buco (Figura 1C, 1De 1e) mentre simultaneamente rimuovendo le perline in eccesso che non hanno presentato nei fori.
5. Rimuovere delicatamente la piastra superiore per evitare indesiderate scattering e la dislocazione dei branelli intrappolati (Figura 1f).

3. concavo microtiter fabbricazione

1. Spostare lo stampo concavo microtiter, prodotto nei passaggi 2.1 a 2.5, sopra, a una piastra di Petri.
2. Mescolare il polidimetilsilossano (PDMS) monomero e agente indurente in base istruzioni^{19 del produttore} con un monomero PDMS: rapporto di 10:1 catalizzatore di vulcanizzazione.
3. De-gas la miscela PDMS utilizzando un essiccatore e pompa a vuoto per rimuovere eventuali bolle intrappolate nella miscela PDMS.
4. Versare nello stampo concavo microtiter PDMS e de-gas utilizzando la stessa procedura come descritto al punto 3.3 (Figura 1f).
5. Cuocere il composto PDMS su una piastra riscaldante a 80 ° C per 2 h formare un substrato PDMS tallone-embedded (Figura 1 g).
6. Rimuovere il substrato PDMS curato dallo stampo (Figura 1 g). Nel processo di rimozione, spruzzare di metanolo con bottiglia di lavaggio per staccare il substrato PDMS dallo stampo.
7. Utilizzando un Φ15 x 2 mm magnete, rimuovere le sfere d'acciaio intrappolate dal substrato PDMS (Figura 1 h). Per questo processo, può essere utilizzato qualsiasi magnete che è sufficientemente forte per estrarre le perle dal substrato PDMS.

4. cultura sferoide

1. Tagliare il substrato PDMS concavo microtiter-fantasia utilizzando un pugno di biopsia di mm Φ14 per essere montati nella piastra a 24 pozzetti in questo studio.
2. Sterilizzare il substrato PDMS di mm Φ14 risultante in una sterilizzatrice autoclave a 121 ° C e 15 psi.
3. Posto il substrato PDMS in una piastra ben 24.
4. Rivestire l'intero substrato PDMS con soluzione al 4% (p/v) pluronic F-127 durante la notte per evitare il collegamento delle cellule sulla superficie di pozzetti. Durante il processo di rivestimento, rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate nei pozzetti concavi pipettando o utilizzando un pulitore ad ultrasuoni.
5. Lavare tre volte la soluzione di F-127 mediante tampone fosfato salino (PBS).
6. Semi di 1 mL di soluzione di cella-medio (Medium di Eagle per volta di Dulbecco) (che contiene 2 x 10⁶ cellule) sul substrato PDMS. Si noti che la densità di semina può essere cambiata secondo la dimensione della sferoide di destinazione e/o tipo di cella di destinazione. Qui, le cellule staminali adiposo-derivate (ASC) sono state usate.
7. Aspirare il 1 mL di terreno utilizzando una pipetta di 1000 µ l per rimuovere tutte le cellule in eccesso che non sono rimasti intrappolate nei pozzetti (Figura 3).
8. Incubare le cellule a 36,5 ° C, umidità di > 95% e 5% CO₂ condizione. In caso di ASC utilizzata nel nostro studio, le cellule aggregate per uno sferoide in 48h.

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Risultati

Uno stampo convesso e microtiter modello erano stati fabbricati con successo seguendo la procedura descritta 2.1 a 3.7. (Figura 4). Le perle d'acciaio commerciali sono rimasti intrappolate nella matrice del attraverso-foro di 30x30. Le perle erano tenute strettamente senza lacune tra le perline e i corrispondenti fori di passaggio (Figura 4a). La forma del fabbricato microtiter concavo è concavo emisferica, con un diametro di 60...

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Discussione

La sfida principale di questo metodo di fabbricazione era il fissaggio sicuro dei branelli della matrice del attraverso-foro nella piastra di alluminio. Per risolvere questa sfida, forza magnetica sotto forma di una matrice di 30x30 magnete è stato utilizzato per fissare le perline saldamente, come mostrato nelle figure 6 e 7. La densità di flusso magnetico della matrice di magnete, che ha la polarità opposta, è più forte al centro di ogni superficie del magnete. Poiché l'intensit?...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CNC rotary engraver	Roland DGA	EGX-350
Micro drill bit	HAM Präzision	30-1301 TA	Φ 0.55 and 0.75 mm
Sulfuric acid 98%	Daejung	7683-4100	For cleaning aluminum plate. Dilute with distilled water with 15% solution
Neodymium magnet	Supermagnete	W-01-N	1 x 1 x 1 mm
Bearing ball	Agami Modeling	SUJ2	Φ 600 μm steel bead
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dowcorning	Sylgard 184
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	p2443	Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS)	ATCC	30-2200
Fetal bovine serum	ATCC	30-2020
Adipose-derived mesenchymal stem cells	ATCC	ATCC PCS-500-011