Istituzione di un Bioreposito di base clinico

Riepilogo

I tumori cutanei vengono spesso scartati dopo la chirurgia microscopica di Mohs. Qui viene descritto un protocollo che consente al personale di supporto clinico di elaborare e memorizzare in modo efficace campioni tumorali cutanei ( ad esempio, carcinoma delle cellule squamose, carcinoma delle cellule basali e melanoma) per applicazioni di laboratorio a valle senza interferire con le operazioni cliniche.

Abstract

L'incidenza del cancro della pelle ( es., Carcinoma delle cellule squamose , carcinoma delle cellule basali e melanoma) è in aumento negli ultimi anni. Si prevede che ci sarà una domanda parallela per campioni tumorali cutanei per studi di ricerca biomedica. La disponibilità dei tessuti, tuttavia, è limitata a causa del costo della creazione di un bioreposito e della mancanza di protocolli disponibili per ottenere campioni clinici che non interferiscono con le operazioni cliniche. È stato stabilito un protocollo per raccogliere e elaborare campioni tumorali cutanei e associati di sangue e saliva che hanno un impatto minimo sulle procedure cliniche di routine alla data di una chirurgia Mohs. I campioni tumorali vengono raccolti e trattati da pazienti sottoposti al primo strato di chirurgia Mohs per tumori maligni cutanei provenienti da biopsia da parte del histotechnologista Mohs. Il tessuto normale adiacente viene raccolto all'atto della chiusura chirurgica. Ulteriori campioni che possono essere raccolti sono sangue intero e tampone buccale. Utilizzando campioni di tessuti normalmente scartati, è stato generato un bioreposito che offre diversi vantaggi fondamentali basandosi sulla clinica rispetto all'ambiente di laboratorio. Questi includono una vasta gamma di campioni raccolti; L'accesso ai dischi identificati, inclusi i rapporti patologici; E, per il tipico donatore, l'accesso a campioni aggiuntivi durante le visite di follow-up.

Introduzione

La ricerca sul cancro e sul biomarker si basa su una fornitura di campioni di tessuti umani di qualità e l'offerta limitata ha ostacolato la ricerca ^{1 , 2} . Molti studi dermatologici sono limitati dall'inadeguata offerta, qualità variabile e costi associati all'uso del tessuto umano. Il costo della creazione di una grande banca bio-dedicata è stato stimato di circa due milioni di dollari3 e questi costi collocano l'uso del tessuto umano fuori dalla portata di molti ricercatori. Inoltre, il processo di generazione e conservazione di campioni di ricerca pone il rischio di influenzare le operazioni cliniche e di ritardare la cura del paziente se non eseguita con attenzione. È stato stabilito un bioreposito a basso costo basato su una clinica che si concentra sui campioni di cancro della pelle seguendo le migliori pratiche raccomandate e la convalida dei campioni ^{4 , 5 , 6} .

7 ^{, 8} .

L'obiettivo della tecnica di chirurgia microscopica di Mohs è assicurare che tutti i tessuti del cancro siano rimossi mantenendo il più possibile il tessuto sano possibile. La procedura prevede la progressiva rimozione di strati sottili di tessuto tumorale. Ogni livello successivo è il suoEsaminato tologicamente (dopo la criocuzione del tessuto tumorale e la colorazione H & E) da un dermatologo per determinare se è stato rimosso tutto il tessuto tumorale. L'esclusione e l'esame di strati successivi di tessuti vengono eseguiti mentre il paziente rimane nell'ufficio. Questa tecnica è considerata la migliore opzione di trattamento per SCC ⁹ . A questo punto, la ferita è chiusa e, per migliorare la guarigione e l'aspetto estetico, il tessuto normale adiacente (ANT) viene spesso eliminato. Così, questa procedura chirurgica per rimuovere un tumore è ideale per raccogliere tessuto istologicamente caratterizzato per studi futuri.

La procedura di aggiudicazione dell'appalto per ottenere il tessuto tumorale, i tessuti normali adiacenti, la saliva e i campioni di sangue è stata progettata per avere un impatto minimo sui compiti normali del personale ( Figura 1 ). Gli assistenti medici eseguono il sangue durante la preparazione del paziente per la procedura. Dopo la conclusione della procedura Mohs, la M Lo histotechnologo di OHS prepara ulteriori diapositive istologiche del campione e trasferisce il tessuto al bioreposito. I costi associati alla creazione del bioreposito includono l'acquisto di congelatori di crioconservazione, la creazione di un modesto spazio di laboratorio clinico e lo sviluppo di un programma di monitoraggio delle scorte.

Figura 1: sequenza di raccolta dei campioni e personale responsabile. All'atto del check-in del paziente e del raggiungimento del consenso del paziente, l'assistente medico raccoglie un tampone bucale e svolge un prelievo di sangue. Il dermatologo e l'assistente medico poi accise il tumore e chiude la ferita, durante il quale vengono raccolti rispettivamente gli esemplari SCC e ANT. Un tecnico specializzato di laboratorio elabora il sangue e le sezioni dei campioni SCC e ANT per la coltura, la conservazione e l'ingresso nel bioreposito.Ftp_upload / 55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La diversità dei campioni raccolti consente una varietà di approcci sperimentali ( Figura 2 ). I campioni raccolti dal paziente sono tamponi bucali (saliva può anche essere raccolta se necessario), sangue intero e tessuto esclasti. I tamponi bucali e un campione di tutto il sangue vengono salvati, senza elaborazione, per la genotipizzazione e il matching dei tessuti. Il sangue intero è separato in cellule del sangue bianco (WBC) e frazioni plasmatiche per analisi future. Dopo la trasformazione di Mohs, il tumore congelato viene posto direttamente in azoto liquido e trasferito a un congelatore -80 ° C. I campioni tumorali freschi, vitali e ANT vengono coltivati ​​utilizzando modifiche delle tecniche precedenti ^{10 , 11} e poi criopreservate. Durante la raccolta, il numero di ciascun tipo di esempio viene registrato su un foglio di calcolo prima di entrare Il programma di monitoraggio dell'inventario per facilitare l'elaborazione accurata ( tabella 1 ).

Figura 2: Struttura della raccolta e dell'elaborazione dei campioni biorepositivi basati su clinica. Un tampone e un campione di sangue buccale vengono raccolti dal paziente e memorizzati per il genotipizzazione a valle e la corrispondenza dei tessuti. Il sangue intero viene ulteriormente elaborato per l'isolamento delle cellule del sangue bianco (WBC) e l'analisi CTC, nonché per la raccolta del plasma e l'analisi biopsia liquida. Il tessuto prelevato durante la procedura Mohs è trattato istologicamente per scopi diagnostici, dopo di che le diapositive istologiche possono essere utilizzate sperimentalmente per ulteriori analisi immunohistochemiche. A condizione che il campione di tessuto ecceduto sia abbastanza grande, una porzione di tessuto fresco viene rimossa e tagliata per isolamento proteico e RNA e per la creazione di linee cellulari colte.55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Data di raccolta:
	Paziente 1	Paziente 2	Paziente 3	Paziente 4	Paziente 5
Iniziali e data di nascita
Colore degli occhi
Tipo di esempio
Posizione campione
Saliva
WBuco sangue
Plasma
Tumore Viable
Tessuto Normale Resistente
Tumore Mohs Liquido Azoto
Tessuto normale azoto liquido
Slides

Tabella 1: Lista di controllo per registrare le collezioni di campioni. I dati tracciati e registrati con ciascun campione raccolto comprendono le iniziali del paziente, la data di nascita e il colore degli occhi (per la tipizzazione della pelle), nonché i locatiSulla rimozione del campione. Il numero di campioni salivari, i volumi di raccolta del sangue e il numero di esemplari di tessuti vitali e conservati sono registrati anche come riferimenti per le allocazioni agli usi successivi. Clicca qui per scaricare questo file.

Per convalidare le procedure di raccolta dei campioni, ciascun tipo di esempio è stato testato nelle applicazioni a valle. Utilizzando modifiche delle tecniche precedenti ¹² , il tumore e ANT sono stati utilizzati con successo nell'isolamento di proteine ​​e RNA e possono essere utilizzati potenzialmente per l'isolamento del DNA. Le esplosioni vitali stabilite dalle sezioni del tessuto sono state valutate mediante microscopia, mentre le diapositive istologiche memorizzate sono state utilizzate per immunohistochemistry e immunofluorescenza.

Seguendo il protocollo qui descritto, è possibile estendere questo modello ad altre cliniche di dermatologia, altri tipi di tumore (come il melanoma), E altre specialità e pratiche chirurgiche per fornire campioni di tessuti umani per una ricerca multidimensionale nei tumori umani. Le modifiche leggere di questo protocollo sono probabilmente necessarie per altre pratiche, ma in linea di principio questo protocollo è applicabile a qualsiasi pratica chirurgica che scarta frequentemente i campioni dei pazienti raccolti durante il trattamento del paziente.

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Protocollo

Tutta la sperimentazione sui campioni di tessuto umano è stata approvata da Western IRB (Protocollo WIRB # 20142461). Il singolo criterio per la raccolta dei tessuti per queste procedure è una diagnosi bioscopica di SCC. Nessun criterio di esclusione è stato descritto nel protocollo originale IRB, ma non sono stati utilizzati campioni di pazienti con una nota patologia trasmessa dal sangue. Il consenso informato è stato ottenuto prima della raccolta del tessuto cutaneo, del sangue e della saliva. La commissione di revisione istituzionale del Midwest ha approvato il lavoro di convalida con campioni biorepositivi basati su cliniche presso la Midwestern University (AZ # 807).

1. Trattamento cutaneo del tessuto tumorale

NOTA: Questo deve essere eseguito da un histotechnologist di Mohs.

1. Elaborazione del tessuto carcinoma squamoso fresco (SCC) per RNA e cultura esplosiva
   1. Dopo che il tessuto è stato tagliato dal chirurgo Mohs, raccogliere da 10 a 50 mg (≥10 mm ³ ) Dal centro del lato apicale del tessuto durante il rilassamento (che è il processo di manipolazione del tessuto per consentirlo di rimanere piatto sulla diapositiva) prima di elaborare ulteriormente.
      NOTA: Questo è possibile solo se il tumore è abbastanza grande per consentire la rimozione di un campione di 10-50 mg (≥10 mm ² ) prima della valutazione istologica che fa parte della procedura Mohs. Se il tumore non è abbastanza grande per consentire la rimozione di un minimo di 2 mm ³ , non procedere con l'elaborazione per l'RNA (saltare la fase 5).
   2. Trasferire il tessuto vitale a un tubo da 1,5 ml contenente un mezzo di coltura (miscela 1: 1 di DMEM: Ham's F-12, 25 mM HEPES, 100 UI / ml di penicillina e 100 μg / mL streptomicina) utilizzando le pinzette e assicurare che il Il tessuto è completamente immerso nel mezzo. Conservare questo tubo a 4 ° C prima di procedere con ulteriore lavorazione.
   3. Utilizzare il tessuto per l'analisi dell'isolamento e dell'espressione di RNA (vedere la fase 5) e / o lo stabilimentoDi una cultura esplante (vedere la fase 6) entro 24 h.
   4. Posizionare il resto del campione tumorale che è stato rimosso dal paziente (punto 1.1.1) su un supporto di tessuto criostato (o "mandrino"). Incorporare il tessuto in un composto ottimale di taglio (OCT), congelando il tessuto all'interno del supporto, per consentire il completamento dell'istologia Mohs e per la preparazione di diapositive istologiche aggiuntive per l'analisi sperimentale.
2. Preparazione di diapositive istologiche
   1. Tagliare sezioni di tessuto 7 μm utilizzando un criostato e creare due (o più) diapositive per ogni campione tumorale. Assicurarsi che ciascuna diapositiva contiene fino a tre sezioni del tumore completo.
      NOTA: Una delle due diapositive sarà macchiata usando H & E dal histotechnologist di Mohs e le slide aggiuntive possono essere elaborate con l'analisi IF, IHC o FISH.
   2. Mettere le diapositive in acetone per 1-2 secondi per fissare il tessuto. Impostare queste diapositive a parte per asciugare. Non H & EMacchia o copertura del vetrino da utilizzare per la futura immunofluorescenza (IF), l'immunohistochemistry (IHC) o l'analisi di ibridazione in fluorescenza in situ (FISH), a seconda del protocollo sperimentale.
3. Elaborazione del Tessuto Post-Mohs
   1. Una volta completata l'elaborazione di Mohs (passaggi 1.1-1.2), lavorare nella camera di criosta e prelevare il campione dal supporto di crioconservazione e collocare il tessuto in un tubo criogenico etichettato.
   2. Mettere la fiala etichettata in azoto liquido prima che il tessuto abbia scongelato. Se i campioni devono essere utilizzati per l'analisi di proteine ​​e / o DNA, possono essere trasferiti in un azoto liquido oa un congelatore -80 ° C in pochi minuti per essere conservati per un'espressione di proteine ​​future e l'analisi del mutamento del DNA (vedere i passaggi 4-5) .
      NOTA: Se si desidera un intatto RNA dal campione post-Mohs, è fondamentale mantenere il campione congelato durante la rimozione dal mezzo di incorporazione dei criomocchi. Se la cura estrema non viene esercitataQuesto passo, il campione post-Mohs dovrebbe essere riservato per analisi proteica e / o DNA.
4. Lavorazione di ANT fresco
   1. Al momento della chiusura Mohs, ottenere ANT dal chirurgo Mohs.
   2. Rimuovere una quantità uguale o maggiore di ANT come raccolta dal campione SCC (vedi sopra) dal lato apicale del tessuto normale e trasferirla in un tubo da 1,5 mL etichettato contenente un mezzo di coltura (miscela 1: 1 di DMEM: Ham's F- 12 integrati con 25 mM HEPES, 100 UI / mL di penicillina e 100 μg / mL streptomicina) utilizzando pinzette.
   3. Immergere completamente il tessuto nel medesimo mezzo di coltura e conservare a 4 ° C fino alla successiva lavorazione (vedere punti 4-6).

2. Sangue, saliva e processo di tampone buccale

1. Ottieni circa 10 ml di sangue nei tubi di raccolta EDTA tramite venipunzione.
2. Trasferire il sangue dai tubi di raccolta a un tubo sterile da centrifuga da 15 o 50 ml. Rimuovere circa 200 μl in un tubo criogenico da 1,5 ml, evitando le bolle; Conservare questo campione di sangue intero a -80 ° C, per essere utilizzato per future genotipizzazione e corrispondenza tissutale, se necessario.
   1. Spin il sangue rimanente a 1.000 xg per 30 minuti e seguire le procedure standard per raccogliere la frazione plasmatica.
   2. Aliquota il plasma in incrementi di 1 ml in tubi criogenici da 1,5 ml e conservare a -80 ° C per l'uso durante le future analisi bioptiche liquide.
3. Utilizzare un tampone sterile per ottenere un campione di tampone buccale e memorizzare il tampone in un tubo sterile a temperatura ambiente.
4. Se necessario, ottenere un campione di saliva e conservare in un tubo sterile a temperatura ambiente.
   NOTA: Questi campioni possono essere usati per future genotipizzazioni e corrispondenza dei tessuti, se necessario.

3. Registrazione di campioni

1. Trasferire informazioni dalla lista di controllo dei campioni dei pazienti al database biorepositivo. Includi informazioni sui pazienti e diagNosi dal grafico del paziente.
2. Stampare le etichette con un codice a barre per ciascun campione e registrare ciascuno nel database per collegare ogni campione raccolto con i dati del paziente.
3. Registrare la distribuzione dei campioni de-identificati nel database biorepositivo prima di trasferire i campioni al laboratorio di ricerca.

4. Isolamento della proteina e analisi del blot occidentale

1. Posizionare ogni campione di tessuto (SCC e / o ANT) in un flaconcino contenente 500 μl di tampone di lisi cellulare contenente inibitori della proteasi per 100 mg di tessuto per lezzare il tessuto.
   NOTA: Abbiamo utilizzato un tampone per la radioimmunoprecipitazione (RIPA), composto da 50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% sodio deossolfato, 1,0% NP-40 e 0,1% SDS. Possono essere utilizzati altri tamponi di lisi cellulare.
2. Homogenizzare i tessuti utilizzando un omogeneizzatore tissutale per 5 minuti in intervalli di 20 a 4 ° C. Spin i campioni a 21.000 xg e 4 ° C per 20 minuti e raccogliere il supernatante contenente la proteina in un tu frescoessere. Riaccendere il surnatante utilizzando le stesse condizioni e raccogliere il supernatante finale in un tubo fresco.
3. Elettroforesi 30-50 μg di proteine ​​da ciascun campione utilizzando un gel gradiente SDS-poliacrilammide 4-20%. Macellare il gel con Coomassie Blue per visualizzare le bande di proteine, se lo si desidera.
4. Se è necessaria un'analisi Western blot di proteine ​​espresse, trasferire le proteine ​​dal gel in una membrana di PVVF (PVVF) polivinilidene secondo protocolli standard. Dopo il trasferimento, Ponceau macchia la membrana PVDF per visualizzare bande di proteine, se lo si desidera.
5. Bloccare la membrana e la sonda PVDF per rilevare le proteine ​​di interesse seguendo protocolli standard. Usa gli anticorpi primari specifici per le proteine ​​interessate, insieme agli anticorpi secondari corrispondenti specifici per gli anticorpi primari, a concentrazioni raccomandate dal produttore per l'analisi di blot western.
6. Esporre la membrana esplorata usando un substrato chemiluminescente e rappresentare la membrana utilizzando un'immagineNg sistema.

5. Isolamento di RNA e reazione a catena quantitativa di polimerasi (qPCR)

1. Immediatamente inserire campioni di tessuti freschi (SCC e / o ANT) in un tubo da 1,5 mL contenente una soluzione di stabilizzazione dell'RNA e inserire campioni di tessuto post-Mohs in un tubo da 1,5 ml contenente una soluzione di transizione tissutale congelata, seguendo le raccomandazioni del produttore. Assicurarsi che il tessuto sia completamente immerso. Conservare questi campioni a -80 ° C fino all'uso.
2. Rimuovere i campioni RNA da -80 ° C e scongelare sul ghiaccio. Trasferire il tessuto a un nuovo tubo da 1,5 mL contenente 1 mL di tampone di estrazione RNA (fenolo / guanidino tiocianato) per 50-100 mg di tessuto.
3. Lyse i tessuti utilizzando un omogeneizzatore tissutale. Eseguire sei cicli di omogeneizzazione, seguiti da un periodo di raffreddamento del campione; Ogni ciclo è costituito da 20 s di omogeneizzazione a 4 ° C e un periodo di raffreddamento a 40 s. Dopo l'omogeneizzazione, incubare il campione per 5 minuti a temperatura ambiente.
4. Aggiungere 0,2Ml di cloroformio per 1 ml di tampone di estrazione RNA e agitare vigorosamente il tubo a mano per 15 s. Incubare per 2-3 minuti a temperatura ambiente.
5. Spin i campioni a 12.000 xg e 4 ° C per 15 minuti. Rimuovere la fase acquosa del campione e collocarla in un nuovo tubo da 1,5 ml.
6. Aggiungere 0,5 mL di isopropanolo al 100% per 1 mL del tampone di estrazione RNA utilizzato nella fase 5.2 alla fase acquosa e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Se si prevede che i rendimenti RNA siano bassi ( cioè il volume del tessuto iniziale è inferiore a 10 mg), i campioni possono essere precipitati per una notte a -80 ° C. Inoltre, 5 μg di glicogeno privo di RNasi per 500 μL di tampone di estrazione RNA può essere aggiunto durante la fase di precipitazione isopropanolo per migliorare i rendimenti di RNA.
7. Spin il campione a 12.000 xg a 4 ° C per 10 min. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet con 1 ml di etanolo al 75%.
8. Vorticala brevemente il campione e poi giri a 7.500 xg e 4 °C per 5 min. Scartare il lavaggio e asciugare il pellet per 5-10 min.
9. Resuspendere il pellet RNA in 20 μl di acqua priva di RNasi.
   1. Se si desidera, purificare ogni campione di RNA utilizzando un kit di pulizia RNA in base alle raccomandazioni del produttore.
      NOTA: I piccoli RNA verranno persi dal campione se viene eseguito questo passaggio.
10. Elettroforesi un campione da 1 μg usando un gel agarosio di formaldeide-MOPS 1,2% per analizzare la qualità dell'RNA.
    NOTA: in alternativa, analizzare i campioni utilizzando un bioanalizzatore per ottenere un numero RIN ¹³ .
11. Reverse-trascrono l'RNA a cDNA utilizzando un protocollo di trascrizione inversa per l'analisi qPCR di mRNA target (o miRNA) di interesse.

6. Culture intellettuali

1. Sterilizzare il tessuto esclizzato prima della cultura immergendo il tessuto in etanolo del 70%.
2. Posizionare il tessuto su uno scivolo o piatto e aggiungere abbastanza mezzo di coltura (miscela 1: 1 di DMEM: Ham & #39; s F-12 integrato con 10% FBS, 25 mM HEPES, 100 UI / mL di penicillina e 100 μg / mL streptomicina) per coprire il tessuto (per evitare che il tessuto venisse seccato). Tagliare con cautela il tessuto in frammenti (<1 mm ³ ) usando una lama del bisturi.
3. Trasferire i frammenti di tessuto a un piatto da 35 mm di coltura tissutale e aggiungere circa 20 μL di siero fetale fetale (FBS) sopra ogni frammento.
4. Lasciare il piatto aperto in una cappa di cultura per 20-30 minuti, o fino a quasi asciutto.
5. Aggiungere a ciascun piatto 1 ml di campione di coltura (1: 1 di DMEM: Ham's F-12 con 10% FBS, 25 mM HEPES, 100 UI / mL di penicillina e 100 μg / mL streptomicina) e incubare a 37 ° C in 5% CO ₂ . Se necessario, subcultura o sub-clona le culture.

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Risultati

Tumore e ANT sono stati utilizzati con successo in isolamento proteico e testati da blotting occidentale. Come mostrato nella figura 3 , i marker di carcinoma cutanee squamose cutanee (Muc1 ¹⁴ , FHL-1 ¹⁵ e p40 ^16,17 ) possono essere rilevati nei campioni dei pazienti raccolti e conservati nel nostro bioreposito in base alla clinica.

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Discussione

Alla conoscenza dell'autore, questo protocollo è il primo del suo genere che si concentra sull'approvazione clinica di campioni di tessuto cutaneo in un approccio economico e veloce. I pazienti sottoposti a microchirurgia di Mohs sono in genere pianificati durante specifici blocchi di tempo e la raccolta è limitata a questi periodi. La raccolta di campioni comporta l'impegno dell'assistente medico coinvolto nella cura del paziente, del histotechnolog Mohs che elabora i campioni tumorali e un membro del...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K3EDTA	ThermoFisher Scientific	02-685-2B
Electron Microscopy Sciences Double Edge Blades	ThermoFisher Scientific	50-949-411
Curved Medium Point General Purpose Forceps	ThermoFisher Scientific	16-100-110
Premium Microcentrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	05-408-138
Lonza Walkersville KGM Keratinocyte Medium	ThermoFisher Scientific	NC9791321
Electron Microscopy Sciences Tissue TEK OCT Compound	ThermoFisher Scientific	50-363-579
Leica CM1950 Cryostat	Leica Biosystems	14047743909
Frosted Microscope Slides	ThermoFisher Scientific	12-550-343
Shandon Rapid-Chrome H&E Frozen Section Staining Kit	ThermoFisher Scientific	99-900-01
Nalgene Long-Term Storage Cryogenic Tubes	ThermoFisher Scientific	03-337-7X
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
Boca Scientific BuccalT-Swab	ThermoFisher Scientific	NC9679349
Cell Signaling Technology 10x RIPA Buffer	ThermoFisher Scientific	50-195-822
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail	ThermoFisher Scientific	PI78443
Eppendorf 5424R Microcentrifuge	ThermoFisher Scientific	05-401-203
Pellet Morter Cordless Homogenizer	ThermoFisher Scientific	12-141-3
RNAse Free Pellet Pestle	ThermoFisher Scientific	121-141-364
Forma SteriCycle CO2 Incubator	ThermoFisher Scientific	13-998-089
HyClone Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	SH30071.02
Gibco Advanced DMEM/F-12	ThermoFisher Scientific	12-634-028
Gibco Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140148
Gibco 1 M Hepes	ThermoFisher Scientific	15-630-130
Nunc Cell Culture 35 mm with Vent	ThermoFisher Scientific	1256591
Anti-CFH monoclonal antibody clone OX-24	Abnova	MAB12583
Anti-p40 (p63 delta) antibody	Abnova	ABX-144A
Anti MUC-1 antibody	Santa Cruz Biotech	sc-7313
Anti-Snail + Slug (phospho S246)	Abcam	Ab63568
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
Alexa Fluor 568 Phallodin	Molecular Probes	A12380
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Molecular Probes	P36941
Zeiss Axio Imager Z1 Microscope with Axiocam camera	Zeiss	4300009901
Olympus IX51 phase contrast with DP72 camera	Olympus	IX511F3