Phenotypic Analisi del roditore Malaria Parassita Sessuale e Sessuale Fasi Sangue e Mosquito Fasi

Riepilogo

A causa delle sorprendenti somiglianze del ciclo di vita e della biologia dei parassiti della malaria dei roditori con i parassiti della malaria umana, i modelli di malaria dei roditori sono diventati indispensabili per la ricerca sulla malaria. Qui, abbiamo standardizzato alcune delle tecniche più importanti utilizzate nell'analisi fenotipica di specie di malaria roditore selvatico e transgenico.

Abstract

I recenti progressi nella genetica e nelle tecnologie di biologia dei sistemi hanno promosso la nostra comprensione della biologia dei parassiti della malaria a livello molecolare. Tuttavia, gli obiettivi efficaci del parassita della malaria per lo sviluppo di vaccini e chemioterapia sono ancora limitati. Ciò è in gran parte dovuto all'indisponibilità di modelli di infezione in vivo rilevanti e pratici per le specie di Plasmodium umano, in particolare per P. falciparum e P. vivax. Pertanto, le specie di malaria del roditore sono state ampiamente utilizzate come modelli pratici alternativi in vivo per il vaccino antimalarico, il targeting dei farmaci, la risposta immunitaria e gli studi di caratterizzazione funzionale dei geni Plasmodiumspp conservati. In effetti, i modelli di malaria dei roditori si sono dimostrati preziosi, soprattutto per esplorare la trasmissione delle zanzare e la biologia dello stadio del fegato, e sono stati indispensabili per gli studi immunologici. Tuttavia, ci sono discrepanze nei metodi utilizzati per valutare i fenotipi dei parassiti asessuali e sessuali transessuali e sessuali di tipo selvaggio. Esempi di queste discrepanze sono la scelta di un'infezione endovenosa o intraperitoneale di roditori con parassiti in fase sanguigna e la valutazione dell'esclamazione di gamete maschile. Qui, sindiciamo i metodi sperimentali standardizzati per valutare i fenotipi delle stadi del sangue asessuato e sessuale nei parassiti transgenici che esprimono specie di parassiti della malaria reporter-gene o di tipo selvatico. Inoltre, vengono descritti in dettaglio i metodi per valutare i fenotipi degli stadi della zanzara parassita della malaria (gamete, ookineti, oocisti e sporozoiti) all'interno dei vettori di zanzare di Anopheles. Questi metodi sono dettagliati e semplificati qui per i ceppi letali e non letali di P. berghei e P. yoelii, ma possono anche essere applicati con alcune modifiche alle specie di malaria del roditore P. chabaudi e P. vinckei.

Introduzione

I parassiti della malaria causano centinaia di milioni di infezioni da malaria nell'uomo in tutto il mondo, con più di 600.000 decessi ogni anno¹. Le infezioni umane sono causate da cinque specie parassitarie della malaria, vale a dire P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariaee P. knowlesi. La maggior parte delle decessi cliniche per la malaria sono causate da P. falciparum nell'Africa sub-sahariana¹. Un'altra specie di parassita della malaria umana che causa ampie morbilità in tutto il mondo al di fuori dell'Africa subsahariana è P. vivax². Le altre tre specie sono tutte più geograficamente limitate e causano infezioni benigne della malaria, ad eccezione del letale P. knowlesi³. L'indisponibilità di modelli in vivo rilevanti e pratici non umani delle infezioni è sempre stata ed è ancora un ostacolo al vaccino antimalarico e allo sviluppo di farmaci. Precedente al targeting del farmaco antimalarico e studi metabolici hanno fatto ampio affidamento su modelli di malaria aviaria come P. gallinaceum e P. lophurae, infettando polli e anatre, rispettivamente⁴. Successivamente, le specie di malaria dei roditori sono state gradualmente introdotte in vari vaccini e studi di targeting farmacologico come modelli in vivo. Nel corso degli anni, si sono accumulate prove di somiglianze della biologia e delle interazioni ospite-parassita delle fasi del ciclo di vita dei modelli di malaria dei roditori con le specie della malaria umana.

In particolare, i modelli di malaria dei roditori erano estremamente importanti per esplorare e caratterizzare la biologia delle zanzare e degli stadi pre-errocitici⁵. Tuttavia, ci sono quattro specie di malaria roditore (P. berghei, P. yoelii, P. chabaudi, e P. vinckei) che hanno diverse caratteristiche biologiche, il più notevole dei quali sono negli stadi del sangue⁶. Le specie di malaria del roditore differiscono nella sincronia delle stadi ematici, dove le stadi ematiche dei ceppi P. chabaudi e P. vinckei sono per lo più sincrone, mentre le fasi del sangue di P. berghei e P. yoelii non sono^{6 , 7}. Un'altra differenza notevole è l'auto-eliminazionedelle stadi del sangue che si verifica in alcuni ceppi (ad esempio, P. yoelii 17X-NL, P. berghei NK65 e P. vinckei lentum),mentre l'infezione del sangue di altri ceppi della stessa specie potrebbero essere letali se non trattati (P. yoelii 17X-L, P. berghei ANKA, e P. chabaudi AS). Inoltre, p. yoelii 17X-NL ceppo e P. berghei ANKA ceppo preferibilmente invadere i reticulocyti^8,9,10,11, anche se queste caratteristiche di P. I ceppi di yoelii e P. berghei non sono un rigoroso requisito di crescita^12,13,14. Pertanto, i topi vengono trattati con feniliddrzina prima di un'infezione con gli stadi del sangue di tali parassiti per aumentare la parasitemia e la gametocitemia necessari per un'infezione da zanzara per il ceppo P. berghei ANKA e per P. yoelii 17X-NL^{15,16,17,18,19}.

Differenze nello sviluppo delle stadi di zanzara esistono anche tra le diverse specie di malaria roditore, la più notevole è la temperatura e il tempo necessari per lo sviluppo ottimale delle stadi di zanzara e la lunghezza sporozoite^{5,6, 20}. Negli stadi pre-erritrociti delle specie di malaria roditore, le differenze includono le specie di roditori e i ceppi più suscettibili all'inoculazione infettiva della sporozoite, il numero di sporozoiti necessari per l'inoculazione in un ceppo di roditori suscettibili, tipi di cellule mammiferi necessari per i saggi di sviluppo in fase epatica in vitro, e il tempo per completare lo sviluppo dello stadio epatico^{5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30}.

Nonostante queste variabilità, i parassiti della malaria dei roditori erano i modelli favorevoli fin dall'inizio per l'applicazione di approcci genetici inversi, perché erano meno dispendiosi di tempo e risorse con un'alta probabilità di successo³¹. Infatti, i modelli di malaria dei roditori sono stati i modelli migliori, e in molti casi gli unici modelli, disponibili per numerosi anni per caratterizzare funzionalmente i geni espressi negli stadi di zanzare e fegato.

Alla luce della popolarità e dell'amenabilità degli approcci genetici inversi nei modelli di malaria dei roditori, sono state utilizzate diverse metodologie per analizzare i fenotipi delle fasi del ciclo di vita dei parassiti transgenici, in particolare le fasi del sangue. Tuttavia, alcune di queste metodologie sono incoerenti; per esempio, confrontando le infezioni di parassiti in fase sanguigna dopo un'iniezione di IP (che sono probabilmente drenati ai linfonodi peritoneali e, da lì, possono entrare nel flusso sanguigno; quindi, i parassiti iniettati non finiscono ugualmente nel flusso sanguigno) , confrontando la trasmissione di zanzare di cloni con un diverso numero di trasferimenti seriali di stadi di sangue o numero G (che potrebbe influenzare la gametocitogenesi^32,33),o confrontando i parassiti transgenici direttamente con il tipo selvaggio ingenuo (WT) parassiti che non sono mai stati sottoposti a elettroporazione e selezione di farmaci positivi e alle varie valutazioni non standardizzate dell'esclamazione dei gameti maschili. Pertanto, è fondamentale standardizzare protocolli che sono semplici da seguire per l'analisi fenotipica di qualsiasi tipo di parassiti transgenici o WT roditori della malaria nel sangue e nella zanzara per adattarsi alle variabilità biologiche della malaria roditore specie parassiche.

Qui, riportiamo su un protocollo sperimentale standardizzato e dettagliato per l'analisi fenotipica delle fasi del ciclo di vita del sangue e delle zanzare dei parassiti transgenici o selvatici P. yoelii e P. berghei . Questi protocolli sono applicabili anche ai parassiti P. chabaudi e P. vinckei.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali qui descritti sono stati condotti secondo i protocolli approvati dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Tulane University e del comitato etico degli animali dell'Università Bezmialem Vakif. Tutti gli altri protocolli sperimentali e l'uso del DNA ricombinante sono stati condotti secondo i protocolli approvati del Comitato di Biosicurezza Istituzionale (IBC) dell'Università di Tulane.

1. Infezione dei topi con parassiti in fase sanguigna per l'analisi della parassita e i saggi di infezione da zanzara

1. Giorno -3: iniezione facoltativa di feniliddra nei topi ricognitori
   1. Iniettare i topi con uscita SW o CD1 (topi che saranno utilizzati per l'infezione da zanzare e assaggi di infezione da zanzare) intraperitonealmente (IP) con 100 l di feniliddrazina (50 mg di fenilididdra in 5 mL di 1x salina con buffer fosfato (PBS)) utilizzando un ago da 26 G) utilizzando un ago da 26 G siringa.
      NOT: Per le infezioni robuste delle zanzare di P. berghei e P. yoelii, la feniliddrasi viene utilizzata per indurre la reticulocitosi nei topi riceventi, che aumenta la parasitemia e, successivamente, la percentuale di gametociti, e significativamente aumenta l'esflagrazione dei gameti maschili (Figura 5), che porterà ad una migliore infezione delle fasi di zanzara per entrambi i ceppi P. berghei e P. yoelii ^{15,16,17, 18}.
2. Giorno -2: iniezione di scorte di parassiti congelati nei topi donatori
   1. Scongelare rapidamente gli stock congelati crioconservati e iniettare immediatamente ogni topo donatore (tipicamente due topi per genotipo) IP con 200 dollari di magazzino utilizzando una siringa aghi da 26 G.
      NOT: Non più di cinque topi sono alloggiati per gabbia all'interno di impostazioni di vivaio controllato.
   2. Iniziare a controllare la parasitemia al microscopio 100x sullo striscio di sangue sottile macchiato di Giemsa dopo 24 h post-infezione. Seguire la sezione 2.1 del protocollo per gli strisci di sangue sottile macchiati da Giemsa.
      NOT: A causa dell'incapacità di contare con precisione le fasi di sangue vitali sopravvissute dopo lo scongelamento e l'iniezione di sangue infetto crioconservato, i topi donatori ricevono prima il sangue crioconservato. Gli eritrociti infetti del topo donatore possono essere quantificati con precisione e successivamente utilizzati.
3. Giorno 0: sanguinamento dei topi donatori
   1. Sanguinare i topi donatori (vedi sezione 3.1) quando la loro parasitemia è tra lo 0,1% e l'1%, che di solito si ottiene 2-3 giorni dopo il congelato stock-infezione nel caso di ceppi P. yoelii 17X-NL e P. berghei ANKA.
   2. Utilizzare la puntura della vena facciale (per ottenere tra 200 e 500 anni), o sanguinare terminale gli animali per foratura cardiaca (per ottenere tra 600 e 1,2 mL) di sangue infetto. Sanguinano terminalemente i topi dalla foratura cardiaca come descritto in dettaglio nella sezione 3.1.
      NOT: Il sanguinamento delle vene facciali non è un metodo di routine per ottenere il sangue in quanto è molto più difficile da applicare ed è molto angosciante per i topi, rispetto al sanguinamento terminale. La parasitemia ottimale per il sanguinamento dei topi donatori è compresa tra lo 0,1%-1% perché, a questa fascia di parasitemia, ci sono pochissimi gametociti (che non possono replicarsi per produrre stadi di sangue asessuato) e ci sono eritrociti meno a doppia o tripla infezione (che la quantificazione meno accurata).
4. Giorno 0: quantificazione del sangue infetto per preparare dosi di eritrociti infetti mediante diluizioni seriali
   1. Preparare le diluizioni seriali del sangue del donatore aggiungendo 100 l'l di sangue a un tubo di microcentrifuga (tubo di diluizione 1). Aggiungete 900 l di livello RPMI a tubo 1 e mescolate bene pipettando su e giù con la stessa punta di pipetta, creando una diluizione 1:10.
   2. Prendere 100 L del sangue diluito dal tubo 1 e aggiungerlo a un nuovo tubo di microcentrifuga (tubo di diluizione 2). Aggiungete 900 l di livello RPMI al tubo 2 e mescolate bene pipettando su e giù con la stessa punta di pipetta, creando una diluizione 1:100.
   3. Ripetere i passaggi 1.4.1 e 1.4.2 per effettuare altre due diluizioni seriali, creando 1:1.000 (tubo di diluizione 3) e 1:10.000 diluizioni (tubo di diluizione 4).
   4. Aggiungere 12 l di sangue diluito dal tubo 3 e 12 l di sangue diluito dal tubo 4 ai diversi lati di un emocitometro e determinare il numero medio di eritrociti su ciascun lato dell'emocitometro. Moltiplica questi numeri per 10. Moltiplicare questi numeri per il fattore di diluizione, rispettivamente 1.000 o 10.000 per determinare il numero di eritrociti in 1 l di ciascuna diluizione.
   5. Dividere il numero desiderato di eritrociti infetti da iniemettere per il numero di eritrociti in 1 :L di ciascuna diluizione per determinare il volume di sangue didonificato necessario per l'iniezione. Scegliere la diluizione con il volume più appropriato per l'iniezione, aggiungere il volume a un nuovo tubo di microcentrismo e completarlo a 120 .L con supporto RPMI.
5. Giorno 0: iniezione endovenosa dei topi destinatari
   1. Posizionare i topi ricetti sotto una lampada rossa termica per dilatarne le vene per l'iniezione. Caricare le dosi di parassiti in una siringa di insulina 27 G e posizionare il topo ricevente in un restrainer.
   2. Iniettare 1 milione o 10.000 eritrociti infetti per via endovenosa (IV) utilizzando la siringa insulinica 27 G in ogni topo ricevente per i saggi di infezione da zanzara o per saggi di crescita asessuati e sessuali in fase sanguigna, rispettivamente. Continuare a mantenere i topi in condizioni abitative standard.
      NOT: Un'iniezione ip è un metodo indiretto per introdurre parassiti nel flusso sanguigno, in quanto gli eritrociti parassiti devono passare attraverso i linfonodi drenanti della cavità peritoneale per raggiungere il sangue. Questo rende un'iniezione IP un percorso di consegna indiretta per iniettare un numero preciso di parassiti nel flusso sanguigno. Pertanto, il percorso IV è preferito, in quanto fornisce dosi parassiastre accurate direttamente nel flusso sanguigno, come mostrato nella Figura 3 e descritto nella Figura 3 e descritto nella Risultati rappresentativi.

2. Determinazione del carico di parassiti in fase sanguigna per stadi sessuali e asessuati

NOT: In questa sezione sono elencati i metodi di valutazione fenotipica standardizzati degli stadi del sangue del parassita della malaria. Questi metodi sono utili nella valutazione di nuovi candidati antimalarici o vaccinari o addirittura gene knockout sullo sviluppo di stadi sessuali e asessuati negli stessi topi sperimentali. Da notare, P. chabaudi e P. vinckei sono anche opzioni alternative molto razionali e importanti per questi tipi di saggi, soprattutto nello screening farmacologico.

1. Determinazione della parasitemia degli stadi asessuati e dei gametociti maschili contro quelli femminili da parte di strisci di sangue sottile macchiati di Giemsa per i saggi di crescita dei parassiti
   1. Utilizzando un ago da 26 G o 27 G, pungere la coda del topo e raccogliere la goccia di sangue su un vetrino del microscopio. Utilizzare il bordo corto di un altro vetrino del microscopio per spalmare rapidamente il sangue attraverso il vetrino.
   2. Fissare il vetrino con metanolo al 100% per almeno 1 min, solo dopo che il sangue si è completamente asciugato sul vetrino. Macchia in 10% Giemsa per 10-15 min. Lavare il vetrino con acqua singola o doppia distillata e lasciarlo asciugare.
   3. Leggere la diapositiva con un obiettivo 100x e immersione olio al microscopio leggero. Per una misurazione accurata dei parassiti, controlla almeno un totale di 6.000 eritrociti, che possono essere ottenuti contando almeno 30 o 40 griglie microscopiche con un numero medio di 200 o 150 eritrociti (RBC) per griglia, rispettivamente. Contare il numero totale di RBC nella prima e nell'ultima griglia per determinare il numero medio di globuli rossi per tutte le griglie.
   4. Contare il numero totale di erittri infetti per griglia. I gametociti maschili e femminili possono essere conteggiati separatamente per determinare la gametocytemia, ma dovrebbero anche essere inclusi nel conteggio totale della parassita.
   5. Determinare la percentuale totale di parasitemia dividendo il numero totale di eritrociti parassiti per il numero totale di RBC osservati. Moltiplicare questo numero per 100 per determinare la percentuale di parasitemia.
   6. Determinare la gametocytemia dividendo il numero totale di gametociti contati per il numero totale di RBC osservati. Moltiplica questo numero per 100 per determinare la percentuale di giocotocitemia per mouse.
      NOT: L'unico metodo affidabile di differenziazione tra diversi stadi di sangue asessuato e sessuale è l'uso di un microscopio per valutare gli strisci di sangue sottile macchiati di Giemsa, poiché ciascuno degli stadi ha una morfologia diversa, ad eccezione dei gametociti immaturi, che sono per lo più indistinguibili dalle fasi del sangue asessuato.
2. Determinazione della parassita in fase sanguigna da parte della citometria di flusso per ceppi di parassiti prosorflue che esprimono le proteine WT-like
   1. Etichettare due tubi di microcentrifuga per ogni campione di topo, designando un tubo per una diluizione 1:1,000 e l'altro per una diluizione 1:2,000. Aggiungere 1,5 lofan di 1x di eparina al tubo di diluizione 1:1,000.
   2. Utilizzando un ago da 26 G o 27 G, pungere la coda del topo e trasferire 1,5 l di sangue al tubo contenente 1,5 l of 1x di eparina (il tubo di diluizione 1:1,000). Mescolare delicatamente il sangue e l'eparina 1x pipeting su e giù.
   3. Aggiungere 1.497 L di RPMI medio al tubo di microcentrifuga, e delicatamente pipetta su e giù per mescolare bene.
   4. Trasferire 500 l della miscela dal tubo di diluizione 1:1,000 al tubo di diluizione 1:2,000. Aggiungere 500 l di rPO medio al tubo 1:2,000 e mescolare delicatamente convogliando su e giù.
   5. Seguire il protocollo di avvio appropriato del produttore per il cilindro di flusso. Eseguire i campioni a una velocità di flusso lenta e impostare il rilevamento per almeno 20.000 eventi.
      NOT: C'è un saggio pratico alternativo per misurare la parasitemia tramite lo smistamento FACS tricolore, sia che i parassiti esprimano marcatori fluorescenti o meno³⁴. Tuttavia, il test qui descritto offre una misura accurata della parasitemia nei parassiti vivi senza l'aggiunta di coloranti leganti il DNA e l'uso dello smistamento FACS.
3. Determinazione del tasso di esclamazione dei gameti maschili per microlitro di sangue di topo infetto
   1. Preparare un tubo di microcentrifuga di diluizione 1:10 con 40 -L di mezzo ookinete incompleto (RPMI - bicarbonato di sodio , iposintotina e acido xanthurenico) e 5 L di 1x eparina.
   2. Utilizzando un ago da 26 G o 27 G, pungere la coda del topo e trasferire 5 l'l di sangue (utilizzando una micropipetta) rapidamente al tubo contenente il supporto ookinete incompleto - eparina. Mescolare delicatamente e caricare 12 l del tubo di diluizione del sangue 1:10 su un emocitometro e lasciarlo a temperatura ambiente (20-24 gradi centigradi).
   3. Iniziare a contare gli eventi di esflagellazione 9-10 min dopo aver preparato la diluizione 1:10. Utilizzare un microscopio a luce a contrasto di fase con ingrandimento 40x.
   4. Moltiplicare il numero medio di eventi di esflagellazione contati per 10 e poi moltiplicarsi per il fattore di diluizione (10) per determinare il numero medio di esflagellazione per microlitro di sangue infetto.
      NOT: Questo analisi misura il numero di eventi di esflagellazione dei gameti maschili in un volume di sangue di 1 ll, che può essere quantificato utilizzando un emocitometro. Un mezzo ookinete incompleto¹⁸ viene mescolato con il sangue per imitare da vicino le condizioni durante le quali l'esflagerazione si verifica all'interno della zanzara midgut poco dopo un pasto di sangue.

3. Isolamento ed elaborazione dei parassiti in fase sanguigna da eritrociti infetti e preparazione del magazzino congelato

1. Sanguinamento terminale di roditori infetti da foratura cardiaca
   1. Preparare una siringa ad ago da 26 G che contenga circa 20 .
   2. Utilizzare un flusso lento di CO₂ per eutanasia il topo prima di sanguinare. In alternativa, anestesizzare il topo con isoflurane (che deve essere mantenuto prima e durante l'incisione cutanea per esporre il cuore).
   3. Posare il mouse sulla schiena e pin giù le sue appendici. Fare una piccola incisione nella pelle vicino alla base dello sterno tirando su la pelle con pinze e tagliandola con le forbici. Tirare la pelle a parte nel sito dell'incisione per esporre il diaframma e la parte superiore della cavità addominale.
   4. Tenere la base della gabbia toracica con pinze e tagliare attraverso il diaframma per entrare nella cavità toracica; fare attenzione a non danneggiare il cuore o i polmoni. Pin indietro la gabbia toracica per esporre il cuore.
   5. Forare delicatamente il cuore e tirare lentamente verso l'alto lo stantuffo della siringa per raccogliere 1 mL di sangue e trasferirlo in un tubo di microcentrifuga.
2. Preparazione di stock congelati da sangue infetto
   1. Sanguinare i topi (vedi sezione 3.1) con parassiti del sangue che sono tra circa il 2% e 5%, con una quantità significativa di stadi dell'anello e non come molti gametociti.
   2. Mescolare la porzione di sangue desiderata con la soluzione di congelamento (10% glicerolo nella soluzione di Alsever) in un rapporto 1:2 e conservare in fiale criogeniche. Congelare in azoto liquido.
3. Isolamento e purificazione dei parassiti dello stadio del sangue per l'estrazione di DNA, RNA e proteine
   1. Topi di Bleed (vedi sezione 3.1) con parassiti del sangue superiori allo 0,5%.
   2. Preparare una siringa da 10 mL rimuovendo lo stantuffo e inserendo un piccolo tampone di cotone. Portare il cotone sul fondo della siringa. Riempirlo con cellulosa fino a quando il livello di cellulosa raggiunge il marchio 3 mL, ma non supera il marchio 4 mL sulla siringa.
   3. Fissare la siringa in una clip su un supporto ad anello e posizionare un tubo di raccolta dei rifiuti sotto di essa. Aggiungere 5 mL di PBS alla siringa e lasciarla fluire nel tubo di scarico.
   4. Preparare gli stock congelati, se necessario, utilizzando solo 100-300 - L di sangue. Aggiungere il resto del sangue infetto (400-700 l) alla colonna. Raccogliere il flusso attraverso con un tubo di scarico fino a quando le goccioline iniziano a diventare rosse. Una volta che le goccioline iniziano a diventare rosse, posizionare un nuovo tubo di raccolta 14 mL sotto la siringa per raccogliere il flusso attraverso.
   5. Una volta che il flusso inizia a rallentare, aggiungere PBS alla siringa e raccogliere il flusso attraverso nel tubo 15 mL fino a quando non è stato raggiunto un volume totale di 14 mL. Raccogliere il flusso rimanente attraverso con un tubo di scarico.
   6. Centrifugare il tubo da 14 mL con miscela di sangue/PBS per 8 min a 250 x g senza freni. Rimuovere il supernatante e aggiungere 14 mL di saponina refrigerata (50 mg di saponina in 50 mL di PBS). Per spostare il pellet, invertire il tubo più volte e vortice, se necessario.
   7. Centrifugare il tubo per 8 min a 1.217 x g senza freni. Rimuovere il supernatante, lasciando circa 0,5 mL della soluzione sopra il pellet.
   8. Risospendere il pellet nella soluzione utilizzando una micropipetta e trasferirlo in un tubo di microcentrifuga. Aggiungere 500 l di PBS al tubo da 14 mL per lavare eventuali parassiti residui lasciati nel tubo. Aggiungere questo allo stesso tubo di microcentrifuga.
   9. Centrifugare il tubo per 2 min a 6.010 x g. Rimuovere il super-natante e sospendere 1 mL di PBS. Centrifuga per 2 min a 9.391 x g.
   10. Procedere all'estrazione del DNA genomico, dell'RNA totale e delle proteine.
       1. Per l'estrazione genomicadel DNA, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 200 gradi L di PBS, quindi seguire qualsiasi protocollo adatto di estrazione gDNA.
       2. Per l'estrazione totaledell'RNA , rimuovere il supernatante, resospendere e vortice il pellet in 1 mL di qualsiasi soluzione a base di isoticadina fenolo e guanidina o qualsiasi altro reagente adatto e, quindi, seguire qualsiasi protocollo adatto di estrazione totale dell'RNA.
       3. Per l'estrazione totale delle proteine, rimuovere il supernatante, risospendere il pellet in un volume appropriato di 6x solfato di sodio dodecyl (SDS) colorante carica o qualsiasi altro reagente adatto e, quindi, seguire qualsiasi protocollo adatto di elaborazione totale delle proteine.

4. Saggi di infezione da zanzara

NOT: La zanzara è l'ospite principale dei parassiti della malaria dove avviene la riproduzione sessuale. L'infezione dei topi per trasmettere i parassiti della malaria alle zanzare è condotta da una flebo di almeno 1 milione di stadi di sangue, seguita dall'alimentazione di un topo infetto (da ogni genotipo che mostra il più alto tasso di estensione di gameti maschile) per Anopheles zanzare in una gabbia al giorno 3 post-infezione del topo. L'iniezione IV con 1 milione di parassiti in fase sanguigna nei topi trattati con feniliddrza ini topi trattati con feniliddra garantirà lo sviluppo del gametocite maschile e femminile a un tasso più veloce e più alto. Le zanzare infettate da P. yoelii e P. berghei sono incubate rispettivamente a 24 e 20-21 gradi centigradi per consentire lo sviluppo delle fasi di zanzara⁶.

1. Alimentazione delle zanzare e determinazione del numero di ookinetes per zanzara
   1. Femmina adulta di fame Anopheles stephensi o zanzare A. gambiae (4-7 giorni) per 8-12 h prima dell'alimentazione. Lasciare che le zanzare adulte si alimentino per almeno 15 min sui topi anestesiini (iniettati con una dose appropriata di ketamina/xylazina) con il più alto tasso di esclamazione (misurato nella sezione 2.3).
      NOT: La soluzione di lavoro ketamina/xylazine viene preparata con la diluizione 1:5 della soluzione di riserva in salina e IP che inietta 100 L per topo. Per una soluzione di riserva da 10 mL, 1 mL di xilozina (100 mg/mL) viene aggiunto a 9 mL di ketamina (100 mg/mL).
   2. Rimuovere le zanzare femminili non nutrite e le zanzare maschili con un aspiratore della bocca.
   3. A 18-20 h dopo l'alimentazione, raccogli 20-30 zanzare e mettile in freezer per non meno di 10 min per garantire la morte. Utilizzando un mirino di dissezione binoculare, spiedirate 20-30 midguts pieni di sangue con due aghi da 26 G o 27 G o un ago e pinze in mINI di dissezione RPMI o PBS e trasferite le midguts in un tubo di microcentrifuga contenente 200 l di RPMI o PBS (per il metodo di dissezione consultare la sezione 4.3).
   4. Centrifugare il tubo di raccolta per 1 min a 700 x g. Macinare i midgut sbucciati utilizzando un pestello. Ripetere questo passaggio.
   5. Trasferire 50 -L dal tubo degli omidi a terra in un nuovo tubo di microcentrifuga. Aggiungere 200 l di RPMI o PBS per creare una diluizione 1:5.
   6. Trasferire 12 l in un emocitometro e incubarlo a temperatura ambiente per 5 min per consentire al contenuto di stabilirsi.
   7. Determinare il numero medio di ookineti utilizzando un microscopio luminoso con un contrasto di fase e un ingrandimento di 40x.
   8. Moltiplicare il numero medio di ookinetes maturi per 10 e poi per il fattore di diluizione di 5 per determinare il numero totale medio di ookinetes.
   9. Dividere il numero medio di ookineti per il numero di zanzare nutrite nel sangue sezionate per determinare il numero di ookineti per zanzara nutrita nel sangue.
2. Determinazione del numero di oocisti primitivi per ceppi di parassiti fluorescenti che esprimono proteine simili a WT
   NOT: Lo scopo di questo saggio è quello di determinare il numero di parassiti vivi che esprimono proteine fluorescenti verdi (GFP) che hanno stabilito un'infezione completa degli intermediari delle zanzare e hanno formato le oocisti sferiche precoci. Questo test determina se gli ookineti (il loro sviluppo stimato nel saggio precedente) hanno completato le loro funzioni con l'attraversamento attraverso le cellule epiteliali midthelial della zanzara e la trasformazione in oocisti primitivi sul lato basale della lamina basale del midgut epitelia o no. Questo è un altro saggio che fa grande uso dei parassiti che esprimono GFP, poiché il conteggio delle prime oocisti in questa fase sarà quasi impossibile senza noioso immunostaining.
   1. Dissezionai i midguts (cfr. sezione 4.1) di 20-30 zanzare nutrite con sangue, al giorno 3 o 4 post-alimentazione zanzara (pmf) per P. yoelii 17X-NL, e al giorno 6 o 7 pmf per P. berghei ANKA, con due aghi da 26 G o 27 G o un ago e pinze in RPMI o PBS dissezione edium (Per il metodo di dissezione si prega di consultare la sezione 4.3).
   2. Stendere 40-50 l di mezzo di dissezione sulla linea media orizzontale del bordo più lungo dello scivolo di vetro. Trasferire i midguts a questa linea, uno alla volta, durante la dissezione, e aggiungere più medio ai midguts, se necessario, per evitare l'essiccazione.
   3. Posizionare un coperchio delicatamente sui midgut santri e sigillarlo con smalto.
   4. Utilizzando l'obiettivo 10x o 20x del microscopio a fluorescenza con il filtro a fluorescenza verde, contare il numero di oocisti precoci su ogni midgut, in almeno 20 midguts.
3. Determinazione del numero di sporozoiti oociti per zanzara
   1. Dissezionare i midgut soffoni di almeno 20-30 zanzare con due aghi da 26-G o 27-G o un ago e pinze in mezzo di dissezione RPMI o PBS e raccogliere le midgut scandite in 200 .
   2. Tenere i segmenti inferiori dell'addome saldamente in posizione con un ago (o pinze) e spingere leggermente il torace in direzione verso l'alto con l'altro ago alla giunzione tra il torace e l'addome. Fare con attenzione brevi spinte fino a quando il torace si separa dall'addome. Non appena inizia la separazione, il midgut bianco apparirà allungato, e quindi il midgut sarà tagliato dall'estremità dell'esofago utilizzando lo stesso ago che è stato utilizzato per separare il torace. Se ancora attaccato all'addome, lo stesso ago può essere utilizzato per tirare il budello dall'addome. Trasferire i midguts di tutte le zanzare al tubo di raccolta raccogliendole dal mezzo con un ago, una alla volta.
   3. Centrifugare il tubo di raccolta per 1 min a 700x g per risolvere i midguts sul fondo del tubo di raccolta e macinarli con un pestello. Ripetere questo passaggio.
   4. Trasferire 12 l in un emocitometro e incubarlo a temperatura ambiente per 5 min per consentire a il suo contenuto di stabilirsi.
   5. Contare gli sporozoiti oocisti utilizzando un obiettivo 40X di un microscopio luminoso. Utilizzare le diluizioni 1:5 e/o 1:10 se i detriti di zanzara impediscono il conteggio preciso delle sporozoiti o se il numero di sporozoiti è troppo alto per essere contato con precisione.
   6. Calcolare il numero totale medio di sporozoites oociti moltiplicando il numero medio di sporozoiti per 10 e, quindi, moltiplicando tale numero per il fattore di diluizione, se presente, e per il volume totale (200 .
   7. Dividere il numero totale medio di sporozoiti per il numero di zanzare sezionate per calcolare il numero medio di sporozoiti oociti per zanzara.
      NOT: Un errore comune per misurare il successo o la produttività dell'infezione da stadi di zanzara è il conteggio del numero di oocisti nelle fasi successive dello sviluppo delle oocisti. Ciò è dovuto ad alcune oocisti vacuolate in momenti successivi di sviluppo dell'oocisti, e altri non riescono a sviluppare sporozoiti, anche sullo stesso midgut. Il metodo migliore e più affidabile per determinare la produttività dell'infezione da stadi di zanzara è il conteggio del numero medio di sporozoiti midgutss nei giorni 10-12 post-infezione per P. yoelii e nei giorni 12-14 post-infezione zanzara per P. berghei.
4. Determinazione del numero di sporozoiti salivari per zanzara
   nota:La valutazione finale del completamento completo dello sviluppo delle fasi di zanzara viene completata stimando il numero di sporozoiti che hanno invaso la ghiandola salivari, che sono gli stadi trasmissibili e infettivi ai vertebrati. L'invasione della ghiandola salivare è stabilita dopo il completamento dello sviluppo di sporozoite oocisti, uscita nell'emolfamph, attaccamento alla lamina basale delle cellule acinarie salivare, e l'attraversamento delle cellule acinari per raggiungere le ghiandole salivari Condotti^{5 Del numero 3(}. Pertanto, questo saggio è anche una valutazione del successo di tutti questi processi o meno. Tuttavia, una stima del numero di emolymph sporozoite consentirebbe la differenziazione tra difetti nell'uscita da oocisti e difetti nell'invasione delle ghiandole salivari^{35 Mi lasa}. La purificazione delle sporozoiti delle ghiandole salivari permette di condurre molteplici analisi funzionali sulla motilità sporozoite e sui fenotipi di invasione. La ghiandola salivare sporozoites può essere utilizzata anche per l'infezione in vivo dei topi e negli studi di immunizzazione^{36 Mi lasa,37 Mi lasa' di}. Inoltre, le fasi più riproducibili disponibili per stabilire un'invasione in vitro del fegato o un test di sviluppo è mediante l'uso di sporozoiti della ghiandola salivari.
   1. Dissezionare le ghiandole salivari di 50-100 zanzare femmine, ai giorni 14-16 pmf per P. yoelii e nei giorni 17-20 per P. berghei, preferibilmente con due aghi da 26 G o 27 G, in RPMI o DMEM medio tenuto su ghiaccio e integrato con 5% siero bovino fetale (FBS) o/bovine serum albumin (BSA) per P. yoelii sporozoites o 3% FBS/BSA per P. berghei sporozoites. Se gli sporozoiti devono essere utilizzati in epatoma in saggi in vitro, aggiungere l'1% di penicillina /streptomiacina al mezzo di dissezione. Ci sono generalmente due metodi per la dissezione delle ghiandole salivari. Il primo metodo richiede molto tempo, ma porta alla dissezione delle ghiandole salivari con pochissimi o nessun tessuti contaminanti. Il secondo metodo richiede meno tempo, ma porta alla raccolta di una quantità significativa di tessuti contaminanti. Il primo metodo è dettagliato qui.
   2. Tenere i segmenti dell'addome superiore in posizione con il lato smussato di un ago e spingere con attenzione la testa con molta leggerezza (in spinte molto brevi) alla giunzione tra la testa e il torace in direzione verso l'alto fino a quando la testa è accuratamente separata dal torace senza strappando le ghiandole salivari vitree, le ghiandole salivari esposte vengono poi separate dalla testa con lo stesso ago che ha spinto la testa verso l'alto.
   3. La ghiandola salivare sezionata sarà sollevata dal mezzo di dissezione utilizzando una pipetta Pasteur in vetro corto.
   4. Quando tutte le ghiandole salivari sono state sezionate e raccolte, il talento metterà il tubo contenente i midguts nella centrifuga (1 min, 700 x g).
   5. Contare gli sporozoiti usando un emocitometro al microscopio leggero impostato sul contrasto di fase 2 e sull'ingrandimento 40x. Se il numero delle zanzare sezionato 40 dollari, diluire le ghiandole salivari a 1:5 o 1:10, a seconda della resa infettiva prevista (determinata nei saggi precedenti).
   6. Moltiplicare il numero medio di sporozoiti per 10 e il fattore di diluizione (se presente). Moltiplicare per il volume totale per determinare il numero medio di sporozoiti della ghiandola salivari. Dividere per il numero di zanzare femminili sezionate per determinare la ghiandola media salivava sporozoites per zanzara.
      NOT: Il problema con la dissezione delle ghiandole salivari è la loro piccola dimensione e l'aspetto trasparente vetroso. Pertanto, è molto difficile isolare le ghiandole salivari e, quindi, di solito vengono sezionate come somma forfettaria con altri tessuti dalla parte frontale del torace, che è anche importante per proteggere le ghiandole salivari dalla rottura durante la raccolta.

Risultati

Il successo dell'applicazione di strumenti e tecniche genetiche inverse ai parassiti della malaria ha rivoluzionato il campo della ricerca sulla malaria, con la possibilità di aggiungere, eliminare o modificare segmenti genomici specifici di diverse specie di Plasmodium ³⁹. È importante sottolineare che i loci genomici dispensabili sono stati identificati e utilizzati con successo per introdurre marcatori proteici di fluorescenza nei parassiti del rodito...

Discussione

Nonostante la somiglianza nella biologia generale dei loro cicli di vita a quella dei parassiti della malaria umana, i modelli di malaria dei topi hanno anche molte differenze rispetto alle specie di Plasmodium umano che limiterebbero il loro uso come modelli affidabili in vivo. Ad esempio, ad eccezione dei parassiti attenuati dal vivo come vaccini, tutti gli studi sui vaccini con sottounità e DNA e altri vaccini hanno dato ottimi risultati nel modello murino, ma negli esseri umani che vivono in aree e...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin	Sigma	375095-100KU
Xanthurenic acid	Sigma	D120804-5G
Hypoxanthine	Sigma	H9377-25G
Alsever's solution	Sigma	A3551-500ML
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761-500G
Phenylhydrazine	Sigma	P26252-5G
Glycerol	Sigma	G5516-500ML
Giemsa	Sigma	GS1L-1L
26 G x 3/8 Precision Glide Needle,	Becton Dickinson	305110
1 mL TB Syringe, 26 G x 3/8	Becton Dickinson	309625
1 cc Insulin Syringe, U-100 27 G	Becton Dickinson	329412
Isoflurane, USB	Piramal	2667- 46- 7
PBS, pH 7.4	Gibco	10010049
RPMI	Gibco	22400105
DMEM	Gibco	11995065
Pencillin/Streptomycin	Gibco	10378016
Fetal Bovine Serum	Gibco	10082147
Fiber Glass Wool	Corning	3950