Ottica pH quantificazione di intracellulare in Drosophila melanogaster anatomista Epithelia con pH indicatore fluorescente geneticamente codificato

Riepilogo

Trasporto ionico cellulare spesso può essere valutata attraverso il monitoraggio pH intracellulare (pH_ho). Geneticamente codificato indicatori di pH (GEpHIs) forniscono ottico quantificazione del pH intracellulare in cellule intatte. Questo protocollo dettaglia la quantificazione del pH intracellulare attraverso cellulare ex vivo live-immagini di tubuli malpighiani di Drosophila melanogaster con Bud, un pseudo-raziometrici geneticamente codificato indicatore di pH.

Abstract

Trasporto ionico epiteliale è vitale per omeostasi ionica sistemica così come manutenzione dei gradienti elettrochimici cellulari essenziali. PH intracellulare (pH_io) è influenzato da molti trasportatori di ioni e quindi monitoraggio pH_mi è uno strumento utile per la valutazione dell'attività di trasportatore. Moderno geneticamente codificato-indicatori di pH (GEpHIs) forniscono ottico quantificazione del pH in cellule intatte su scala cellulare e subcellulare. Questo protocollo descrive la quantificazione in tempo reale del pH cellulare_ho regolamento in tubuli malpighiani (MTs) di Drosophila melanogaster attraverso ex vivo live-immagini di Bud, una pseudo-raziometrici GEpHI con un pK_un adatto per tenere traccia di variazioni di pH nel citosol. Estratto Mosca adulta MTs sono composte da sezioni morfologicamente e funzionalmente distinte del epithelia strato unicellulare e può servire come un modello accessibile e geneticamente trattabile per indagine di trasporto epiteliale. GEpHIs offrono parecchi vantaggi sopra le tinture fluorescenti convenzionali pH sensibili ed elettrodi iono-selettivi. GEpHIs possibile etichettare popolazioni distinte delle cellule, purché gli elementi appropriati promotore sono disponibili. Questa marcatura è particolarmente utile nelle ex vivo, in vivoe in situ preparati, che sono intrinsecamente eterogenei. GEpHIs consentono anche la quantificazione del pH_i nei tessuti intatti nel tempo senza necessità di esternalizzazione di trattamento o tessuto di tintura ripetute. Lo svantaggio principale del GEpHIs corrente è la tendenza ad aggregare nelle inclusioni citosoliche in risposta al danno tissutale e costruire la sovra-espressione. Queste carenze, loro soluzioni e vantaggi che essi GEpHIs vengono illustrati nel presente protocollo attraverso la valutazione del trasporto di protoni (H⁺) basolateral nelle cellule principali e stellari funzionalmente distinte di estratti fly MTs. Le tecniche e l'analisi descritta sono facilmente adattabile ad un'ampia varietà di preparazioni di vertebrati e invertebrati, e la raffinatezza del dosaggio può essere scalata da laboratori intricato determinazione del flusso ionico attraverso specifici trasportatori didattici.

Introduzione

L'obiettivo del presente protocollo è quello di descrivere la quantificazione del pH intracellulare (pH_i) utilizzando un geneticamente codificato-indicatore di pH (GEpHI) e dimostrare come questo metodo può essere utilizzato per valutare basolaterale trasporto di H⁺ in un insetto di modello (D. melanogaster) struttura renale, l'anatomista (MT). MTs servire come gli organi escretori del moscerino della frutta e sono simili ai mammiferi nefrone in diversi aspetti chiave¹. MTs sono disposti come 2 paia di tubuli (anteriori e posteriori) nel torace e l'addome della Mosca. Il tubo epiteliale unicellulare di ogni MT è composto di cellule principali metabolicamente attive con la clausola distinct apicale (luminal) e basolaterale (emocele) polarità come pure intercalate cellule stellate. MTs anteriore sono composti da 3 morfologicamente, funzionalmente, ed inerente allo sviluppo distinti segmenti, in particolare l'iniziale dilatati segmento e segmento di transizione secretiva segmento principale, che si unisce all' uretere². A livello cellulare trasporto trans-epiteliale ionico nel lumen è compiuto da una membrana plasmatica apicale del V-ATPasi³ e uno scambiatore di alcali-metallo/H⁺ , nonché un basolateral Na⁺-K⁺-ATPasi⁴, verso l'interno-raddrizzatore K⁺ canali⁵, Na⁺-driven Cl⁻/HCO₃⁻ scambiatore (NDAE1)⁶e Na⁺-K⁺-2 Cl⁻ cotransporter (NKCC; Ncc69),⁷, mentre le cellule stellate mediano Cl^– e acqua di trasporto^8,9. Questo sistema fisiologico complesso ma accessibile offre eccellenti opportunità per indagine dei meccanismi di trasporto di ioni endogeni quando combinato con i diversi set di strumenti genetici e comportamentali di Drosophila.

La spiegazione razionale per questo protocollo era di descrivere un sistema geneticamente malleabile per studiare il trasporto ionico epiteliale con un potenziale di integrazione da cella a comportamento e l'esportazione di strumenti ad altri sistemi di modello. Espressione di Bud¹⁰, un GEpHI derivato da una fusione di verde pH sensibili Super-eclittica pHluorin^11,12 (SEpH) e rosso mCherry pH-insensibile¹³, in MTs permette quantificazione di trasporto H⁺ in celluli MT attraverso la tecnica di calibrazione /nigericin alta K⁺¹⁴. Come molti trasportatori di ioni spostano equivalenti di H⁺ , quantificazione del pH intracellulare funge da rappresentazione funzionale del movimento di ioni attraverso una varietà di trasportatori. Il sistema di modello di Drosophila MT offre anche potenti strumenti genetici in tessuto-specifico transgene¹⁵ ed espressione di RNA interferenza (RNAi)¹⁶ , che può essere combinato con imaging cellulare e intero-organo saggi^{17 , 18 , 19} della funzione del tubulo per creare un robusto set di strumenti con integrazione verticale da molecole di comportamento. Questo è in contrasto con molti altri protocolli per la valutazione biologia epiteliale, come storicamente tali misure hanno contato su intricati e scoraggiante micro-dissezione, sofisticato elettrodi iono-selettivi^20,21, e costosi pH sensibili coloranti²² con richieste di caricamento restrittive e scarsa specificità cellulare nei tessuti eterogenei. GEpHIs sono stati utilizzati estesamente misurare pH_sono in una varietà di tipi di cella²³. Primi lavori sfruttati la pH-sensibilità intrinseca di verde fluorescente Protein (GFP) per monitorare il pH in cellule epiteliali coltivate²⁴ , ma negli ultimi due decenni hanno visto GEpHIs utilizzato in neuroni²⁵, glia²⁶, funghi²⁷ , e pianta cellule²⁸. La combinazione del potenziale per il targeting cellulari di costrutti genetici attraverso il sistema di espressione GAL4/UAS¹⁵ e l'accessibilità al fisiologico della drosofila MT rendono questo una preparazione ideale per indagini di pH_ho regolamento e trasporto ionico epiteliale.

regolazione del pH è stato studiato per decenni ed è vitale alla vita. La preparazione di MT offre un modello affidabile per insegnare la fisiologia della regolazione del pH_ho ma anche eseguire sofisticate indagini di pH_i regolamento ex vivo e in vivo. Questo protocollo descrive la quantificazione del movimento H⁺ attraverso la membrana basolaterale delle cellule epiteliali di Drosophila MT utilizzando il NH₄caricamento tecnica²¹acido di impulso di Cl, ma come l'indicatore di pH è geneticamente codificato, questi metodi e loro quadro teorico può essere applicati a qualsiasi preparazione suscettibili di transgenesi e live-imaging.

Protocollo

Tutti i punti in questo protocollo conformi alle linee guida uso animale Mayo Clinic (Rochester, MN).

1. allevamento di volare

1. Vola di rilancio e insieme traverse secondo standard allevamento²⁹.
   Nota: Espressione di reporter fluorescente dal sistema GAL4/UAS è proporzionale alla temperatura e quindi allevamento temperatura può essere regolata per modificare il livello di espressione. Mentre i livelli di espressione alta conducono spesso ad un migliore rapporto segnale-rumore questa circostanza inoltre è associata con aumentati citosolici e organellari aggregati quando usando GFP per fusione proteina fluorescente rosso (RFP) costruisce come Bud^{10, 30,31}. Se l'aggregazione è inevitabile, la quantificazione è ancora possibile eseguendo punto calibrazioni in ogni esperimento e normalizzare i dati tale che un rapporto di fluorescenza di 1.0 corrisponde al pH_ho 7.0 (vedere il punto 7.4 Nota sulla calibrazione qui sotto).
2. Insieme traverse di omozigoti Carosso-GAL4³² maschi omozigoti UAS-Bud¹⁰ femmine vergini e omozigotica c724-GAL4² maschi per le femmine omozigoti Vergine di UAS-Bud per consentire la formazione immagine del pH in cellule principali e le cellule stellate della MT, rispettivamente. Posto 6 UAS-Bud femmine con 3 maschi GAL4 nei flaconi di freschi di cibo e lasciare ad accoppiarsi a 28 ° C.
   Nota: Le larve devono essere evidenti all'interno 4D e adulti inizierà a eclose intorno giorno 10.
3. Raccogliere femminile mosche su eclosion e mettere da parte per età per 10 d a 28 ° C.
   Nota: I tempi di sperimentazione possono essere regolato per corrispondere a qualsiasi analisi comportamentale restrittive (ad esempio il Ramsay secrezione dosaggio^17,19) che saranno correlate a imaging pH intracellulare dal vivo. Mosche maschi possono essere utilizzati ma tubuli dalle femmine sono spesso più grandi e più robusto.

2. preparazione dei vetrini di poli-L-lisina.

1. Disegnare un bordo di 40 x 20 mm con una penna PAP idrofobica intorno alla parte superiore di diapositive standard 75 x 25 mm e mettere da parte ad per asciugare per 15 min a RT. uso grandi coprioggetti se le diapositive non sono compatibili con ottica di imaging.
2. Trasferire 2 mL di soluzione madre di poli-L-lisina (PLL) 0,01% in ogni diapositiva e mettere da parte per 1 h a TA.
3. Rimuovere l'eccesso PLL con una pipetta. Salvare la soluzione in un flaconcino di 50 mL conica per un utilizzo futuro. Conservare a 4 ° C.
4. Aspirare eventuali residui di soluzione con una linea del vuoto. Eseguire la linea del vuoto sopra la superficie intera diapositiva per garantire che nessuna soluzione rimanga sugli scivoli.
5. Impostare le diapositive da parte per altre 1 h prima del RT uso. Archiviare le diapositive asciutto a temperatura ambiente per 1 mese in un libro di diapositiva standard.

3. preparazione della dissezione del piatto e bacchette di vetro

1. Aggiungere 0,5 mL di agente indurente elastomero a 4,5 mL di elastomero base in polistirolo un 35 x 10 mm di Petri a RT per produrre una profondità di 5 mm. Mix con una pipetta monouso. Consentire l'elastomero curare O/N a TA.
   Nota: Elastomero deve essere limpida e priva di bolle. Schiarimento di bolle può essere facilitato mantenendo lastre in elastomeri in un barattolo vuoto per 10-15 min dopo la colata.
2. Tenere una bacchetta di vetro del diametro di 5 mm tra le mani e sciogliere il centro dell'asta sopra un bruciatore di Bunsen illuminato mentre tirando le estremità a pezzi. Come il vetro si scioglie tirare più rapidamente di produrre una sottile (0,1 mm) e albero conico (Figura 1).
   Nota: Un angolo di 45 ° alla tibia è spesso utile nella gestione dei tubuli. Ciò può essere ottenuto abbassando una mano come la tibia è tirata (Vedi Figura 1).
3. Rottura dell'albero sottile nel mezzo, con il lato smussato di una lama di rasoio taglio singolo in acciaio al carbonio. Ispezionare l'estremità sottile dell'asta in un ambito di dissezione per garantire che l'interruzione è pulito.

Figura 1: Fabbricazione di bacchette di vetro per la movimentazione di tubuli malpighiani.
A - E. Processo di riscaldamento e tirando una bacchetta di vetro per produrre una conicità e angolo adatto per la movimentazione MTS. frecce indicano la direzione e l'entità della forza da applicare. F. fotografia di uno strumento di vetro opportunamente fabbricato. Barra della scala = 10 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. preparazione di soluzioni e sistema di perfusione

Nota: Aspersione sistemi differiscono dal produttore. Questo protocollo è basato intorno un serbatoio aperto 8 canali gravità con un regolatore di flusso in ingresso e un deflusso di vuoto-driven, ma il metodo di montaggio che MTS come descritto qui può essere adattato per funzionare con qualsiasi sistema di perfusione.

1. Preparare le seguenti soluzioni:
   1. Di aliquotare Schneider mezzo (40 mL in fiale conica 50 mL) e conservare a 4 ° C.
   2. Preparare soluzioni (cioè insetto Phosphate-Buffered Saline (iPBS) e iPBS con NH₄Cl) presso RT come necessario secondo la tabella 1). Soluzioni caldi a RT prima dell'uso il giorno dell'esperimento.
      Nota: iPBS e iPBS con 40 mM NH₄Cl può essere preparato in grandi volumi (1 L o più) e conservato a 4 ° C.
   3. Preparare 8 soluzioni di calibrazione in volumi di 500 mL a pH = 5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 7.3, 7.6, 8.0 e 9.0, come indicato nella tabella 1 e conservare a 4 ° C. Regolare il pH di ogni soluzione mediante titolazione con N-metil-D-glucamine (NMDG) e HCl.
   4. Il giorno di esperimenti, caldo aliquote di 5 mL delle soluzioni di taratura a RT e aggiungere soluzione stock Nigericina (20 mM di solfossido dimetilico (DMSO)) per produrre una concentrazione finale di 10 µM.
      Attenzione: Maneggiare Nigericina con i guanti. Trattare tutte le apparecchiature che viene a contatto con la Nigericina come USA e getta. Nigericina rimane sul vetro e plastica e comprometterà biologico preparazioni se attrezzature sono stata riutilizzata.
2. Sistema di perfusione:
   1. Preparare il sistema di perfusione compilando tutti i serbatoi con ddH₂O (Figura 2). Aprire i canali uno alla volta per consentire prossimale per il regolatore di portata per riempire tutte le linee.
      Nota: Potrebbe essere necessario deselezionare aria nelle linee aprendo il canale in fase di stallo e utilizzando un pistone per unità di flusso dal serbatoio.
   2. 2 canali aperti e consentire ddH₂O di scarico. Una volta che i serbatoi sono quasi vuoti, riempire il serbatoio primo con iPBS e il secondo serbatoio con NH₄iPBS Cl-pulsato. Impostare la portata al massimo con il regolatore di portata e lasciare che ogni soluzione di fluire per 1 min riempire le linee distale, quindi arrestare il flusso (Figura 2).
   3. Posizione 2 set di morsetti "helping hands" di saldatura sul palco microscopio imaging. Mettere un morsetto su ciascun lato della piattaforma imaging.
   4. Riscaldare con attenzione i distale 0,5 pollici di un pezzo di vetro capillare (diametro 1,5 mm, diametro esterno 0,86 mm, lunghezza 100 mm) sopra un bruciatore di Bunsen. Creare una curva a 45 ° consentendo l'estremità distale di piegare dalla forza di gravità e rimozione del vetro dalla fiamma una volta raggiunto l'angolo desiderato. Ripetere questo processo con un secondo pezzo di vetro capillare.
   5. Inserire i capillari di vetro curvato nella linea di flusso e deflusso vuoto-collegato rispettivamente e montarli in "helping hands" per allinearli con la tappa di formazione immagine del microscopio (Figura 3).

Figura 2: Sistema di perfusione e configurazione di Imaging.
Componenti necessari per la valutazione fisiologica della funzione di trasporto MT basolaterale tramite simultanea vivono scambio di soluzione di imaging e rapido di fluorescenza. Linee di gas indicati sono facoltativi e consentono l'espansione di esperimenti per la valutazione del trasporto HCO₃^– . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Schema di flusso dell'apparato di perfusione per NH₄Cl Pulse esperimenti.
Le frecce rappresentano percorso di flusso e valvola punti di commutazione. Soluzione si trasferisce dal serbatoio a esemplare di flusso a gravità ed è attirata dalla camera di esemplare la beuta rifiuta di aspirazione di vuoto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. dissezione dei tubuli malpighiani anteriore adulto della drosofila .

1. Raccogliere il piatto di dissezione e tirato una diapositiva rivestite con PLL dalla sezione 2, un divisore di aspersione-pozzo adesivo, grasso per vuoto, bacchetta di vetro dalla sezione 3, una striscia di 4 x 2" di film di sigillo, 2 paia di #5 fine, forcipe, le aliquote di 40 mL di medium RT iPBS e ghiacciata di Schneider.
2. Spalmare grasso vuoto sul nastro sigillante e premere il divisore di aspersione-pozzo adesivo sul nastro per rivestire il fondo con grasso. Staccare l'adesivo divisore di aspersione-pozzo e posizionarlo grasso-side-down sulla cima di una diapositiva rivestita di PLL. Rimuovere il separatore di aspersione-pozzo per lasciare individuali di campione pozzi tracciate nel grasso idrorepellente.
3. Posto 200 µ l di RT iPBS in grasso-accerchiato bene sulla diapositiva rivestita PLL e spostare il vetrino sotto lo stereoscopio.
4. Posto UAS-Bud/carosso-GAL4 mosche in una Mosca vuota fiala e li anestetizzare il ghiaccio per 10 min.
   Nota: Questo metodo di anestesia, a differenza di CO₂, assicura che le mosche non disidratare.
5. Versare mezzo ghiacciato di Schneider nel piatto per dissezione e utilizzare una pinzetta per trasferire una singola Mosca femmina anestetizzata nel piatto sotto uno stereoscopio per dissezione.
6. Afferrare al volo il torace con un set di pinze e utilizzare l'altro per afferrare delicatamente la parte posteriore dell'addome. Aprite la parte posteriore al volo utilizzando le pinze in breve, movimenti intenzionali. Una volta visibile del hindgut, afferrare l'estremità distale e libera l'intestino e MTs dal tracheoles sottostante tirando il hindgut lontano dal corpo attraverso rimorchiatori ripetitivi, brevi.
   Nota: Il MTs anteriore e posteriore sarà visibile dove si incontra la giunzione del midgut e del hindgut attraverso l'uretere. La prima coppia di MTs a essere libero arbitrio probabile essere tubuli posteriore come circondano il hindgut. Questi possono essere ignorati (Figura 4A).
7. Pizzico fuori il MTs anteriore all'uretere con una pinzetta, una volta che la seconda serie di MTs è gratuita dell'addome. Consente di separare il MTs anteriore dall'intestino e chiudere l'uretere.
8. Prelevamento gratuito MTs anteriore con la bacchetta di vetro tirato facendo scorrere l'asta sotto l'uretere tale che i tubuli si iscrivono su entrambi i lati. Consente di estrarre la soluzione MTs verso l'alto.
9. Girare la bacchetta di vetro in modo che la MTs e dell'uretere sono aderiti alla parte inferiore dell'asta e abbassare l'uretere verso il basso nella diapositiva. Appone l'uretere e sigillare le estremità distali del MTs premendo l'uretere giù su vetrino (Figura 4B). Non manipolare il MTs più del necessario. La MTs dovrebbe essere galleggiavano nella soluzione con l'uretere ancorato alla diapositiva.
10. Utilizzare la fine fine della bacchetta di vetro delicatamente spazzare ogni tubulo su tutta la superficie di scorrimento. Brace l'asta contro la diapositiva per evitare di schiacciare il tubulo e far scorrere l'asta sopra la parte superiore del tubulo, movimento distale prossimale, per attaccare l'intera lunghezza di ogni tubulo alla superficie della diapositiva rivestite con PLL (Figura 4).
11. Posto il divisore di aspersione-pozzo adesivo indietro sulla diapositiva per formare un piccolo fluido-riempita oltre il tubulo montato.
12. Posizionare il campione sul tavolino del microscopio. Posizionare l'afflusso e deflusso capillari sopra l'ingresso e l'apertura di uscita della perfusione ben, rispettivamente.
    Nota: Se non si desidera una camera aperta di aspersione, il divisore ben può essere lasciato. In questo caso i capillari di afflusso e deflusso possono essere allineati ai lati opposti di un imaging bene.

6. validazione del protocollo e del tubulo Health Imaging

Nota: Il presente protocollo viene eseguito su un microscopio invertito grandangolari epifluorescente con GFP (SEpH) e set di filtri RFP (mCherry) (eccitazione nm 470/40 (ex), 515 nm longpass emissione (em), 500 nm dicroici e 546/10 nm ex, 590 nm longpass em, 565 nm dicroici), un 10 X / 0.45 aria obiettivo, una telecamera monocromatica per la cattura di immagine live e software di imaging. Il protocollo può essere adattato per qualsiasi montante o microscopio invertito con filtro automatico di commutazione tra software GFP e RFP ottica e immagine acquisizione, sebbene possano variare parametri binning, intensità della luce e tempi di esposizione ottimale. In tutte le analisi, l'intensità della fluorescenza deve essere analizzato come intensità di pixel medi della regione di interesse (ROI), dopo sottrazione di sfondo in ogni canale utilizzando un ROI con non contiene alcuna fluorescenza adiacente al segnale ROI.

1. Accendere il microscopio, una sorgente luminosa e un sistema di imaging.
2. Open software di imaging associato.
3. Guardare attraverso l'oculare e regolare manualmente la messa a fuoco fino a quando il lume della MT è chiaramente visibile sotto la luce trasmessa.
4. Fare clic sulla scheda "Acquisizione" nel software di analisi di immagine e selezionare "2 x 2" nel menu pull-down "Binning" nella sezione "Modalità di acquisizione".
5. Inserire un filtro di densità neutra 5% nel percorso della luce per illuminazione luce di ridurre e minimizzare photobleaching.
6. Il canale GFP (SEpH) nel menu "Canali", scegliere "Live" per osservare il segnale fluorescente tramite la fotocamera.
7. Regolare il dispositivo di scorrimento per impostare il tempo di esposizione, tale che i valori dei pixel più luminosi nell'istogramma intensità sono circa il 40% del valore massimo di "Tempo", quindi fare clic su "Stop" per interrompere l'illuminazione.
8. Ripetere i passaggi 6.6-6.7 nella RFP (mCherry) canale e confermano la presenza del segmento iniziale dilatata della MT anteriore e l'assenza di mCherry citosolico aggrega (indicativo di danno tissutale o sovraespressione) (Figura 4).
   Nota: Il segmento dilatato dovrebbe essere chiaramente evidente, come è il segmento più prossimale del tubulo e il diametro del lume interno di questo segmento è superiore a quella del segmento adiacente transitorio di ~ 20 µm. 2 x 2 pixel binning è spesso sufficiente ma può essere aumentata per ridurre ulteriormente l'intensità di illuminazione richiesto. Tempi tipici di esposizione sono tra 150 e 800 ms/canale. Utilizzare come poca luce possibile per ridurre al minimo photobleaching. Ridurre al minimo photobleaching è essenziale per l'uso di indicatori di dual-fluorophore come Bud come i due fluorofori possono candeggina in modo indipendente, invalidando pertanto alcuna operazione di taratura del rapporto.
9. Abilitare un protocollo di imaging time-lapse cliccando la casella di controllo "Time Series".
10. Regolare la "durata" nel menu a discesa nella sezione "Time Series" per 10 min e il dispositivo di scorrimento di "Intervallo" a 0 per impostare il tempo di acquisizione totale con un tasso di acquisizione massima dell'immagine. Una frequenza di acquisizione totale di 0,2 Hz è spesso sufficiente.
11. Controllare entrambe le caselle RFP (mCherry) nella sezione "Canali" e GFP (SEpH).
12. Aprire la riga di iPBS del sistema aspersione attivando il posizionatore appropriato e avviare il protocollo di formazione immagine facendo clic su "Start esperimento." Dopo 1 min, passare al NH₄Cl soluzione di impulso per 20 s aprendo l'apposita valvola e chiudendo la linea iPBS, quindi tornare alla iPBS NH₄Cl linea di chiudere e riaprire la valvola iPBS. Consentire il protocollo completo di imaging completare prima di arrestare il sistema di perfusione.
    Nota: Time-lapse analisi dovrebbero rivelare un segnale stabile mCherry e un segnale di SEpH che aumenta in presenza di NH₄Cl, disseta al dilavamento e recupera gradualmente.
13. Eseguire una calibrazione a 2 punti.
    1. Rimuovere il divisore ben da peeling lontano la diapositiva sottostante e rimuovere i capillari di aspersione ed i morsetti dall'imaging bene.
    2. Applicare l'imaging bene con una pipetta 200 µ l 200 µ l calibrazione iPBS (pH 7.4, 10 µM Nigericina). Rimuovere la soluzione da imaging bene con la pipetta, quindi sostituire con un altro 200 µ l di soluzione di taratura. Ripetere questa operazione 4 volte per garantire lo scambio di soluzione completa.
    3. Incubare la preparazione in soluzione di calibrazione per 30 min prima di formazione immagine. Ripetere il protocollo imaging utilizzando gli stessi parametri determinati in passaggi 6.6-6.11, con la modifica di solo 1 min di image capture.
       Nota: Il sistema di perfusione e capillari non sono necessari in questo passaggio e non devono essere allegati all'imaging bene per evitare di esporre i vasi capillari a Nigericina.
    4. Aggiungere 200 µ l calibrazione iPBS (pH 9.0, 10 µM Nigericina) per l'imaging bene con una pipetta 200 µ l. Rimuovere la soluzione da imaging bene con la pipetta, quindi sostituire con un altro 200 µ l di soluzione di taratura. Ripetere questa operazione 4 volte per garantire lo scambio di soluzione completa.
    5. Incubare la preparazione della seconda soluzione di calibrazione per 10 min prima di formazione immagine. Ripetere il protocollo imaging come passaggio 6.13.3.
    6. Esaminare lo stack di immagine catturata nel software di analisi di immagine per confermare che nessun pixel a o canale sono saturi cliccando "Significa ROI" e lo scorrimento anche se lo stack di immagine con il cursore di "Frame" osservando che nessun valori segnalati nell'istogramma intensità raggiungere il massimo valore rilevabile. Se qualsiasi frame contengono pixel che raggiungono la massima intensità rilevabile, ridurre l'intensità di tempo o illuminazione di esposizione e la sezione di ripetizione 6.
       Nota: Una volta stabilita non modificare parametri di imaging tra esperimenti o calibrazione senza punto tarature devono essere utilizzati in ogni preparazione (Vedi punto 8.3).
14. Analizzare lo stack di immagine per tracciare l'intensità di fluorescenza e rapporto di fluorescenza (SEpH/mCherry) come funzione del tempo.
    1. Fare clic su "Significa ROI" e selezionare lo strumento forma libera. Tenere premuto il tasto sinistro del mouse per tracciare un ~ 50 µm di lunghezza di MT. Fare clic con il pulsante destro per finire di disegnare il ROI, quindi ripetere in un'area adiacente alla MT per definire uno sfondo ROI (Figura 5A).
    2. Fare clic su "Media intensità" sotto "Misure." Creare una tabella di valori di intensità facendo clic su "Esporta > tabella dati > creazione."
    3. Fare clic sull'icona della ruota dentata di configurazione e de-selezionare tutti i parametri ad eccezione di "Time" e "Significa intensità". Pulsante destro del mouse la scheda per la tabella di dati appena creato, selezionare "Salva con nome" ed esportare i dati come file CSV.
       Nota: Simile può anche essere misurati utilizzando software libero come ImageJ.
    4. Aprire una tabella di foglio di calcolo e importare la tabella di dati selezionando la scheda "Dati" seguita da "Da testo".
    5. Utilizzare le funzioni del foglio di calcolo per sottrarre intensitá del Background di SEpH dall'intensità del segnale di SEpH in ogni momento. Ripetere questo processo per il segnale di mCherry.
    6. Tracciare ogni intensità di canale in funzione del tempo selezionando le colonne contenenti il tempo e dati di intensità sfondo-corretti e quindi facendo clic su "Inserisci > Scatter (grafici) > dispersione con linee dritte" (figura 5B).
    7. Utilizzare le funzioni di foglio di calcolo per calcolare il rapporto di fluorescenza di SEpH/mCherry in ogni momento.
    8. Trama di un rapporto di fluorescenza in funzione del tempo selezionando le colonne contenenti i dati di tempo e rapporto e quindi facendo clic su "Inserisci > Scatter (grafici) > dispersione con linee dritte" (Figura 5).

7. pieno calibrazione di Bud in tubuli malpighiani Ex Vivo.

1. Sezionare e montare un set fresco di MTs anteriore come descritto nella sezione 5.
2. Come descritto nel passaggio 6.13.2 di scambio iPBS per calibrazione iPBS (pH 7.4, Nigericina 10 µM). Incubare per 30 min.
3. Individuare il MTs e raccogliere le coppie di immagini di SEpH/mCherry come descritto ai punti 6.1-6.11. Sostituire la soluzione con un altro stock di calibrazione iPBS come descritto nel passaggio 6.13.4, attendere 10 minuti e ancora l'immagine. Ripetere questo processo fino a quando il rapporto di SEpH/mCherry è stato ripreso in tutte le soluzioni. Ottenere pH 9,0 immagini ultimo appena l'esemplare raramente riprende dal pH elevato.
4. Stampa rapporto di fluorescenza di SEpH su mCherry da tarature in otto esemplari in funzione del pH imposto_io come descritto nel passaggio 6.14.9. Adattare i dati di calibrazione con una curva di Boltzmann per ottenere la funzione di calibrazione completa secondo l'equazione 1 (Figura 5). Se i dati non sono coerenti, trama set di calibrazione da ogni campione normalizzato tale che un rapporto di fluorescenza di 1.0 corrisponde al pH_i 7.0 e rianalizzare (Figura 5E).
   Nota: Se il processo di quest'ultimo è necessario singoli esperimenti saranno necessario proprio punto interno calibrazioni³³ (vedi procedura di quantificazione qui sotto (punto 8.3)).
5. Equazione 1
   
   Dove R = rapporto di SEpH/mCherry e un₁,₂, x_oe dx è curva raccordo parametri che rappresenta il rapporto minimo di fluorescenza, fluorescenza massima ratio, pK_une larghezza della funzione rispettivamente. x_o = apparente pK_una di Bud, che può variare da 7.1 a 7.4 a seconda del tipo di cella e condizioni di taratura esatta.

8. quantificazione dell'acido Basolateral estrusione dal Epithelia anatomista Ex Vivo .

1. Le cellule stellate esprimendo la Bud immagine e principal Bud-esprimendo cellule simultaneamente.
   1. Sezionare anteriore MTs da una Mosca UAS-Bud/carosso-GAL4 come descritto nella sezione 5, ma non trasferire MTs da mezzo di Schneider dissezione per l'imaging bene.
   2. Sezionare anteriore MTs da una Mosca UAS-Bud/c724-GAL4 nello stesso piatto per dissezione utilizzando la procedura descritta nella sezione 5.
   3. Trasferire il 2 set di MTs nell'imaging stesso così come descritto nei passaggi 5.8-5.11.
      Nota: Quando spazzare le braccia del MTs giù per la diapositiva, posizionare il MTs di UAS-Bud/c724-GAL4 e i tubuli UAS-Bud/carosso-GAL4 vicino a vicenda così Bud-esprimendo le cellule principali e stellari possono essere visualizzate nel campo stesso ( Figura 6A).
2. Applicare il NH₄Cl prepulse come descritto nel passaggio 6.12.
   Nota: Se coerenza taratura (Figura 4B) non poteva essere raggiunti, eseguire una calibrazione a punto impostando pH_i a 7.0 alla fine di ogni esperimento con calibrazione iPBS (pH 7.0, 10 µM Nigericina, incubazione di 30 min) dopo l'adesivo divisore di aspersione-pozzo e l'apparecchiatura di perfusione sono stati rimossi.
3. Calibrare le tracce da cellule stellate e principale dei diversi segmenti di MT (usando il rapporto assoluto o normalizzato a seconda dei casi) con 2 equazione e analizzare la fase di recupero dopo NH₄Cl ritiro applicando funzioni di decadimento esponenziale utilizzando software di analisi statistica e notando la costante di decadimento (τ) (Figura 6B).
   Equazione 2
   
   Dove R = rapporto di SEpH/mCherry e un₁,₂, x_oe dx è curva raccordo parametri determinati dalla taratura al punto 7.4 (equazione 1).
   1. Calcolare il tasso di acido estrusione (J_{H +}, Vedi equazione 3) in funzione del pH per tener conto delle variazioni nel pH_io e caricamento tra preparazioni³⁴acido di riposo. Utilizzare le funzioni esponenziali derivate nel passaggio 8.3 per calcolare la derivata del pH per quanto riguarda il tempo in ogni intervallo di tempo.
      Equazione 3
      
   2. Calcolare la capacità intrinseca di tampone (β_i; Equazione 4) del citosol al pH_ho fin dall'inizio di ogni intervallo nel passaggio 8.3.1 basata sulla letteratura precedente (Vedi equazione 4).
      Nota: In Drosophila, la più approfondita caratterizzazione del β proviene da larvale del nervo motore terminali³⁵ e questi dati possono essere presupposti per tenere per le celle di MT in assenza di altri dati disponibili.
      Equazione 4
      
   3. Calcolare il prodotto di β_T (dal punto 8.3.2)_e dpH_ho/dt (dal punto 8.3.1) per determinare J_{H +} (equazione 3).
      Nota: Nelle soluzioni di dimensioni nominali privo di bicarbonato come quelli descritti nel presente protocollo, capacità tampone bicarbonato-derivato (β_b) è considerato ~ 0 mM. Totale tampone (β_T) è la somma del β_io e_βbe quindi β_{io =} β_T in assenza di HCO₃^–Co₂³⁶.
   4. Trama J_{H +} in funzione del pH all'inizio di ogni intervallo di tempo, come illustrato nel passaggio 6.14.9.
   5. Applicare le funzioni di decadimento esponenziale alla porzione di tutti i set di dati che si sovrappongono in pH_ho utilizzando software di analisi statistica. Confronta i tassi di variazione delle funzioni risultante per confrontare i tassi di acido estrusione tra cellule e segmenti di MT (Figura 6).
      Nota: La funzione più appropriata utilizzata per adattamento della curva non può essere sempre un singolo esponenziale. Altre funzioni possono essere sostituiti se migliorano la qualità della misura.
   6. Acido di calcolare in funzione del pH per tener conto delle variazioni in forma e dimensioni della cella di flusso (Vedi equazione 5).
      Equazione 5
      
      Nota: Dimensioni della cella possono essere misurate direttamente in immagini o approssimate. Cellule principali possono essere rappresentate come metà di un tubo cavo con le seguenti dimensioni: diametro interno 24 µm; diametro esterno 48 µm; altezza 50 µm. transitorio cellule stellate sono variabili, ma possono essere rappresentate approssimativamente come cilindri con altezze di 50 µm e diametri di 10 µm. Si veda il paragrafo finale di Rappresentante risultati qui sotto.
   7. Applicare le funzioni di decadimento esponenziale alla porzione di tutti i set di dati che si sovrappongono al pH_ho utilizzando software di analisi statistica. Confronta i tassi di variazione delle funzioni risultante da confrontare acidi flussi tra le cellule e segmenti di MT (Figura 6).

Risultati

Tessuti sani e un'adeguata identificazione del MTs anteriore sono vitali per il successo del presente protocollo. Durante la dissezione, dovrebbe prestare attenzione a non direttamente tocco il MTs e maniglia unica loro dall'uretere come la MTs di presa direttamente porterà alla rottura (Figura 4A– B). Quando MTs sono spazzate piatta sulla diapositiva, i tubuli devono essere toccati il meno possibile e movimento in eccess...

Discussione

Il successo di quantificazione del pH_sono in Drosophila MTs dipende interamente sulla salute degli estratti MTs e la qualità del montaggio e la dissezione (Figura A – C). Così, la gestione attenta del tessuto come descritto è imperativa. Diapositive appena rivestiti in PLL sostanzialmente aiuti MT di montaggio, come essi tendono ad essere molto più adesivo di diapositive che precedentemente sono stati esposti alla soluzione. Montaggio attenzio...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Solution	Sigma-Aldrich	P4832	Store at 4 °C, can be reused.
Nigericin Sodium Salt	Sigma-Aldrich	N7143	CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 °C.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands	Harbor Freight Tools	60501	Available from multiple vendors.
Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors	Bioscience Tools	PS-8S	Any comparable perfusion system can be used.
Flow Regulator	Warner Instruments	64-0221	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Schneider's Medium	Fisher Scientific	21720024	Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dish	Corning Life Sciences	Fisher Scientific 08-757-100A	Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides	Corning Life Sciences	2949-75X25	Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm	Warner Instruments	64-0796	Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Tygon Tubing, ID 1/16", OD 1/8", thickness 1/32"	Fisher Scientific	14-171-129	Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.
Vacuum Silicone Grease	Sigma-Aldrich	Z273554	Available from multiple vendors.
Plastic Flow Control Clamp	Fisher Scientific	05-869	Available from multiple vendors, sterility not required
Glass rods, 5 mm diameter	delphiglass.com	9198	Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Available from multiple vendors.
Sealing Film	Sigma-Aldrich	P7668	Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube	BD Falcon	352096	Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube	BD Falcon	352070	Available from multiple vendors.
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	H3375	Available from multiple vendors.
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate	Sigma-Aldrich	69892	Available from multiple vendors.
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	T5130	Available from multiple vendors.
10X/0.45 Air Objective	Zeiss	000000-1063-139	Comparable objectives can be substituted. 40X objectives can be used for single cell imaging.
Dissecting Stereoscope	Zeiss	Discovery.V8	Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Citation 10
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Citation 32
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Citation 2
Monochromatic High Sensitivity Digital Camera	Zeiss	Axiocam 506 mono	Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic	Chroma	CZ909	Any GFP/FITC filer set can be substituted.
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic	Chroma	CZ915	Any GFP/FITC filer set can be substituted.
Inverted Epifluoescent Microscope	Zeiss	Axio Observer Z.1	Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.
Statistical Analysis Software	Microcal	Origin 6.0	Any software with comparable functionality can be substituted
Image Analysis Software	National Institutes of Health	ImageJ 1.50i	Any software with comparable functionality can be substituted
Image Acquisition Software	Zeiss	Zen 1.1.2.0	Any software with comparable functionality can be substituted
Single-edged Carbon Steel Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	71960	Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder	Fisher Scientific	16-04	Available from multiple vendors.
Bunsen Burner	Fisher Scientific	50-110-1231	Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs	Genesee Scientific	32-109BF	Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket	Fisher Scientific	07-210-129	Available from multiple vendors.
NMDG; N-Methyl-D-glucamine	Sigma-Aldrich	M2004	Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips	MidSci	AV200	Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipette	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	Available from multiple vendors.