Uso di Immunolabeling per analizzare i microtubuli stabili, dinamici e nascenti nell'embrione di pesce zebra

Riepilogo

Immunolabeling metodi per analizzare popolazioni distinte dei microtubuli in zebrafish sviluppo del cervello sono descritti qui, che sono ampiamente applicabili ad altri tessuti. Il primo protocollo delinea un metodo ottimizzato per immunolabeling stabile e dinamica dei microtubuli. Il secondo protocollo fornisce un metodo per immagine e quantificare i microtubuli nascenti in particolare.

Abstract

Microtubuli (MTs) sono strutture dinamiche e fragile che stanno sfida a immagine in vivo, in particolare in embrioni vertebrati. Immunolabeling metodi sono descritte qui per analizzare popolazioni distinte di MTs nel tubo neurale in via di sviluppo dell'embrione di zebrafish. Mentre l'attenzione è il tessuto neurale, questa metodologia è ampiamente applicabile ad altri tessuti. Le procedure sono ottimizzate per presto ad metà-somitogenesis-stage embrioni (1 somite a 12 somiti), tuttavia possono essere adattati ad una gamma di altre fasi con relativamente piccoli aggiustamenti. Il primo protocollo fornisce un metodo per valutare la distribuzione spaziale delle MTs stabile e dinamico ed eseguire un'analisi quantitativa di queste popolazioni con il software di elaborazione delle immagini. Questo approccio si integra con gli strumenti esistenti per immagine microtubule dynamics e distribuzione in tempo reale, utilizza linee transgeniche o espressione transitoria di costrutti con tag. Infatti, tali strumenti sono molto utili, tuttavia non facilmente distinguere MTs dinamica e stabile. La capacità di immagine e analizzare queste popolazioni distinte microtubule ha implicazioni importanti per la comprensione dei meccanismi alla base di polarizzazione cellulare e morfogenesi. Il secondo protocollo delinea una tecnica per analizzare in particolare il nascente MTs. Questa operazione viene eseguita mediante l'acquisizione le proprietà di crescita de novo di MTs nel tempo, seguendo la depolimerizzazione dei microtubuli con il nocodazole di droga e un periodo di recupero dopo interruzione del farmaco. Questa tecnica non è ancora stata applicata allo studio di MTs in embrioni di zebrafish, ma è un saggio prezioso per indagare la funzione in vivo delle proteine implicate in microtubuli.

Introduzione

Microtubuli (MTs) sono polimeri di α - e β-tubulina che assemblare in protofilamenti lineari, molte delle quali si combinano per formare un tubo cavo^1,2. Le MT sono strutture polarizzate, con rapida crescita plus estremità ed a crescita lenta meno le estremità che sono ancorate al centrosoma o altri di organizzazione dei microtubuli (MTOC) centro³. De novo Formazione di MT è iniziata da nucleazione presso l'anello di γ-tubulina complessa (γ-TURC), che fornisce un modello per MT montaggio⁴. In ogni cellula, due popolazioni di MTs possono essere distinte che girano sopra ai tassi differenti. MTs dinamico esplorare il loro ambiente cellulare passando tra le diverse fasi di crescita e di ritiro in un processo noto come instabilità dinamica⁵. A differenza di dinamica MTs, MTs stabile sono non-crescita e hanno un'emivita più lunga rispetto a dinamiche MTs⁶.

Decenni di ricerca in biologia cellulare ha fornito una sofisticata gamma di strumenti per studiare la funzione e la struttura MT e ha provocato un grande corpo di conoscenza su questi elementi del citoscheletro. Per esempio, MTs gioca un ruolo centrale nella creazione e mantenimento della polarità cellulare, che è attribuibile non solo alla loro polarità intrinseca, ma anche per la distribuzione subcellulare differenziale della scuderia contro dinamico MTs^{7, 8}. al contrario, molto meno è capito circa MT architettura e funzione in ambienti (3D) tridimensionale più complessi, come l'embrione dei vertebrati, in parte dovuto la sfida di imaging del citoscheletro MT ad alta risoluzione. Nonostante questa limitazione, la più recente generazione di transgenici esprimenti GFP linee quell'etichetta MTs o transitoria espressione di marcatori di MT fluorescente-Tag ha aumentato la nostra comprensione dei cambiamenti dinamici che MTs subiscono e loro cellulare e ruolo dello sviluppo nell'embrione di zebrafish. L'intera rete MT può essere imaged in linee transgeniche in cui tubulina è sia direttamente con etichetta⁹ o tubulina polimeri sono etichettati indirettamente utilizzando proteine associate MT Doublecortin-like-chinasi (Dclk) o Ensconsin (EMTB)^{10, 11}. Altre linee (e costrutti) sono stati generati che consentire la valutazione della polarità intrinseca MT identificando specificamente MT più finisce o ancorato centrosoma meno estremità^{11,12,13, 14}. la potenza di questi strumenti si trova nella capacità di studiare la dinamica di MT in diretta, lo sviluppo di organismi. Tali studi hanno rivelato, ad esempio, la distribuzione spaziale e dinamica di MTs in popolazioni di cellule specifiche, l'orientamento di mitotic mandrini in tessuti in fase di morfogenesi (un indicatore del piano di divisione delle cellule), la polarità del polimero MT per quanto riguarda processi quali allungamento delle cellule e la migrazione e tasso di crescita di MT determinata dalla cometa velocità^9,13,15. La limitazione di questi strumenti è che essi non prontamente discriminano tra popolazioni MT stabile e dinamici.

Attingendo alla letteratura biologia cellulare ricca, immunolabeling metodi di immagine stabile e dinamico MTs nell'embrione di zebrafish sono descritti qui, che sono complementari all'uso di linee transgeniche. L'uso molto diffuso di tali metodi immunolabeling in zebrafish è stata un po' ostacolata dalla difficoltà nel preservare l'integrità MT durante la procedura di fissazione. 1 protocollo delinea un metodo ottimizzato per immunolabeling totale, dinamico, e stabile MTs in sezioni trasversali del hindbrain zebrafish in via di sviluppo. Inoltre, un metodo diretto utilizzando commercialmente disponibile software è descritto per quantificare queste popolazioni di MT. MTs stabile si distinguono da MTs dinamico basato su diverse modificazioni post-traduzionali di α-tubulina, quali acetilazione e detyrosination, che si accumulano su MTs stabile nel tempo^16,17. Nell'embrione di zebrafish, acetilazione si verifica su MTs ciliare e axonal ma non su stabile interfase MTs¹⁸, limitando l'utilità di questo indicatore a un sottoinsieme di MTs stabilizzato. Al contrario, detyrosination sembra verificarsi su tutte le MTs stabile nel quartiere di embrione di zebrafish¹⁸. Questa modificazione post-traduzionale espone l'acido glutammico carbossi-terminale di α-tubulina (detyrosinated tubulina)¹⁸ e può essere rilevata utilizzando anti-Glu-tubulina¹⁹. Anche se detyrosination si verifica preferenzialmente su MTs stabile, la prova sperimentale indica che questa modificazione post-traduzionale è un risultato di, piuttosto che una causa di, MT stabilità¹⁶. La popolazione di reciproco MT, composta da MTs dinamico, si distingue usando un anticorpo, anti-Tyr-tubulina, che riconosce specificamente la forma di termine di α-tubulina¹⁹. A seguito di immunolabeling con questi marcatori e imaging confocale, l'analisi quantitativa di MTs (lunghezza, numero e abbondanza relativa) può essere eseguita in regioni definite del tubo neurale in via di sviluppo. Qui vi attende un metodo semplificato per l'esecuzione di questa analisi utilizzando software di elaborazione delle immagini 3D. Questo metodo può essere applicato per rispondere alle domande per quanto riguarda la morfogenesi e l'istituzione o la maturazione delle cellule polarità²⁰. Infatti, l'elaborazione di matrici polarizzate di MTs stabile accompagna molti eventi inerenti allo sviluppo, tra cui fotorecettore morfogenesi²¹, epithelialization delle cellule nello sviluppo del tubo neurale¹⁸ e assone formazione⁸.

Protocollo n. 2 descrive un adattamento in vivo di un'analisi di biologia delle cellule per analizzare MTs durante il loro montaggio fase (nucleazione/anchorage e crescita)^22,23. Nascente MTs sono nucleate presso il centrosoma e successivamente ancorati alla subdistal appendici della madre Centriolo²³. È descritto un metodo per analizzare la nascente ricrescita MT seguendo la depolimerizzazione. Questo protocollo fornisce dettagli sul trattamento nocodazole a depolymerize MTs, la procedura di washout di droga e il periodo di recupero post-trattamento. MT. re-crescita viene monitorata ad intervalli regolariwashout post s da immunolabeling con marcatori per MTs totale (anti β-tubulina) al fianco di marcatori per il centrosoma (anti γ-tubulina) e nucleo (4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)), secondo le procedure generali descritte nel protocollo n. 1. Il passo di depolimerizzazione MT del presente protocollo è essenziale in quanto permette la valutazione della crescita MT de novo piuttosto che estensione di preesistenza MTs. Questa tecnica è quindi distinta da altre procedure pubblicate per misurare i tassi di crescita di MT (in assenza di depolimerizzazione) utilizzando un marcatore con punta plus come fine proteina 3 fusa alla proteina fluorescente verde (EB3-GFP), come mostrato in Tran et al., 2012¹¹. Inoltre, questo test è particolarmente utile per l'analisi di embrioni difettosi in de novo MT assieme, come ad esempio i mutanti NEDD1 precedentemente segnalati in cui il reclutamento di γ-tubulina per il centrosoma è alterato, conseguente incompleta formazione del tubo neurale e difetti di un neurone²⁴.

Protocollo

Dichiarazione etica: le procedure descritte di seguito Segui l'Università delle linee guida di cura degli animali di Maryland Baltimore County.

1. analisi di stabile e dinamico MTs utilizzando Immunolabeling (protocollo 1)

1. dechorionation manuale degli embrioni prima della fissazione
   1. ottenere appena generato embrioni versando l'acqua in eccesso di sistema e quindi raccogliere embrioni rimanenti in una capsula di Petri di plastica (vedere Tabella materiali).
   2. Rimuovi eventuali detriti dagli embrioni di acqua e il trasferimento del sistema ad un nuovo piatto riempito con il mezzo di embrione (vedere Tabella materiali) per garantire che gli embrioni si sviluppano in un ambiente pulito.
   3. Consentire gli embrioni a sviluppare fino alla lavorazione in un incubatore termostatato a 28,5 ° C.
   4. Embrioni posto meno di 24h post-fertilizzazione (hpf) in un piatto di vetro prima di dechorionation.
      Nota: Embrioni di Dechorionate prima della fissazione per massimizzare la penetrazione rapida dell'integrità MT fissativo e riserva. Utilizzo medio di embrione invece dell'acqua del sistema di fornire le ulteriori Ca ^{2 +} richiesto durante dechorionation.
   5. Rimuovere manualmente il chorions da embrioni mentre nella capsula di Petri, utilizzando una pinzetta sotto un microscopio per dissezione.
      1. Una piccola zona nel corion rotonda, trasparente che circonda l'embrione con un paio di pinze e delicatamente tirare forcipe a pezzi per creare una rottura della membrana di pizzicare.
      2. Ingrandire l'apertura facendo leva delicatamente il chorion rotto usando il forcipe. Fare attenzione a non toccare l'embrione con il forcipe, come potrebbe rompere.
2. Fissazione degli embrioni in fasi
   1. trasferimento in scena, dechorionated embrioni per provette per centrifuga da 1,5 mL. Rimuovere quanto più medio di embrione possibili utilizzando un pipetta Pasteur di vetro.
      Nota: Eseguire trattamenti di fissazione e droga sugli embrioni di giovani (metà-somitogenesis), prima della formazione dei centri neurali che mediano la sensazione di dolore, che non richiedono alcuna procedura di additonal per alleviare il dolore durante l'eutanasia. Fasi di sviluppo sono definite a Kimmel et al., 1995 ²⁵. Le fasi di somite 4-5 e 11-12 sono state utilizzate per ottenere immagini di figure 2 e 3.
   2. Preparare 4% paraformaldeide (PFA) /MT Assemblea fissativo buffer (MAB) (vedere Tabella materiali) combinando 1 mL 8% PFA / 1 mL 2 X MAB e aggiungendo 2 µ l 100% Triton X-100 per 1 mL di volume totale.
      Attenzione: Indossare guanti durante la manipolazione di soluzioni contenenti PFA e Triton X-100, che sono irritanti per la pelle.
   3. Fix embrioni in 1 mL 4% PFA/MAB di fissativo per 5 min a 28,5 ° C. aspirato il fissativo con una pipetta, sostituirlo con 1 mL di fissativo fresco e incubare per 3 ore a temperatura ambiente (TA) su un agitatore meccanico.
      Nota: Campioni devono essere risolto rapidamente alla loro temperatura biologica (28,5 ° C per zebrafish) per prevenire la depolimerizzazione di temperatura-dipendente MT.
3. Aspirare fissativo e aggiungere 1 mL 1 x soluzione fisiologica tamponata con NP40 buffer (TBS-NP40). Agitare delicatamente a RT su un rocker tre volte per 5 minuti ciascuno. Conservare gli embrioni a 4 ° C in 1 mL 1 fresco X TBS-NP40 per non più di 7 giorni.
   Attenzione: Indossare guanti durante la manipolazione di soluzioni contenenti NP-40, irritante per la pelle.
Agarosio
4. embrioni di sezionamento per immunolabeling
   1. calore RT 4% basso punto di fusione (LMP) mezzo di inclusione in un contenitore chiuso fino a quando la soluzione diventa chiara utilizzando una piastra calda impostata a 50 ° C, posizionato nei pressi di un microscopio per dissezione . Tenere il contenitore chiuso tra campioni e riscaldata tutto il processo di incorporamento (passi 1.4.4-1.4.6).
   2. Trasferire gli embrioni da 1,5 mL provette per una capsula di Petri con una pipetta di vetro da centrifuga e riempirlo con 1 X TBS-NP40.
   3. Rimuovere le cellule di grande tuorlo da embrioni in fase somitogenesis (4-5 e 11-12 somiti) di Petri utilizzando una pinzetta sotto l'ingrandimento di un microscopio per dissezione ²⁶. Tenere l'embrione per il germoglio di coda con un paio di pinze e staccarsi le cellule di tuorlo con l'altra coppia al fine di preservare il tessuto del hindbrain. Trasferire gli embrioni de-massicce ad un'area di Petri senza residui di tuorlo.
      Nota: Incorporare embrioni nello stampo pieno di agarosio singolarmente per evitare il rapido indurimento di agarosio LMP.
   4. Riempimento un 12 x 5 mm x 3 mm ben dello stampo sezionamento con 200 µ l fuso LMP agarosio utilizzando una micropipetta. Eseguire la procedura 1.4.5.-1.4.6. rapidamente (entro 20 s di riempimento dello stampo) per incorporare l'embrione prima l'agarosio LMP si raffredda a RT e solidifica.
   5. Utilizzare una pinzetta per trasferire un embrione de-massicce dalla tailbud dalla capsula di Petri per la muffa dell'agarosi-riempita verso la sua fine conico sotto un microscopio per dissezione.
   6. Il forcipe fine uso per orientare l'embrione nello stampo, tale che il vibratome taglia dentro il piano desiderato. Creare sezioni trasversali orientando l'embrione, tale che il tessuto del hindbrain corre parallelo alla lunghezza dello stampo con la sua superficie dorsale rivolta verso il bordo e la sua superficie anteriore rivolto verso l'estremità affusolata regione. Ripetere i passaggi 1.4.4-1.4.6 per i rimanenti embrioni.
   7. Consenti l'incorporamento dell'agarosi per solidificare per 5 min a RT.
   8. Generare 40 µm sezioni dell'asse più alto di agarosio incorporato embrioni (misure 1.4.1-1.4.7) usando un vibratomo con il taglio piatto riempito con 1 x TBS-NP40. Trasferimento sezioni di interesse a una piastra a 24 pozzetti in 500 µ l 1 x TBS-NP40 utilizzando una pinzetta. Inserire le sezioni di un solo embrione per pozzetto.
      Nota: Fare riferimento per fare riferimento a ¹⁸ per maggiori dettagli. Assicurare che le sezioni restano idratate a tutte le volte in almeno 250 µ l di tampone e roccia a bassa velocità (10-25 rpm) per i passaggi rimanenti per impedire la separazione dall'incorporamento di agarosio. Detergenti presentano in blocco e soluzioni di lavaggio dovrebbero ridurre la tensione superficiale del liquido di coltura e consentire sommersione delle sezioni. Controllare che le sezioni restano nei pozzetti durante e dopo tutte le manipolazioni. Usare cautela per evitare che accidentalmente scartando sezioni durante lavaggi.
5. Rimuovere il buffer e aggiungere 500 µ l di soluzione bloccante. Roccia per almeno 1 h a RT.
   Nota: Utilizzare una soluzione di blocco che contiene siero di 5% da specie ospiti di ogni anticorpo secondario da utilizzare (vedere Tabella materiali).
6. Incubare in anticorpi primari di 300 µ l diluiti in tampone bloccante per 36-72 h a 4 ° C su un agitatore meccanico. Lavare due volte a 600 µ l 1 x TBS-NP40 su un rocker per 30 minuti ciascuno, a TA.
   Nota: Sezioni doppio-etichetta incubando in anticorpi primari contro totale MTs (anti β-tubulina, o anti α-tubulina) e stabile MTs (anti-Glu-tubulina) o dinamici MTs (tubulina anti-Tyr). Selezionare gli anticorpi primari che sono stati sollevati in specie differenti ospite quando doppia etichettatura per totale e traduzionalmente modificati popolazioni di α-tubulina. Fare riferimento alla Tabella materiali per diluizioni di anticorpo.
7. Incubare a 300 µ l di anticorpi secondari coniugati fluoroforo diluito in tampone bloccante su un rocker per 16-24 h, a 4 ° C al buio. Lavare due volte a 600 µ l 1 x TBS-NP40 su un rocker per 30 minuti ciascuno, a TA.
   Nota: Avvolgere il piatto multi-pozzetto contenente anticorpo secondario in un foglio da questo punto in poi e dopo ogni manipolazione per evitare l'estinzione. Selezionare anticorpi secondari che reagiscono con l'immunoglobulina di host dell'anticorpo primario. Scegliere fluorofori anticorpo secondario che hanno separati, non sovrapposte spettri di emissione. Fare riferimento alla Tabella materiali per diluizioni di anticorpo.
8. Incubare gli embrioni in 500 µ l di soluzione DAPI su un rocker per 30 min, a RT. Wash tre volte in TBS-NP40 dondolo a temperatura ambiente per 5 minuti ciascuno.
   Nota: Etichettatura nucleare fornisce contesto cellulare per la quantificazione di MT eseguita nel passaggio 1.12.
9. Porre una goccia di mezzo di montaggio con agente anti-dissolvenza al centro di una diapositiva privo di polvere. Utilizzare una pinzetta per trasferire sezioni la gocciolina medio di montaggio. Porre un coprivetrino privo di polvere sopra il campione. Archiviare le diapositive in un luogo asciutto, buio e fresco, avvolto in carta stagnola, finché non viene eseguita la formazione immagine.
   Nota: Girando le sezioni sul retro della diapositiva utilizzando un pennarello indelebile punta fine prima di formazione immagine vi aiuterà a identificare le sezioni quando si utilizza il microscopio.
10. Imaging confocale
    1. sezioni di supporto su un laser invertito microscopio confocale a scansione apponendo il vetrino sul palco con il coprioggetto rivolto verso l'obiettivo. Determinare l'ottica appropriata (obiettivo, il laser e le impostazioni di canale come guadagno e offset) su un vetrino di controllo e tenerli coerente tra campioni ²⁷. Evitare oversaturating i pixel per evitare perdite di dati.
    2. Cattura immagini confocal Z-stack utilizzando impostazioni di canale per l'anticorpo secondario selezionato fluorofori e salvare il file di immagine ²⁷. Acquisire Z-stack per ogni sezione.
       Nota: Replicare i parametri utilizzati per acquisire le immagini nelle figure 2 e 3 utilizzando le seguenti impostazioni di acquisizione: modalità = XYZ; ingrandimento dell'obiettivo = 63 X obiettivo d'immersione in olio; apertura numerica dell'obiettivo = 1.4; Z-passo = 0,1 µm; Profondità Z = 16,23 µm. utilizzare le seguenti impostazioni di canale: eccitazione DAPI con 20% UV-gamma laser, intervallo di filtro di emissione = 430-480 nm, fotomoltiplicatore (PMT) guadagno = 525 V e PMT offset =-1.72%; 448 nm fluoroforo (vedere Tabella materiali) eccitazione con 20% laser a 488 nm, intervallo di filtro di emissione = 493-573 nm, guadagno PMT = 689 V e PMT offset = -0,2%; eccitazione di fluoroforo 594 nm con 32% 594 nm del laser, intervallo di filtro di emissione = 608-706 nm, guadagno PMT = 768 V e PMT offset = -6,8%.
    3. Salvare file di dati raw con nomi di file univoci, descrittivo e creare una copia per la modifica nel software di analisi di immagine.
11. Compilation di Z-stack per la visualizzazione di massime proiezioni
    1. aprire la copia del file di dati utilizzando software di analisi immagine 3-d di pubblico dominio (ad es., ImageJ). Verificare che ogni canale viene visualizzato come una sequenza di immagini singole (Z-stack).
    2. Dividere canali dell'immagine utilizzando la seguente sequenza di menu: “ canali di immagini/colore/Split ”.
    3. Creare un'immagine unita sovrapponendo i canali di interesse utilizzando la seguente sequenza di menu: " canali di immagini/colore/Merge. " selezionare il 594 nm, 488 nm e canali DAPI per essere falso colore rosso, verde e blu, rispettivamente. Verifica " composito crea " e selezionare " OK " ²⁸.
       Nota: Il canale DAPI per meglio convogliare dettaglio specifico per MTs in una proiezione massima come in Figura 2 e 3, a solo selezionando falsi colori per gli altri due canali di omettere.
    4. Esaminare lo stack di Z Unito e prendere nota di inizio e fine posizioni di Z-piani migliori interiori per tutti i canali visibili. Allontanare i Z-piani esterni che in genere hanno segnale non ottimale a causa di superfici irregolari della sezione. Fare riferimento per fare riferimento a ²⁹ per maggiori info.
    5. Visualizzare lo Z-stack Unite come un'unica immagine 2D eseguendo una proiezione di massima intensità dello Z-stack utilizzando la seguente sequenza di menu analisi immagine 3-d: " immagini/pila/Z-progetto. " inserire posizioni dei migliori interiore l'iniziale e finale Z-aerei dal passaggio 1.11.3 come il " inizio fetta " e " Stop fetta, " rispettivamente. Selezionare " intensità Max " come il tipo di proiezione e fare clic su " OK ". Fare riferimento per fare riferimento a ²⁸ per maggiori dettagli.
12. MT analisi etichettatura
    1. aprire il software di analisi di immagine 3D commerciale. Selezionare " Crea libreria " e fornire un nome descrittivo per la libreria di immagini. Fare clic su " crea. " trascinare file immagine raw generati dal microscopio confocale nella libreria. File di dimensioni maggiori richiedono più tempo per trasferire.
    2. Selezionare un file da analizzare. Scegliere " messa a fuoco estesa " dalla " vista " menu per visualizzare l'immagine canale-fuse nella finestra principale.
    3. Regolare la soglia trascinando lo strumento slider per ogni canale verso sinistra o verso destra fino a quando il segnale di fondo è ridotto e il vero segnale è robusto. Osservare che ogni canale mostra un vero segnale per la molecola etichettato (ad es., canale DAPI che mostrano nuclei oblunghi o mitotici ma non auto-fluorescenza dal citoplasma o agarosio).
    4. Seleziona il " Freehand regione di interesse (ROI) " tool e delineare la regione di interesse per essere analizzati. Selezionare il " azioni " scheda seguita da " Ritaglia immagine " per ritagliare l'immagine. Salvare il file di immagine ritagliata con un nuovo nome. Fare clic sul " misure " scheda per creare il protocollo per il filtraggio di oggetti specifici rilevanti per l'analisi 3D.
    5. Drag " trovare oggetti " alla finestra del protocollo. Rinominare il primo protocollo " DAPI. " selezionare il canale DAPI nel menu a discesa. Trascinare le seguenti impostazioni per il protocollo DAPI e metterli sotto " trovare oggetti " nell'ordine seguente (tabella 1): " riempire buchi in ObjectsŔ " Separata toccare ObjectsŔ " Escludere gli oggetti da SizeŔ " Escludere non toccare ROIs ".
       Nota: L'obiettivo delle impostazioni nella tabella 1 sono innanzitutto impostare una soglia che rigetti segnali cui distribuzione e dimensione non sono coerenti con le dimensioni degli oggetti analizzati. Ad esempio, eliminare un segnale non abbastanza grande da essere un nucleo quando si contano i nuclei.
    6. Eseguire la sequenza (passo 1.12.9) per assemblare il restante filtri per β-tubulina e altri marcatori utilizzando le impostazioni nella tabella 1.
    7. Selezionare " misura " nella parte inferiore di ogni protocollo. Scegliere " intensità e Volume misura " e " lunghezza scheletrica " per tutte le tubuline etichettatura, ma soltanto il primo per il segnale DAPI.
    8. Disegnare un ROI intorno alla regione da misurare. Osservare le misure sotto il " Riassunto " scheda dopo il software elabora la regione. Copiare i dati e salvarli in un foglio di calcolo realizzabile, come illustrato nella tabella 2. Creare una copia di backup del foglio di calcolo per analisi successive.
    9. Selezionare misure di interesse (ad esempio, la lunghezza del fascio di MT, numero di fasci di MT/nucleo, come rivelato con diversi marcatori) nel foglio di calcolo e analizzare per determinare i valori medi per ogni gruppo.
       Nota: La media MT Lunghezza pacco = somma del ' significa lunghezza scheletrica per β-tubulina ' per ciascun embrione diviso per il numero totale di embrioni. Fare riferimento alla riga 20 della tabella 2. Formattare il foglio di calcolo, in modo che le variabili e gruppi sperimentali sono facilmente graphed.

2. De Novo MT Assembly Assay (protocollo n. 2)

1. test multi-flusso-attraverso apparato ( Figura 1) 2 giorni prima dell'esperimento e costrutto.
   Nota: L'apparecchio consente di interruzione simultanea di più gruppi sperimentali dopo il trattamento di nocodazole utilizzando forniture da Tabella materiali. Sigillante siliconico richiede almeno 24 ore di tempo di asciugatura prima di esso non pone alcun rischio di tossicità per gli embrioni.
   1. Dividere un tubo di centrifuga da 50 mL a metà nel senso della lunghezza, utilizzando un jig o sega.
   2. Semicerchi cut 7, con un raggio di 3 cm, fuori 70 µm in nylon mesh e ritagliarli per adattare strettamente in una metà della spaccatura Centrifugare la provetta. Incollare i semicerchi nella provetta da centrifuga parallela per le marcature di gradazione 10 mL utilizzando sigillante silicone acquario-cassetta di sicurezza. Consentire al dispositivo di asciugare per 2 giorni e risciacquare immergendo in un bicchiere d'acqua per 2-3 h.
   3. Linea estremità superiore (filettati) del tubo taglio centrifuga con argilla di modellistica, tale che l'altezza del liquido conservato nel dispositivo di scorrimento ha una profondità di ¼ di pollice ( Figura 1, viste 2 e 3).
   4. Preparare l'apparato di sbiaditura rimuovendo lo stantuffo da una siringa da 50 mL e inserendo 12 pollici del tubo bene nella punta. Spingere il tubo quanto andrà e guarnizione attorno al giunto mediante modellazione argilla.
   5. Pre-bagnato la mesh usando embrione mezzo per permettere al liquido di scorrere attraverso l'intero flusso-attraverso il dispositivo. Angolo del dispositivo sul ghiaccio così quel liquido piscine in tutti i compartimenti, ma ancora si svuota la parte anteriore dove si trova il cerchio di argilla. Utilizzando un supporto da anello, sospendere l'apparato di sbiaditura sopra il dispositivo di scorrimento su ghiaccio ( Figura 1).
   6. Chill 200 mL di mezzo di embrione sul ghiaccio e versare abbastanza nell'apparato di interruzione per garantire che tutte le bolle d'aria vengono cancellate e che la portata è di circa 7 mL/min. regolare la portata modificando l'altezza della siringa.
2. Enzimaticamente gli embrioni dechorionate
   1. fare una soluzione di lavoro di non-specifiche proteasi diluendo 1 mL di 10 mg/mL non specifiche proteasi magazzino in 20 mL di terreno di embrione.
   2. Eseguire dechorionation chimici sugli embrioni 1 h prima del timepoint quando si prevede di raggiungere lo stadio di sviluppo desiderato. Chorions digest rimuovendo medio di embrione da 100mm di Petri contenente in scena gli embrioni e l'aggiunta di 20 mL di soluzione di lavoro di proteasi aspecifiche.
   3. Embrioni di incubare a 37 ° C per 5 min.
      Nota: Non superare i 5 min o utilizzare una maggiore concentrazione di soluzione non specifiche proteasi, come questo si tradurrà in embrioni che cade a pezzi una volta trattato con nocodazole.
   4. Rapidamente Pipettare fuori della proteasi aspecifiche e riempire piatti con circa 25 mL di liquido di embrione. Ripetere un' volta.
   5. Utilizzando una pipetta di vetro da 1 mL, trasferire gli embrioni più giovane di 24 hpf al vetro piatti per proteggerli da eventuali danni.
   6. Completa dechorionation rimuovendo manualmente utilizzando una coppia di una pinzetta, chorions, come descritto al punto 1.1.5.
   7. Posto vetro piastre Petri contenenti embrioni di dechorionated in un'incubatrice di 28,5 ° C per un minimo di 30 min fino a raggiungere lo stadio di sviluppo desiderato.
3. Depolymerize il MTs esistente
   1. preparare una soluzione di lavoro di 5 µ g/mL nocodazole unendo 50 µ l 1 mg/mL stock nocodazole con 10 mL di terreno di ghiaccio freddo embrione.
      Attenzione: Utilizzare guanti durante la manipolazione nocodazole, irritante per la pelle.
   2. Scambiare il mezzo di embrione del gruppo di trattamento nocodazole con 10 mL di soluzione di lavoro freddo nocodazole. Posto di Petri sul ghiaccio per un tempo adeguato per lo stadio di sviluppo (ad esempio, 1 h per embrioni somite 4-5). Mettere da parte gli embrioni di controllo non trattato in una capsula di Petri sul ghiaccio per essere fissato al fianco di campioni di colori attenuati nel passaggio 2.3.4.1.
   3. Trasferimento embrioni usando una pipetta di vetro lucido 1 mL di fuoco per l'apparato di flusso continuo, con compartimenti separati per ogni gruppo sperimentale. Avviare la sbiaditura di nocodazole per mezzo di embrione freddo ghiaccio versando nella parte superiore della siringa 50ml.
      Nota: Utilizzare almeno 30 embrioni per ogni gruppo sperimentale. Gruppi sperimentali potrebbero essere costituita da embrioni di controllo o una varietà di morpholino o embrioni iniettati di RNA. La sbiaditura richiederà un totale di circa 150 mL di mezzo di embrione da aggiungere ogni 8-10 minuti di interruzione il nocodazole pur continuando a inibire la crescita di MT con ghiaccio. Mantenere gli embrioni su ghiaccio è essenziale per il successo di questo test perché MTs sono instabili a freddo e freddo ritarda lo sviluppo di embrioni in anticipo.
   4. Consentire MTs a ricrescere dopo 20 min di washout a RT con il trasferimento di embrioni di vetro Petri contenente caldo medio di embrione (28,5 ° C) utilizzando una pipetta di vetro lucido 1ml di fuoco. Non appena gli embrioni vengono trasferiti, avviare un timer.
      1. Difficoltà gli embrioni di controllo e di interruzione a 1 min, 5 min e 10 min pipettando circa 10 embrioni in un 1,5 mL Centrifuga tubo riempito con correzione di 1 mL 4% PFA/MAB (28,5 ° C) e seguendo le indicazioni in passo 1.2.3.
4. Preparare campioni per immunolabeling come descritto nelle sezioni 1.3-1.5.
5. Marcatura galleggiante sezioni ed embrioni di immagine come descritto nelle sezioni 1.6-1.10 con le seguenti modifiche alle specifiche di anticorpo primario: uso 1: 500 coniglio anti-γ-tubulina e 1: 200 del mouse anti-β-tubulina.
6. Processo e analizzare immagini utilizzando software di analisi di immagine 3D, come descritto al punto 1.12.

Risultati

Analisi di MTs stabile e dinamico utilizzando immunolabeling
Nel protocollo n. 1, la distribuzione delle sub-popolazioni MT durante prima (chiglia neurale) e fine (neurali asta) fasi di sviluppo del tubo neurale sono rivelate, utilizzando Glu-tubulina e Tyr-tubulina come marcatori per MTs stabile e dinamico, rispettivamente. MTs dinamico predominano in del hindbrain nella fase di chiglia neurale (4-5 somiti) (Figura 2

Discussione

Attualmente ci sono molti metodi per imaging dinamiche MT nello sviluppo iniziale di zebrafish, che vanno da formazione immagine diretta di molecole con tag a immunolabeling di fisso tessuto^11,12,13,14. Anche se MTs in una singola cella può esistere in stati stabili o dinamici, epithelialization è un processo in cui MTs sono progressivamente stabilizzate nel corso del tempo. Usando gli indica...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose			Used to treat petridishes.   Prepare 1% agarose by heating a solution of  1 gram agarose per 100 ml 1X embryo medium in a microwave until polymerized.
Kpipes	Sigma	P7643
NaCl	Sigma	S7653
Tris-HCl	Sigma	T3253-500G
KCl	Sigma	P9333-500G
CaCl2·2H2O	Sigma	C5080
NP-40	American Bioanalyticals	AB01424
EGTA	Sigma	E3889-25G
MgCl2	Sigma	M2670-500G
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher	BP1605
Triton-x	American Bioanalyticals	AB02025
Anti-Fade mounting medium	Invitrogen	P10144
Mouse anti-β-tubulin	Developmental studies Hybridoma Bank	E7	1/200
Rabbit anti-γ-tubulin	Genetex	GTX113286	1/500
Rabbit anti-α-tubulin	Genetex	GTX108784	1/1000*
Rabbit anti-detyrosinated-tubulin	Millipore	AB3201	1/200-1/1000*  Titrate antibody with first use of new lot.
Rabbit anti-tyrosinated-tubulin	Millipore	ABT171	1/500
Mouse anti-centrin	Millipore	04-1624	1/1000
Goat 488 anti-rabbit	Thermofisher	A11008	1/500
Goat 594 anti-rabbit	Thermofisher	A11012	1/500
Goat 594 anti-mouse	Thermofisher	A11005	1/500
Goat 488 anti-mouse	Thermofisher	A11001	1/500
Vibratome	Vibratome	1500
Forceps	World Precision Instruments	555227F
100 mm petri dish	Cell treat	229693
35 mm petri dish	Cell treat	229638
50 ml falcon tube	Fisher	14-432-22
Woven nylon mesh 70 um	Amazon.com	B0043D1SZG
Micropipette	Gilson	F123602
Glass pipette	Fisher	NC-999363-9
Aquarium sealant	Amazon.com, by MarineLand	Silicone Sealer 1 oz (Tube)
Ring stand	Fisher	14-675BO
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID	Cole-Parmer	WU-06417-21
Modeling clay	Amazon.com	Sargent Art 22-4000	Any wax or oil based non-toxic modeling clay will suffice
Clamp	Fisher	02-215-466
60ml syringe	Fisher	14-820-11
Embryo medium (E3)			34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O To prepare a 60X stock, dissolve the ingredients in H2O, to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 with NaOH. Autoclave. To prepare 1X medium, dilute 16.5 mL of the 60X stock to 1 L.
Blocking Solution			50 ml TBS-NP-40 2.5 ml normal goat serum 1 g BSA 625 µl Triton-X
TBS-NP-40 (pH 7.6)			155 mM NaCl 10 mM Tris HCl 0.1% NP-40
2x MAB (pH6.4)			160 mM KPIPES 10 mM EGTA 2 mM MgCl2
Commercial 3-D Image processing Software	PerkinElmer	Volocity (V 6.2)
Dry block heater	VWR	12621-108	Used as a hot plate to melt agarose in Protocol 1.
Dissecting Microscope	Leica	MZ12
Confocal Microscope	Leica	SP5
Flat embedding mold	emsdiasum.com	BEEM 70904-01
Public domain image processing software	NIH	ImageJ (V 1.5)
* Success varies by lot number