Visualizzazione del modello di proiezione Axonal dei motoni embrionali in<em&gt; Drosophila</em

Riepilogo

Questo lavoro descrive un metodo immunohistochemistico standard per visualizzare le proiezioni dei neuroni motori degli embrioni di Drosophila melanogaster a tarda fase 16. La preparazione filettata di embrioni fissi macchiati con FasII anticorpo fornisce un potente strumento per caratterizzare i geni richiesti per la ricerca del percorso dell'assone motore e il riconoscimento del bersaglio durante lo sviluppo neurale.

Abstract

La creazione di circuiti neuromuscolari funzionali si basa su precisi collegamenti tra assoni motori in sviluppo e muscoli target. I neuroni motori estendono i coni di crescita per navigare lungo percorsi specifici rispondendo a un gran numero di segnali di guida dell'assone che emanano dall'ambiente extracellulare circostante. Il riconoscimento del bersaglio di cono di crescita inoltre svolge un ruolo fondamentale nella specificità neuromuscolare. Questo lavoro presenta un protocollo immunohistochemistico standard per visualizzare le proiezioni dei neuroni motori degli embrioni di Drosophila melanogaster a tarda fase 16. Questo protocollo comprende alcuni passaggi chiave, tra cui una procedura di genotipizzazione, per ordinare gli embrioni mutanti desiderati; Una procedura di immunostaining, per etichettare gli embrioni con l'anticorpo fasciclin II (FasII); E una procedura di dissezione, per generare preparazioni filettate da embrioni fissi. Le proiezioni dell'assone motorio e le forme muscolari della periferia sono molto meglio visualizzate in preparazioni piatte di embrioni di filetti che in whOle-mount embrioni. Pertanto, la preparazione filettata di embrioni fissi macchiati con FasII anticorpo fornisce un potente strumento per caratterizzare i geni richiesti per la ricerca del percorso dell'assone motore e il riconoscimento del bersaglio e può anche essere applicato sia a schermi genetici di perdita di funzionalità e di guadagno di funzionalità .

Introduzione

Collegamenti precisi e selettivi tra gli assi del motore e i muscoli target durante lo sviluppo embrionale sono essenziali per la normale locomozione nelle larve Drosophila . Il pattern embrionale di 30 fibre muscolari in ciascuno dei due emisegmenti addominali A2-A7 è stabilito dalla fase 16 ¹ . I 36 neuroni motori generati nel cavo del nervo ventrale estendono gli assoni nella periferia per innervare i muscoli specifici ² . Il percorso dell'assonamento del motore e il riconoscimento del bersaglio possono essere visualizzati mediante immunohistochemistry con un anticorpo (anticorpo monoclonale del mouse 1D4) ^{3 , 4} . Sono disponibili molteplici immagini dei motori di proiezione dell'assone motore in embrioni di tipo selvatico sul web ⁵ . L'anticorpo 1D4 etichetta tutti gli assoni motori e tre fascette longitudinali di assoni su ciascun lato della linea mediana del sistema nervoso centrale embrionale (CNS) ^{4 , 6} ( Figura 1C e Figura 2A ). Pertanto, immunohistochemistry con FasII anticorpo fornisce un potente strumento per identificare i geni necessari per la connivenza neuromuscolare per dimostrare i meccanismi molecolari alla base di guida axon motore e riconoscimento target.

In ciascuno degli emisferi addominali A2-A7, gli assi del motore si disegnano e selettivamente fascicolano in due rami nervose principali, il nervo segmentale (SN) e il nervo intersegmentale (ISN) ^{2 , 4} e un ramo nervoso minore, il nervo trasversale (TN ) ⁷ . La SN defascicola in modo selettivo per dare origine a due rami nervosi denominati SNa e SNC, mentre l'ISN si divide in tre rami nervosi denominati ISN, ISNb e ISNd ^{2 , 4} . Tra questi, ISN, ISNb e SNA motor axonI modelli di proiezione sono mostrati in modo più preciso quando gli embrioni a tarda fase 16 sono macchiati con FasII e sono filettati ( Figura 1C e Figura 2A ). I neuroni motori ISN estendono i loro assoni per innervare i muscoli dorsali 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 e 20 ^{2 , 4} ( Figura 2A ). I neuroni motori ISNb innervano i muscoli ventrolaterali 6, 7, 12, 13, 14, 28 e 30 ^{2 , 4} ( Figura 2A e 2B). Il ramo nervo SNa proietta innervare i muscoli laterali 5, 8, 21, 22, 23 e 24 ^{2 , 4} ( Figura 2A ). Il TN, costituito da due assi motori, proietta ipsilateralmente lungo il bordo segmentale per innervare il muscolo 25 e fa sinapsi con il neurone dendritico bipolare laterale (LBD) nelPeriferia ⁷ ( figura 2A ). Queste innervazioni muscolari del bersaglio richiedono non solo la defasciculazione selettiva di assoni motori a punti specifici di scelta ma anche il riconoscimento muscolare. Inoltre, alcune cellule di guidepost mesodermiche putative che fungono da bersagli intermedi sono state trovate sia nei percorsi ISN che SNa, ma non lungo il percorso ISNb ⁴ . Ciò potrebbe suggerire che l'indirizzamento dell'asse axon del motore ISNb può essere regolato in maniera distinta rispetto alla guida dell'assone motore ISN e SNa e indica anche che la guida per l'asse del motore periferico fornisce un attraente modello sperimentale per studiare i ruoli differenziali o conservati di una singola indicazione di guida Molecola ⁸ .

Questo lavoro presenta un metodo standard per visualizzare gli schemi di proiezione axon dei neuroni motori embrionali in Drosophila . I protocolli descritti includono come disseccare gli embrioni fissi macchiati con 1D4 aE trasformato in 3,3'-diaminobenzidina (DAB) per preparazioni di filetti. Un vantaggio critico delle preparazioni piane di embrioni fissi è la migliore visualizzazione delle proiezioni assonali e dei modelli muscolari nella periferia. Inoltre, questo lavoro mostra anche come genotipare gli embrioni fissi per ordinare gli embrioni mutanti desiderati utilizzando il metodo di colorazione LacZ.

Protocollo

1. Preparazione

1. Preparare 500 ml di soluzione fisiologica tamponata (PBS) con la soluzione di t-Octilfenossipolietossietanolo (PBT) aggiungendo 0,5 g di albumina bovina serum (BSA) e 0,5 ml di t-Octilfenossipolietossietanolo (vedere tabella dei materiali) a 500 ml di 1X PBS E mescolando per almeno 30 minuti. Conservare a 4 ° C. Utilizzare quando è relativamente fresco e conservare la soluzione in una bottiglia pulita.
2. Preparare 10 ml di 4% di paraformaldeide aggiungendo 2,5 ml di soluzione di paraformaldeide di riserva del 16% e 1 ml di 10 volte PBS a 6,5 ​​ml di acqua deionizzata. Conservare a 4 ° C e utilizzare entro una settimana.
   ATTENZIONE: Evitare il contatto con la soluzione di paraformaldeide perché è altamente tossico.
3. Realizzare il substrato X-Gal (10% in peso di X-Gal in dimetilsolfossido (DMSO)) sciogliendo 0,1 g di substrato X-Gal per 1 mL di DMSO. Conservare a -20 ° C in aliquote di 100 μL.
4. Realizzare la soluzione di colorazione X-Gal utilizzando buffer di fosfato 10 mM (pH 7,2), 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 3 mMK ₄ [FeII (CN) ₆ ], 3 mM K3 [FeIII (CN) ₆ ] e 0,3% t-Octilfenossipolietossietanolo. Conservare a 4 ° C al buio.
5. Fai una soluzione di perossido di idrogeno al 3% diluendo 30% di perossido di idrogeno di riserva 1:10 con acqua deionizzata.
6. Creare una soluzione di 3,3'-diaminobenzidina (DAB) completamente dissolvendo 1 compressa (10 mg) di DAB in 35 ml di soluzione PBT fresca. Filtrare attraverso un filtro da 0,2 μm e conservare a -20 ° C in aliquote di 910 μL.
   ATTENZIONE: Smaltire tutti i rifiuti DAB in candeggina per distruggere il DAB.
7. Fare piastre d'uovo con succo di mela. Aggiungete 35 g di agar e 1 L di acqua deionizzata in una fiala da 2 L. Aggiungere 33 g di saccarosio, 2 g di tegosept e 375 ml di succo di mela a una fiala da 1 L. Sciogliere con autoclave per 30 min. Lasciare entrambe le soluzioni a raffreddarsi a circa 60 ° C. Combinate e mescolate bene queste soluzioni mescolando. Versare 11 ml di soluzione combinata per piatto di coltura da 60 mm.
8. Fare la pasta del lievito mescolando yea del panettiereSt in acqua deionizzata (rapporto 1: 0,8) e conservare a 4 ° C.

2. Collezione di embrioni (Day 1)

1. Raccogli le mosche femminili e maschili (meno di 5 giorni) e per 1-2 giorni, mantenerle in una gabbia di plastica con un piatto d'uovo (60 mm x 15 mm) che contiene una piccola quantità di pasta di lievito al centro.
2. Per la raccolta ottimale degli embrioni a tarda fase 16, impostare una gabbia di bottiglia con mosche (> 50) alle circa 5 PM e lasciarle gettare le uova a 25 ° C per 3 ore.
3. Trasferite le mosche in una bottiglia di cibo fresca.
4. Chiudere la piastra di uovo con il coperchio e incubarla a 25 ° C in un incubatore umidificato (~ 70% di umidità) durante la notte.

3. Preparazione degli embrioni per l'immunodoscrizione (giorno 2)

1. Aggiungere 1,8 ml di soluzione PBT alla piastra d'uovo intorno alle 10:20 e utilizzare un tampone di cotone per allentare gli embrioni dalla piastra mentre inclinandolo.
   Nota: mescolando delicatamente la pasta del lievito usando un cottSul tampone, scioglietelo nel caso in cui si trovino un gran numero di embrioni. Iniziare a raccogliere gli embrioni ~ 40 min prima della fissazione (intorno alle 11:00).
2. Trasferire gli embrioni dalla piastra d'uovo in un microprocessore da 1,5 ml utilizzando una punta da 1 ml.
3. Consentire agli embrioni di saldare e aspirare il più possibile la soluzione PBT. Risciacquare gli embrioni due volte con 1 mL di soluzione PBT. Aspirare il più possibile la soluzione PBT.
4. Riempire il tubo con 1 ml di candeggina del 50% (diluito in acqua deionizzata) e decifrare gli embrioni incubandoli su un nutatore per 3 minuti a temperatura ambiente (RT).
   Nota: questo passaggio non uccide gli embrioni esauriti.
5. Consentire agli embrioni esauriti di saldare, aspirare il candeggiante del 50% il più possibile e sciacquare gli embrioni 3 volte con 1 mL di soluzione PBT.
6. Aggiungere 0,5 ml di eptano e successivamente aggiungere 0,5 ml di soluzione paraformaldeide al 4% al tubo a RT intorno alle 11:00.
7. IncubareEmbrioni su un nutatore per 15 minuti a RT.
8. Rimuovere la soluzione 4% di paraformaldeide (lo strato inferiore).
9. Aggiungere 0,5 ml di metanolo al 100% e devitellinare gli embrioni scuotendo il tubo vigorosamente per 30 s.
10. Rimuovere l'eptano ( cioè il livello superiore).
11. Aggiungere 0,5 mL di metanolo al 100% e scuotere il tubo vigorosamente per 10 s.
12. Lasciare che gli embrioni si stabiliscano toccando il tubo e aspirano il metanolo il più possibile. Sciacquare gli embrioni con 1 ml di metanolo al 100%, scuotendo per meno di 10 s.
    Nota: L'esposizione prolungata al metanolo distrugge l'attività di β-Gal.
13. Rimuovere il metanolo e sciacquare gli embrioni devitellinizzati 3 volte con 1 mL di soluzione PBT.

4. Genotipizzazione degli embrioni usando la colorazione LacZ (Day 2)

1. Aggiungere 1 ml di soluzione PBT al tubo e incubare il tubo in un blocco termico a 37 ° C o in bagno d'acqua per 15 min.
2. Durante l'incubazione, posizionare la soluzione di colorazione X-Gal (1 mL per tuEssere a 65 ° C in un bagno d'acqua fino a diventare nuvoloso. Incubare in un bagno d'acqua di 37 ° C.
3. Aspirare la soluzione PBT e aggiungere 1 ml di soluzione di colorazione X-Gal e 20 μl di substrato X-Gal al tubo.
4. Incubare il tubo a 37 ° C con il nodo fino a che non sia evidente un precipitato azzurro.
   Nota: l'intervallo di incubazione per i balanceri blu e secondi in generale varia da 2-4 h.
5. Rimuovere la soluzione di colorazione X-Gal e risciacquare gli embrioni 3 volte con 1 mL di soluzione RT PBT.
6. Utilizzando una sonda o una pinza ad ago, ordinate gli embrioni del genotipo desiderato ( cioè, embrioni bianchi non macchiati) con un microscopio di dissezione di luce (obiettivi 1.6X-2.5X).
   Nota: poiché alcuni balanceri blu, come CyO, actin-LacZ e TM3, actin-LacZ , trasportano un costrutto transgenico che esprime batteri β-Gal (LacZ) sotto il controllo del promotore di actina , gli embrioni colorati blu in modo ubiquo contengonoUna o due copie di cromosomi blu balancer. Pertanto, gli embrioni bianchi non macchiati sono omozigoti per l'allele letale desiderato.

5. Immunostaining di embrioni con Anti-Fasciclin II Antibodies (Day 2-3)

1. Raccogliere e trasferire gli embrioni del genotipo desiderato ( cioè, embrioni bianchi non macchiati) in un microtubo da 0,5 mL usando una punta di pipetta da 1 ml.
   Nota: In questa fase, gli embrioni possono essere approssimativamente pianificati secondo criteri morfologici, inclusi i pattern di segmentazione della cuticola e le strutture della testa e della coda ⁹ . Durante l'involuzione della testa, tra i 10 ei 16 h dopo la posa delle uova, l'embrione subisce una notevole riduzione del segmento anteriore più anziano ⁹ .
2. Lavare gli embrioni una volta con 0,4 ml di soluzione PBT e aggiungere 0,3 ml di soluzione di blocco (5% di capra normale di capra e 5% di DMSO in soluzione PBT).
3. Bloccare gli embrioni con la nutrazione a RT per 15 minuti.
4. Aggiungere 75 μL di anti-Fasciclin II anticorpo e incubare il tubo con la nutrazione a RT durante la notte.
5. Lavare gli embrioni 4 volte con 0.4 mL di soluzione PBT per almeno 20 minuti per lavaggio.
6. Aggiungere 0,3 ml di soluzione di blocco (5% di siero di capra normale in soluzione PBT) contenente anticorpi anti-mouse-HRP di capra (2 μg / mL) e incubare il tubo con la nutrazione a RT per una notte.
7. Lavare gli embrioni 6 volte con 0.4 mL di soluzione PBT per almeno 20 minuti per lavaggio.
8. Aggiungere 0,3 ml di soluzione DAB al tubo.
   ATTENZIONE: Indossare guanti e mettere tutti i rifiuti / tubi / punte DAB in candeggina.
9. Aggiungere 2 μl di 3% di perossido di idrogeno e incubare il tubo al buio con la nutrazione a RT fino a produrre la quantità desiderata di precipitato.
   Nota: Il tempo di incubazione per immunohistochemistry 1D4 in generale varia da 0,5 a 1 h.
10. Lavare gli embrioni 4 volte con 0.4 mL di soluzione PBT.
    ATTENZIONE: Rimuovere la soluzione DAB e le prime due lavaggi con pipetta e diScardarli in candeggina.
11. Aggiungere 0,2 ml di fissaggio al 70% di glicerolo / PBS al tubo e conservare a RT oa 4 ° C.
    Nota: Tenere il tubo lontano dalla luce. Possono essere ottenute preparazioni più chiare posizionando gli embrioni in una soluzione al 90% di glicerolo / PBS ¹⁰ . Tuttavia, è più difficile disseccare gli embrioni eliminati in soluzione al glicerolo / PBS del 90% rispetto a quelli eliminati nella soluzione 70% di glicerolo / PBS ¹⁰ .

6. Stage, dissezione, montaggio e imaging degli embrioni (giorno 4)

1. Per la messa in scena, trasferire gli embrioni equilibrati con il 70% di glicerolo / PBS su una vetrata.
2. Raccogli gli embrioni di fase 16 che hanno nervi addominali 7 (A7), A8 e A9 ISN convergenti a toccarsi e / o avere midgut suddiviso in tre bande.
   Nota: Gli embrioni macchiati con anticorpo 1D4 possono essere eseguiti in base ai modelli di proiezione degli assoni del motore ISN e ISNb. Dopo aver lasciato il CNS, A7, A8 e A9 ISN neI reti degli embrioni a tarda fase 16 convergono a toccarsi e successivamente si divergono per estendersi fino ai muscoli dorsali (la freccia in figura 1A ). Negli embrioni a metà stadio 16, tuttavia, i nervi ISN A7 si estendono in parallelo con i nervi A8 / A9 (staffa quadrata nella Figura 1B ). Inoltre, gli assi di proiezione di A6 ISNb nervi (perpendicolari ai muscoli ventrolaterali) in entrambi i hemisegment sono in linea di massima allineati con l'estremità posteriore delle fascette longitudinali dell'assone longitudinale del CNS (frecce e una linea in figura 1C ). Questi criteri morfologici sono leggermente diversi tra diversi genotipi. In alternativa, gli embrioni possono essere organizzati sulla base della morfologia dell'intestino ^{9 , 11} . Prima della fase 17, il midgut ha una forma simile a cuore, mentre il midgut è suddiviso in tre fasce dalla fase 17 ¹² .
3. Disseccare gli embrioni.
   1. Utilizzando un 1 mL, spostare ogni embrione dalla goccia di glicerolo e posizionare l'embrione ventral-face verso l'alto. Tagliare la parte anteriore a 1/4 della lunghezza del corpo e la regione più posteriore senza assoni motori.
   2. Usando una sonda dell'ago, spostare l'embrione terminato dalla goccia di glicerolo, rotolare per orientarlo con il lato dorsale e posizionarlo orizzontalmente nel campo.
      Nota: quando l'embrione viene spostato dalla goccia di glicerolo, un po 'di glicerolo associato all'embrione lo rende appiccicoso.
   3. Tagliare l'embrione lungo la linea mediana dorsale usando un singolo ago tungsteno molto fine ¹³ . Fare un piccolo taglio alla parte posteriore dell'embrione e poi continuare a tagliare la linea mediana dorsale verso l'anteriore; Taglio nella direzione opposta è anche bene.
   4. Usando una sonda di ago, spostare l'embrione tagliato a metà linea nella goccia di glicerolo, posizionarlo con il lato dorsale verso l'alto e staccare l'intestino dalla parete del corpo espellendo ogni parete del corpo in direzione ventrolaterale (diagonale) (2Obiettivo .5X).
      Nota: Assicurarsi che la linea mediana dorsale sia completamente tagliata, con conseguente completa separazione tra le pareti del corpo sinistro e destro.
   5. Spostare con cautela l'embrione tagliato a metà linea dalla gocce di glicerolo e quindi posare due appendici della parete del corpo sullo scivolo in vetro utilizzando una sonda fine dell'ago (obiettivo 2.5X).
   6. Utilizzando un ago di tungsteno molto fine, rimuovete gli organi interni dall'embrione sezionato spingendoli lateralmente (obiettivo 5X).
      Nota: Una descrizione più dettagliata di un'altra procedura di dissezione simile può essere trovata sul sito web ⁵ .
4. Per il montaggio, aggiungere 2-3 μL di 70% di glicerolo / PBS per embrioni puliti e sezionati e, utilizzando una sonda fine ago, trasferirli in una nuova vetrata su cui è stata diffusa 8 μL di 70% di glicerolo / soluzione PBS Il centro (obiettivo 2.5X).
5. Mettere una copertura (18 mm x 18 mm). Sigillare i bordi della copertura con un rasoio regolareChiaro o colorato va bene).
6. Cattura immagini con obiettivi ad alta risoluzione (20X, 40X e 63X) con un microscopio leggero a contrasto di interferenza (DIC), secondo le istruzioni del produttore.
   Nota: Una migliore visualizzazione e caratterizzazione fenotipica, in particolare per gli assoni del motore ISNb, può essere prodotta usando un obiettivo 63X di immersione ad olio.

Risultati

Le connessioni precise tra gli assi del motore e i muscoli del bersaglio durante lo sviluppo neurale dipendono dalla repulsione selettiva dell'assone-axone e dal riconoscimento dei bersagli in punti specifici ⁴ . In Drosophila , la repulsione selettiva tra gli assoni motori è parzialmente regolata dall'azione combinata dei semafori di classe 1 e 2 (Semas), inclusi Sema-1a, Sema-2a e Sema-2b ^{8 ,}

Discussione

I dettagli dei difetti di guida dell'assone motorico sono segnati più velocemente e con maggiore precisione dalla preparazione filettata di embrioni macchiati da DAB che dalla scansione laser di microscopia confocale di etichette fluorescenti. Pertanto, la preparazione filettata di embrioni fissi e 1D4 è più adatta per la caratterizzazione funzionale delle molecole di cue di guida. Quattro grandi classi di indici di orientamento, compresi i netrini, i fessure, i semafori (Semas) e le efrine e i loro recettori cog...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
16% Paraformaldehyde Solution	Ted Pella	18505
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5405
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	30435
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	71500
X-Gal Substrate	US Biological	X1000	X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside)
Dimethyl Sulfxide	Sigma-Aldrich	D4540
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	Sigma-Aldrich	P9387
Potassium hexacyanoferrate(III)	Sigma-Aldrich	244023
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich	216763
3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride	Sigma-Aldrich	D5905
Agar	US Biological	A0930
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3
Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)	Sigma-Aldrich	H5501
Culture Dish (60 mm)	Corning	430166
Tricon Beaker	Simport	B700-100	This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection.
Yeast	Societe Industrielle Lesaffre	Saf Instant Yeast Red
Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100)	VWR	14220-263
Eppendorf Tube (1.5 ml)	Sarstedt	#72.690
Bleach	The Clorox Company	Clorox
Heptane	Sigma-Aldrich	246654
Methanol	J.T. Baker	UN1230
Normal Goat Serum	Life Technologies	16210-064
Anti-FasciculinII Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	1D4 anti-Fasciclin II
Goat Anti-mouse-HRP Antibody	Jackson Immunoresearch	115-006-068	AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Slide Glass	Duran Group	235501403
Coverslip	Duran Group	235503104	18 x 18 mm
1 ml Syringe	Becton Dickinson Medical(s)	301321
Tungsten Needle	Ted Pella	#27-11	Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.)
Nutator (Mini twister)	Korean Science	KO.VS-96TWS	Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)