Vieni nel lato di luce: In Vivo monitoraggio di Pseudomonas aeruginosa Biofilm infezioni nelle ferite croniche in un modello murino Hairless diabetico

Riepilogo

Qui descriviamo un nuovo modello murino diabetico utilizzando topi glabri per il monitoraggio in tempo reale, non invasiva, di infezioni di ferita di biofilm di bioluminescenti Pseudomonas aeruginosa. Questo metodo può essere adattato ad infezione di altre specie di batteri e microrganismi geneticamente modificati, inclusi i biofilm multi-specie, di valutare e testare l'efficacia delle strategie di antibiofilm.

Abstract

La presenza di batteri come strutturato biofilm nelle ferite croniche, soprattutto in pazienti diabetici, è pensata per impedire la guarigione della ferita e la risoluzione. Modelli di ferite croniche del mouse sono stati utilizzati per comprendere le interazioni sottostante tra i microrganismi e l'host. I modelli sviluppati fino ad oggi si basano sull'uso di animali dai capelli e terminale raccolta di tessuto arrotolato per determinazione di batteri vitali. Mentre significativa intuizione è stata acquisita con questi modelli, questa procedura sperimentale richiede un gran numero di animali e il campionamento è che richiede tempo. Abbiamo sviluppato un nuovo modello murino che incorpora diverse innovazioni ottimale per valutare la progressione di biofilm nelle ferite croniche: un) utilizza i topi glabri, eliminando la necessità di rimozione dei capelli; b) riferisce biofilm preformato le ferite consentendo l'immediata valutazione della persistenza e l'effetto di queste comunità su host; c) controlla la progressione di biofilm quantificando la produzione di luce da un ceppo geneticamente bioluminescente di Pseudomonas aeruginosa, che permette di monitorare in tempo reale l'infezione riducendo così il numero di animali necessari per studio. In questo modello, una singola ferita piena profondità è prodotta sul retro dei topi glabri diabetici indotto STZ e inoculata con biofilm del ceppo bioluminescente p. aeruginosa 41 Xen. Emissione luminosa dalle ferite è registrato giornalmente in un in vivo imaging sistema, consentendo la visualizzazione rapida di biofilm in vivo e in situ e localizzazione di biofilm batteri all'interno le ferite. Questo nuovo metodo è flessibile in quanto esso può essere usato per studiare altri microrganismi, tra cui specie geneticamente e multispecie biofilm e può essere di particolare valore in test strategie anti-biofilm compreso antimicrobiche medicazioni occlusive.

Introduzione

I biofilm sono comunità complesse di microrganismi incorporati in una matrice di sostanze polimeriche che sono stati evidenziati come un fattore di contributo per la scarsa risoluzione di ferite croniche¹. Lo studio di queste popolazioni microbiche altamente organizzate, persistente è particolarmente importante per i pazienti diabetici dove cattiva circolazione sugli arti e alterati meccanismi sensoriali periferici portare a lesioni inosservato². Negli Stati Uniti, si stima che il 15% dei pazienti diabetici svilupperà almeno una ulcera nel corso della loro vita. Questo si traduce in un dispendio economico di circa 28 miliardi dollari nel trattamento^3,4, per non parlare l'incommensurabile onere emotivo e sociale. Comprensione dei fattori che consentono le comunità microbiche a persistere nel letto della ferita e l'impatto che questi biofilm avere negli eventi guarigione è imperativa di guidare la migliore cura per pazienti affetti e spingere lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici. Di conseguenza, la creazione di modelli riproducibili e traducibili in vivo per esplorare le interazioni batteriche-ospite è di primaria importanza.

Modelli murini sono stati sviluppati con successo per studiare l'impatto di biofilm nelle ferite croniche. Questi modelli, tuttavia, spesso utilizzano specie dai capelli e valutare biofilm liquidazione mediante conta su piastra per cellule vitali batteriche del tessuto asportato da animali sacrificati, che li rende lungo e costoso.

Un'alternativa Biofotonico per il campionamento di punto finale degli animali nella valutazione infezione fu proposta da Contag et al. (1995) ^{5 ,} che ha sviluppato un metodo per catturare luminescenza da costitutivamente bioluminescenti Salmonella typhimurium per misurare l'efficacia del trattamento antibiotico. Altri studi approfittando dei batteri che emettono bioluminescenza seguita. Ad esempio, Rochetta et al. (2001) un modello di infezione per studiare le infezioni di coscia di Escherichia coli in topi misurando luminescenza utilizzando un'intensificata charge coupled device convalidato ⁶ e versioni successive, Kadurugamuwa et al. (2003) ⁷ ha approfittato del fotone emissione di proprietà di un derivati dal ceppo di Staphylococcus aureus per studiare l'efficacia di diversi antibiotici in un modello di ferita del catetere in topi.

Il metodo caratterizzato qui presenta un semplice protocollo per indurre il diabete in topi glabri, produrre e inoculare le ferite con biofilm preformati bioluminescente di p. aeruginosa e condurre Biofotonico monitoraggio dell'infezione utilizzando un in vivo imaging system. Esso offre una diretta, veloce, in situ, un processo non invasivo e quantitativo per valutare i biofilm nelle ferite croniche e permette inoltre, per ulteriori analisi come formazione immagine microscopica della guarigione ferite, intermittente del sangue per misurazioni di citochina e raccolta di tessuto terminale per istologia.

Protocollo

esperimenti sugli animali sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato della Michigan State University.

1. preparazione di medicazioni Occlusive e distanziali in Silicone

1. tagliare la medicazione occlusiva trasparente per rendere piazze circa 1 cm x 1 cm con le forbici.
2. Taglio 10 mm cerchi su un foglio di silicone spessa 0,5 mm utilizzando un 10mm biopsia punch. Center una biopsia di 5 mm pugno al centro del cerchio di 10 mm e premere fermamente per creare un foro per formare un " ciambella "-come disco che verrà utilizzato come una stecca.

2. animali da esperimento

1. uso 8 settimane di età (22-26 g) topi SKH-1 maschi da un allevatore commerciale. Tenere i topi in condizioni standard di 21 ° C e un ciclo luce-buio di 12 ore con accesso gratuito per cibo e acqua.
2. Per indurre il diabete, iniettare topi intraperitonially con un 13 mg/ml streptozotocin (STZ) solutionand 25% glucosio (250 µ l / mouse) su 5 giorni consecutivi.
   1. Rendono la soluzione STZ di diluzione 65 µ g di STZ a 5 µ l di 100 mM acido citrico, pH 4.5.
   2. Regolare il volume iniettato per ogni mouse ad una massa finale di 65 mg STZ per 1 kg di peso corporeo del mouse. Iniettare topi di controllo con pH di soluzione acido citrico 100 mM 4.5 negli stessi giorni.
3. Confermare l'iperglicemia di monitoraggio della glicemia con un glucometro 14 giorni dopo l'ultima iniezione di STZ. Topi diabetici possono avere poliuria e così loro biancheria da letto potrebbe essere necessario essere cambiato più frequentemente per eliminare umidità e loro pesi devono essere controllati 3 volte a settimana.

3. Biofilm

1. Biofilm preparazione
   1. Grow Colonia biofilm ⁸ per inoculare le ferite. Due giorni prima dell'inizio della chirurgia una pernottamento cultura di bioluminescenti p. aeruginosa Xen 41 in brodo di soia triptico (TSB) incubate a 37 ° C e agitazione a 200 giri/min e sterilizzare i filtri a membrana in policarbonato con pori di 0,2 µm dall'esposizione ai raggi UV luce in una cappa di sicurezza biologica per 15 min per lato.
   2. Un giorno prima dell'intervento chirurgico centrifugare cultura durante la notte a 20.000 x g per 2 minuti e lavare 3 volte con 1 mL di Dulbelcco ' s soluzione tampone fosfato (DPBS) pipettando su e giù.
   3. Diluire sospensione in DPBS per un'assorbanza di 0.05 a 600 nm.
   4. Pipetta 10 µ l della cultura diluito su ogni membrana che riposa su una piastra di agar (TSA) di soia triptico. Dopo aver lasciato asciugare, incubare le membrane a 35 ° C per 72 h a crescere biofilm trasferimento a piatti freschi di TSA ogni 24 h.
2. Curva standard
   1. prima dell'inizio dell'esperimento fare una curva standard per correlare i conteggi di bioluminescenza e batterico.
   2. Preparare il biofilm come descritto in 3.1.
   3. Effettuare diluizioni seriali del biofilm che vanno da ½ a 1/24 di biofilm di miscelazione con DPBS e nel vortex fino a produrre una soluzione visivamente omogenea. Pipetta 200µL delle soluzioni diluite in un nero piastra a 96 pozzetti e immagine con l' in vivo imaging system.
   4. Diffondere le diluizioni di piastra sulle piastre TSA e incubare a 35 ° C per 24 h.
   5. Contare unità formanti colonia (UFC) su piastre e creare una curva standard per correlare i conteggi di bioluminescenza e batterico.

4. Ferita di chirurgia

1. indurre anestesia generale utilizzando isoflurano in 95% oxygen/5% CO ₂ (per impedire la morte da chetoacidosi) ad una portata di 1 L/min e mantenere l'anestesia con isoflurano 1-3%. Mantenere gli animali su stuoie di calore durante la chirurgia.
2. Garantire i riflessi profondi pedali del mouse vengono eliminati per pizzicare il piede con una pinzetta e posizionare il mouse nella posizione incline.
3. Amministrare meloxicam (0,2 mg/kg) tramite iniezione sub-cutanea (30 μl) per la gestione del dolore.
4. Pulire la pelle del dorso con povidone-iodio 10% tre volte e un pad di isopropanolo.
5. Usare un pugno di biopsia sterile 4 mm per delineare un modello circolare per la ferita su un lato del mouse ' linea mediana di s a livello delle spalle. Il modello di struttura con un pennarello indelebile.
6. Utilizzare il forcipe dentato per sollevare la pelle nel mezzo la muta e iris forbici per creare una ferita di pieno-spessore che si estende attraverso il tessuto sottocutaneo, tra cui il carnosus del pannicolo e asportare la parte circolare del tessuto.
7. Applicare un collante adesivo medico impermeabile di pelle sulla pelle dei topi e posizionare la stecca in silicone applicando una lieve pressione. Coprire la ferita con una medicazione occlusiva trasparente. Dopo la chirurgia, individualmente gabbia animali.

5. Gestione postoperatoria

1. amministrare meloxicam (0,2 mg/kg) una volta al giorno tramite iniezione sub-cutanea per alleviare il dolore post-operatorio per i prossimi 2 giorni.
2. Animali monitor quotidiano per manifestazioni di perdita di peso e di dolore. Gli animali diabetici hanno bisogno di iniezioni di insulina quando hanno perso 15% o più del peso corporeo.

6. Preparazione dell'inoculo di biofilm e infezione

1. inoculare topi 48 h dopo l'intervento chirurgico, come descritto nei passaggi seguenti.
2. Raschiare 72 h biofilm dalle membrane usando una spatola sterile, metterlo in una provetta da microcentrifuga e diluire 1:2 in DPBS. Mix pipettando brevemente su e giù.
3. Piastra di diffusione dell'inoculo sulle piastre TSA per calcolare il totale CFU. Per assicurare che i conteggi siano accurati, abbattere l'inoculo di biofilm ulteriormente da una serie di due passaggi di Vortex 1 min intercalate da un passo di sonicazione 2 min a 40 kHz in ultrasuoni.
4. Rimuovere la copertura di medicazione la ferita e silicone della stecca e prendere un Micrografo della ferita con un microscopio con fotocamera collegata utilizzando un righello per riferimento.
5. Tagliare le punte dei puntali per pipette 200 µ l e Pipettare 10 µ l di inoculo biofilm su ogni ferita.
6. Immagine mouse utilizzando lo in vivo imaging sistema utilizzando le impostazioni auto: tempo di esposizione 5-300 s, con medie binning, 1 f/stop e filtro aperto e di campo C (12,9 x 12,9 cm).
7. Copertura della ferita con condimento fresco.

7. Misurazione della ferita e la formazione immagine

1. valutare i segni clinici di animali giornaliero ⁹.
2. Fornire cibo, acqua e modificare, se necessario, gabbie.
3. Controllo integrità di medicazioni ogni giorno. Quando la medicazione è presente, può essere misurata solo bioluminescenza dovuto l'occlusione della ferita. Al giorno 8, medicazioni vengono rimosse e non sostituito misura permettendo di chiusura della ferita.
4. Pesare gli animali ogni giorno.
5. Per tutti i giorni, posto topi singolarmente in una camera di isolamento dotato di un filtro HEPA e immagine utilizzando l' in vivo imaging sistema ogni giorno o ogni altro giorno fino a quando i valori di luminescenza cadano sotto il livello di sfondo.
6. Dopo giorno 8, indurre l'anestesia generale e prendere micrografie della ferita con un microscopio con fotocamera collegata utilizzando un righello per riferimento ogni altro giorno fino a quando le ferite sono guarite.

8. L'analisi istologica

1. Euthanize i topi con un flusso di 2 l/min di CO ₂ in un'eutanasia dell'alloggiamento dopo luminescenza scende sotto livelli di fondo e le ferite sono guarite completamente. Confermare la morte di dislocazione cervicale come un secondo metodo di eutanasia.
2. Utilizzare forbici iris per creare un'ampia e completa asportazione intorno e sotto la zona ferita (circa 1 cm di diametro) e conservare i tessuti in paraformaldeide al 4% per l'analisi istologica.
3. Altre analisi: rilevamento di citochina
   1. raccogliere retrò-orbitally sangue da animali sotto anestesia utilizzando un tubo di vetro capillare e trasferirlo in provette EDTA-trattati.
   2. Centrifugare il sangue a 2.000 rpm per 20 min a 4 ° C e il congelamento del plasma per il rilevamento di citochina.

Risultati

Nello sviluppo di questo nuovo modello, abbiamo osservato molti vantaggi nell'utilizzazione glabri SKH-1 sopra i topi C57BL/6J, che abbiamo usato in passato. Animali sottoposti a iniezioni di STZ normalmente verificano perdita di peso graduale con l'inizio del diabete; Tuttavia, nella ferita precedentemente guarigione esperimenti condotti dai nostri laboratori che riproducono il modello presentato da Dunn et al. (2012) ⁹ utilizzo C57BL/6J, drastica perdita...

Discussione

Qui descriviamo un nuovo modello murino per lo studio dei biofilm nelle ferite croniche diabetiche che ha molti vantaggi per creare un modello riproducibile, traducibile e flessibile.

La prima innovazione è l'uso di topi glabri. Altri modelli del mouse sono stati sviluppati per studiare diabetica ferita cronica guarigione^10,11, ma tutti hanno fatto affidamento sull'uso dei topi dai capelli che richiedono la rimozione della pelliccia d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Opsite	Smith & Nephew	Model 66000041	Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards
SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr	Charles River Breeding Laboratories	SKH1	Hairless mice, 8 weeks old
Streptozotocin (STZ)	Sigma Aldrich	S0130-1G	Streptozocin powder, 1g
AccuChek glucometer	Accu-Chek Roche	Art No. 05046025001	ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit
Pseudomonas aeruginosa Xen 41	Perkin Elmer	119229	Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa
Polycarbonate membrane filters	Sigma Aldrich	P9199	Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size
Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS)	Sigma Aldrich	D8537	PBS
Tryptic soy agar	Sigma Aldrich	22091	Culture agar
Meloxicam	Henry Schein Animal Health	49755	Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection
10% povidone-iodine (Betadine)	Purdue Products LP	301879-OA	Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case
4% paraformaldehyde	Fisher Scientific	AAJ61899AK	Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS
Capillary glass tube	Fisher Scientific	22-362-566	Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes
Silicone to make splints	Invitrogen Life Technologies Corp	P-18178	Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets
Tryptic soy broth	Sigma Aldrich	22092	Culture broth
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262	In vivo imaging system
IVIS Spectrum Isolation chamber	Perkin Elmer	123997	XIC-3 animal isolation chamber
HEPA filter	Teleflex	28022	Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022
Biopsy punches	VWR International Inc	21909-142	Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50.
Biopsy punches	VWR International Inc	21909-140	Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50.
Glucose	J.T.Baker	1916-01	Dextrose, Anhydrous, Powder
Citric acid	Sigma Aldrich	C2404-100G	Citric Acid
Mastisol	Eloquest Healthcare	HRI 0496-0523-48	Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48
Corning 96-well black plates	Fisher Scientific	07-200-567	96-well clear bottom black polysterene microplates
25 gauge 5/8 inch needle	BD	305122	Regular bevel needle
Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath	Branson Ultrasonics	N/A	Ultrasonic Cleaner