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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Abbiamo dimostrato un metodo per l'immagine di molteplici molecole all'interno di nano-strutture eterogenee alla precisione di una singola molecola utilizzando il legame sequenziale e l'eluzione di anticorpi a fluorescenza.

Abstract

Imaging di strutture cellulari eterogenee utilizzando la microscopia di localizzazione a singola molecola è stata ostacolata da inadeguate capacità di localizzazione e di multiplexing. Utilizzando marcatori fiduciari a fluorescenza nano-diamante, descriviamo le procedure di correzione e di allineamento necessarie per ottenere un'elevata precisione nella microscopia di localizzazione singola molecola. Inoltre, viene descritta una nuova strategia di multiplexing, madSTORM, in cui molecole multiple sono mirate nella stessa cellula usando sequenziali e eluendo degli anticorpi fluorescenti. MadSTORM è dimostrato su una cellula T attivata per visualizzare le posizioni di diversi componenti all'interno di una struttura a più proteine ​​legata alla membrana chiamata microcluster del recettore cellulare T. Inoltre, viene discussa l'applicazione di madSTORM come strumento generale per la visualizzazione di strutture multi-proteine.

Introduzione

Sono state sviluppate varie tecniche di microscopia super-risoluzione per superare il limite di diffrazione della microscopia leggera (~ 200 nm). Tra queste è una categoria di tecniche chiamate microscopia di localizzazione singola (SMLM) che comprende microscopia di localizzazione foto-attivazione (PALM) e microscopia ottica stoccastica di ricostruzione (STORM). Le tecniche SMLM condividono l'uso di fluorofori che possono essere commutati tra stati (fluorescenti) e fuori (scuri / foto-commutati), consentendo la localizzazione sequenziale della fluorescenza da singole molecole 1 , 2 , 3 .

Grazie alla sua compatibilità con i coloranti e microscopi commercialmente disponibili, STORM diretto (dSTORM) è diventato una tecnica SMLM ampiamente adottata 4 . DSTORM riesce a raggiungere normalmente una precisione di localizzazione ~ 10 nm, definita come l'incertezza nel calcolo del centro di un diffractFunzione di diffusione a punti ioni-limitata (PSF). Tuttavia, nonostante l'alta precisione stimata utilizzando gli algoritmi di localizzazione 5 , 6 , 7 , un'accurata determinazione della posizione effettiva delle singole molecole è stata ostacolata da una serie di problemi. Innanzitutto, il movimento meccanico dello stadio microscopico durante l'acquisizione di immagini aggiunge un'incertezza significativa alla precisione di localizzazione. Poiché le immagini SMLM sono ottenute in migliaia di frame di scadenza, i movimenti nano-scala dello stadio microscopico possono compromettere in modo significativo la precisione dell'immagine finale super-risoluzione 8 . Per compensare il movimento della fase durante l'acquisizione dell'immagine, la deriva di fase è comunemente stimata dalla raccolta a regressione di localizzazioni binned dall'immagine stessa (correlazione incrociata) o localizzazioni sequenziali da marcatori fiduciali (correzione fiduciaria) 1 , 9 . CarnQuesti metodi richiedono l'ottimizzazione di più parametri per ogni stack di immagini e non possono rappresentare i movimenti di fase in scala temporanea come la vibrazione meccanica. Nano-particelle d'oro e perline fluorescenti multicolori sono state utilizzate come marcatori fiduciali in SMLM ma non sono foto-stabili e risultano in una precisione notevolmente inferiore dopo la correzione della deriva rispetto ai nano-diamanti fluorescenti (FND) In madSTORM 10 .

Oltre al limite di diffrazione, la microscopia leggera è ulteriormente limitata dai limiti spettrali. La visualizzazione simultanea di bersagli multipli richiede sonde fluorescenti con profili spettrali non sovrapposti, generalmente limitando la microscopia leggera a fluorescenza a 6 colori e SMLM a 2-3 colori 4 , 11 , 12 . Inoltre, l'aberrazione cromatica non lineare provoca un disallineamento di immagini multicolor, wChe richiedono procedure di allineamento estese utilizzando marcatori fiduciali multicolori 8 , 13 . Per ovviare a questi limiti, studi precedenti hanno ripreso obiettivi multipli con fotopolimerizzazione ripetuta o spegnimento chimico dei fluorofori sequenzialmente legati 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Mentre questi metodi possono superare i limiti spettrali della microscopia, il sbiancamento di fluorescenza è noto per essere un processo tossico 20 e uno sbiancamento prolungato o uno spegnimento può causare effetti collaterali indesiderati, come la perdita di reticolazione. Inoltre, l'accumulo di sonde fluorescenti potrebbe portare a blocchi sterici di siti di legame nel campione, impedendo la multiplexing su larga scala e il targeting robusto di epitopi. Per evitare tali interferenze steriche, un recente sHa ottenuto la multiplexing utilizzando uno scambio stocastico di frammenti proteici liberamente diffusi 21 . Mentre questo metodo consente una densa etichettatura delle strutture cellulari, richiede un'ampia preparazione biochimica per isolare i frammenti peptidici, non individuare posizioni singole molecole e non agevolmente agevolare il multiplexing su larga scala utilizzando sonde commercialmente disponibili. Presentiamo un protocollo video dettagliato che descrive il legame sequenziale e l'eluzione di anticorpi fluorescenti per l'imaging dSTORM (madSTORM) multiplexato con dimensioni corporee e l'utilizzo di nano diamanti fluorescenti per ottenere una corretta correzione e allineamento della deriva.

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Protocollo

Attenzione: Prima dell'utilizzo, consultare tutti i fogli di sicurezza relativi ai materiali di sicurezza (MSDS). Molte delle sostanze chimiche utilizzate in questo protocollo sono tossiche e cancerogene. Utilizzare tutte le appropriate pratiche di sicurezza durante l'esecuzione del protocollo, compresa l'uso di controlli ingegneristici (cappa di fumo, custodia di guanto) e dispositivi di protezione individuale (occhiali di protezione, guanti, cappotto di laboratorio, pantaloni lunghi, scarpe chiuse).

1. Imaging multiplo delle cellule T attivate

  1. Anticorpi coniugati direttamente con il colorante Alexa-647 (A647) utilizzando il kit di etichettatura anticorpo Alexa 647. Seguire il protocollo di etichettatura fornito dal produttore.
    NOTA: La dialisi della soluzione anticorpale in 1x PBS è raccomandata prima di questo passaggio per aumentare l'efficacia dell'etichettatura dei contrassegni.
  2. Spin ha etichettato gli anticorpi per 5 minuti a 20,800 rcf e raccoglie il surnatante per rimuovere gli anticorpi aggregati.
  3. Preparazione di copertine fluorescenti a nano diamante
    1. Seguire le camicie a 8 pozzetti (vedi reattivo / elenco di materiali) con 250 μl di polietilen-l-lisina (PLL) di 0.01% per 15 min, aspirare e asciugare a 65 ° C per 30 min. (Nessun risciacquo prima dell'essiccazione).
    2. Preparare una diluizione di 100 nm FND in 1x PBS. Prova le varie diluizioni per assicurare che le FND siano abbastanza visibili in ogni campo di vista nel punto 1.2.7 (usiamo una diluizione 1: 200 di FND fornite dal produttore).
    3. Vortice i FND diluiti per 1 minuto.
    4. Sonicare il surnatante FND per 30 s ad alta potenza.
    5. Incubare il supernatante FND sonico in una camera di copertura a 8 pozzetti rivestiti con PLL per 30 minuti a temperatura ambiente.
    6. Lavare 5x con 1x PBS e visualizzare la camera con FND ricoperta con eccitazione laser da 647 nm sul microscopio TIRF. Idealmente, 4-10 FND individuali dovrebbero essere visibili in un campo di vista data l'opportuna diluizione di FND nel punto 1.2.2 (stiamo usando un obiettivo 100X con 256 x 256 impostazioni di pixel della fotocamera per produrre 61 x 61 μm campo di vista) Con aAlmeno un FND presente in ogni quadrante del campo dell'immagine. Se i FND sembrano essere raggruppati ( cioè FNDs con un segnale significativamente più alto rispetto ai FND circostanti e una funzione di diffusione di punti superiori a 200 nm), centrifugare FND a 6.800 rcf per 1 min e ripetere la procedura di rivestimento utilizzando il supernatante FND.
    7. Aggiungere in ciascun pozzetto 250 μl di anticorpo anti-CD3 (10 μg / ml) e incubare per 1 ora a 37 ° C o per una notte a 4 ° C.
    8. Rimuovere la soluzione e aggiungere 1x PBS per 30 sec. Ripetere questo passaggio di lavaggio 5 volte (lavare 5 volte).
  4. Attivazione delle cellule T Jurkat
    1. Spinare 1 ml di cellule T Jurkat a 800 rcf per 6 min e risospendere in 300 μl 1x soluzione HBS. Le cellule T Jurkat dovrebbero essere in una concentrazione di 0,5-1,0 x 10 6 cellule / ml prima della filatura. La soluzione 1x HBS è costituita da una soluzione salina di tampone HEPES con 1% di albumina di siero bovino come descritto in precedenza 22 .
    2. Aggiungere 150 μLDi 1x soluzione HBS in ciascun pozzetto e incubare a 37 ° C per 15 minuti.
    3. Aggiungere ogni 50 μL di cellule Jurkat T resuscitate a ciascun pozzetto e incubare per 3 minuti a 37 ° C.
    4. Aggiungere 300 μl di 4% di paraformaldeide ad ogni pozzetto e incubare per 30 minuti a 37 ° C.
    5. Lavare 3x con 1x PBS.
    6. Permeabilizzare le cellule aggiungendo 250 μl di soluzione 0.1% di Triton-X per 5 minuti a temperatura ambiente.
    7. Lavare 3x con 1x PBS.
    8. Aggiungere 250 μL di 1% di gelatina di pesce in 1x PBS a ciascun pozzetto per 30 minuti a temperatura ambiente.
    9. Lavare 3x con 1x PBS.
  5. L'imaging ha attivato le cellule di Jurkat T usando madSTORM
    1. Aggiungere 200 μL di anticorpi etichettati a 0,1-0,5 μg / ml alle cellule fisse per 1 ora a temperatura ambiente.
    2. Lavare 5 volte con 1x PBS.
    3. Aggiungere 1 ml di tampone STORM e coprire la camera con una copertura in vetro per limitare l'esposizione all'aria. Il buffer STORM è stato descritto in precedenza 10 . Raccomandiamo maRe il nuovo buffer STORM per ogni ciclo di imaging e ruotare il buffer STORM a 20,800 rcf per 2 minuti per rimuovere i precipitati.
    4. Utilizzando una potenza laser di 647 nm in modalità TIRF, individuare una cella con almeno 3 FND nel campo visivo. Per aiutare a localizzare FNDs, l'eccitazione concomitante con laser da 568 nm può essere utilizzata per aumentare la luminosità del segnale FND.
      NOTA: Le prestazioni della correzione fiduciale media descritta nella sezione 2.1 migliorano con l'inclusione di più FNDs.
    5. Aumenta la potenza laser di 647 nm e acquisisce immagini. In genere acquistiamo 10.000 fotogrammi a 200 ms esposizione, laser da 125 mW 647 nm, obiettivo obiettivo 100X TIRF (1,49 NA), guadagno 100X EM (5 MHz a 16 bit, guadagno di conversione 1). I dettagli della nostra configurazione dell'immagine sono stati descritti in precedenza 10 .
    6. Lavare 5 volte con 1x TBS.
    7. Aggiungere 1 ml o(3,5 M MgCl2, 20 mM PIPES, 0,1% Tween-20, pH 6,5) e incubare a temperatura ambiente per 1 min.
    8. Ripetere l'eluizione 3 volte. (Le esatte condizioni di eluzione e il numero di risciacqui di eluizione necessari per rimuovere il segnale devono essere controllati per ogni anticorpo utilizzato).
    9. Lavare 3x con 1x TBS e aggiungere 1 ml di 1x PBS.
    10. Photobleach con laser a 647 nm ad alta potenza (125 mW) con laser da 405 nm a 2-5 mW per foto-attivare i coloranti A647 in stato scuro. Attendere che tutto il segnale rimanente da un anticorpo non eluso sia fotopolimerizzato. In genere questo richiede 2-5 secondi di esposizione laser. L'acquisizione di immagini di esempio (~ 100 fotogrammi) usando le impostazioni STORM in 1.3.5 dopo l'eluizione e la fotolibrazione è consigliata per confermare la rimozione del segnale.
      In genere rimuoviamo il 99,8% del segnale utilizzando questo metodo. Si consiglia di verificare l'efficienza di eluizione di ciascun anticorpo prima dell'uso in madSTORM come mostrato in precedenza 10 .
    11. Aggiungere 250 μl di 4% di paraformaldeide per 15 min. Questo prEventi reverse-crosslinking di molecole fisse nella cellula.
    12. Lavare 3x con 1x PBS.
    13. Ripetere i passaggi 1.3.1-1.3.12 per l'etichettatura sequenziale di più bersagli. La figura 1 mostra un'immagine composita di molecole multiple in una cellula T attivata Jurkat acquisita utilizzando madSTORM.

2. Correzione di deriva e allineamento di stack di immagini multipli

  1. Correzione drift di pile di immagini madSTORM
    1. Aprire le immagini utilizzando ImageJ. Si consiglia di convertire i file di immagine in un formato TIFF prima di aprirsi in ImageJ. Utilizza ROI rettangolare per selezionare un singolo FND. Riprodurre l'intervallo di tempo per assicurarsi che il FND sia visibile in ogni struttura dello stack di immagini. Utilizza l'analisi di esecuzione nel plugin ThunderSTORM per localizzare l'FND. Per il metodo medio di correzione fiduciale descritto in 2.1.5, è importante che un singolo FND venga localizzato in ogni frame di immagine ( cioè il numero di picchi identificati dovrebbe essere eQual al numero di fotogrammi).
    2. Se il FND non è identificato in ogni fotogramma, seleziona un altro FND. Se si trovano picchi multipli in un unico fotogramma, rimuovere il picco che devia maggiormente dai picchi precedenti.
    3. Ripetere 2.1.2 per ogni FND nello stack di immagini. Tenga presente che alcuni FND non devono essere inclusi nel processo di correzione della deriva in modo che possano servire da indicatore indipendente per la precisione di correzione della deriva come descritto nel punto 2.1.7.
    4. Per una correzione di deriva più veloce e meno precisa, utilizzare la correlazione incrociata o gli algoritmi di correzione fiduciaria inclusi in ThunderSTORM per correggere le immagini FND. Tipicamente, utilizziamo 100 scomparti, 5 ingrandimenti e 0,1 fattori di correzione traiettoria per la correlazione tra croci e 10 rapporti di massima distanza, rapporto di visibilità da 0,1 min, e fattore di levigatura traiettoria 0,01 per la correzione fiduciaria. La correlazione tra croce e la correzione fiduciaria forniscono un file di correzione che può essere applicato ad altri FND per verificare la precisione di correzione della deriva.
    5. Per una correzione più snella e più precisa della deriva, utilizzare l'algoritmo di correzione fiduciale (AFC) media come descritto in precedenza 10 . Questo processo non richiede l'ottimizzazione dei parametri e produce una precisione di localizzazione superiore rispetto a quella prevista dagli algoritmi di localizzazione SMLM. Tuttavia, la correzione media di deriva richiede almeno 4 FND e che i FNDs siano localizzati in ogni struttura dello stack di immagini. La correzione della deriva AFC si esegue meglio con l'inclusione di più FND perché un gran numero di FND localizzati ridurrà l'effetto distorsivo di un picco di outlier in un dato frame.
    6. Localizzare tutte le funzioni di diffusione punti all'interno dello stack di immagini utilizzando ThunderSTORM come descritto in precedenza 10 . In genere usiamo dimensione pixel di 100 nm, fotoelettroni per conteggio A / D di 4,28, livello base A / D count di 100, guadagno EM di 100, PSF: localizzazione Gaussiana integrata, raggio di montaggio a 5 pixel, metodo di adattamento massimo di probabilità e 1,3 Pixel sigma iniziale.
    7. Applicare il fattore di correzione della deriva acquisito da FND a localizzazioni dell'intero stack di immagini. Ispezionare visivamente l'immagine finale per assicurare una corretta correzione della deriva ( Figura 2 ). Il fattore di correzione della deriva risultante deve essere testato in modo indipendente su FND non incluse nella procedura AFC per misurare il livello di precisione di correzione della deriva. La precisione dei FND indipendenti corretti per la deriva dovrebbe essere vicina al valore medio di precisione / incertezza calcolato dall'algoritmo di localizzazione utilizzato nel passaggio 2.1.6.
    8. Ripetere i passaggi 2.1.1-2.1.7 per gli stack di immagini madSTORM di anticorpi sequenzialmente etichettati. Tieni presente che la localizzazione dello stesso set di FND in ogni stack di immagini madSTORM è fondamentale per la seguente procedura di allineamento.
  2. Allineamento delle immagini madSTORM
    1. Calcola la posizione centroid dei FND corretti drift in ogni immagine madSTORM. Per fare questo, trovare l'asse x medio e y poPer ogni FND localizzato e media le posizioni x e y medio di tutti i FND in ogni immagine madSTORM. L'algoritmo dettagliato per questo passaggio è stato descritto in precedenza 10 . Allinea immagini sequenziali di madSTORM usando le posizioni centroid di FND marker fiduciali. Per eseguire l'allineamento, calcolare l'offset tra due immagini madSTORM localizzate sottraendo la posizione centroid di FND nella seconda immagine madSTORM dalla prima. Quindi sottrarti la quantità di offset da tutte le localizzazioni nella seconda immagine madSTORM.
    2. Si consiglia di utilizzare la prima immagine madSTORM come immagine di riferimento e ripetere questa fase di allineamento tra il primo e il terzo, il primo e il quarto ecc. Testare la precisione di allineamento misurando l'offset tra le FND non incluse nel processo di allineamento. Grandi offset possono indicare che diversi gruppi di FND sono stati utilizzati per calcolare le posizioni centroid delle immagini sequenziali madSTORM.
    3. In caso affermativo, passare da 2.2.1 a 2.2.2Ripetere con lo stesso insieme di FND per eseguire l'allineamento.
      NOTA: vengono forniti codici personalizzati sia per la correzione della deriva AFC che per le procedure di allineamento.

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Risultati

L'eluizione sequenziale e il metodo di colorazione sono stati utilizzati per produrre l'immagine madstorm multiplex di microclustri e altre strutture in una cella di Jurkat T attivata ( Figura 1 , allineamenti della cifra di controllo). Ogni immagine pseudo-colorata rappresenta un ciclo di imaging madSTORM acquisito nei passaggi da 1.1.1 a 1.3.13. Come descritto in precedenza 10 , il campo visivo dovrebbe essere monitorato per...

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Discussione

Le procedure di multiplexing sequenziali, di correzione della deriva e di allineamento in madSTORM consentono una visualizzazione precisa e altamente multipleplazionale delle strutture eterogenee nelle cellule. 10 Inoltre, madSTORM evita le limitazioni di STORM multicolore, come l'aberrazione cromatica e le proprietà di scambio fotovoltaico / emissioni sub-ottimali di coloranti rossi non lontani 9 , 12 . Poiché la fase di eluizione ...

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Divulgazioni

Non abbiamo niente da divulgare.

Riconoscimenti

Ringraziamo Xufeng Wu per l'accesso al microscopio STORM. Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma Intramurale di Ricerca del National Cancer Institute (NCI) Centro per la Ricerca sul Cancro e dal National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
8 well coverslip chamberLab-tek155409
0.1% Poly-L-Lysine solutionSigma-AldrichP8920
NV-100 nm Fluorescent Nano-diamondAdamasRed FND
anti-CD3ε antibodyBD Biosciences555329
Bovine serum albumin, Fraction VKSE Scientific98-100P
Triton-XSigma-AldrichT9284
10% ParaformaldehydeEMS15712Carcinogen
Gelatin from fresh water fish skinSigma-AldrichG7041
Alexa 647 antibody labeling kitThermo FisherA20186
Magnesium Chloride hexahydrateSigma-Aldrich138924
PIPESSigma-AldrichP6757
Tween-20Fisher ScientificBP337-500
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM7154Highly toxic, air sensitive
CysteamineSigma-Aldrich30070Highly toxic
Cyclooctatetraene 98%Sigma-Aldrich138924Highly toxic, air sensitive
10x PBSKD MedicalRGF-3210
10x TBSKD MedicalRGF-3385

Riferimenti

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  2. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  3. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
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