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Method Article
Questo manoscritto presenta metodi per l'analisi morfometrica e cambiamenti cellulari all'interno del condilo mandibolare di roditori.
Il giunto temporomandibular (TMJ) ha la capacità di adattarsi agli stimoli esterni, e cambiamenti di carico possa influenzare la posizione dei condili, così come i componenti strutturali e cellulari della cartilagine del condilo mandibola (MCC). Questo manoscritto descrive metodi per l'analisi di questi cambiamenti e un metodo per alterare il caricamento dell'ATM in topi (cioè, alla compressione statica TMJ caricamento). La valutazione strutturale qui illustrata è un approccio semplice morfometriche che utilizza il software Digimizer e viene eseguito nelle radiografie di piccole ossa. Inoltre, l'analisi del cellulare cambia leader alle alterazioni nell'espressione del collagene, rimodellamento osseo, divisione cellulare, e distribuzione di proteoglycan in MCC è descritto. La quantificazione di questi cambiamenti nelle sezioni istologiche - contando i pixel fluorescenti positivi utilizzando software e il mapping di distanza di misurazione di immagine e zona macchiata con Digimizer - è dimostrato anche. I metodi qui illustrati non sono limitati a TMJ murino, ma ha potuto essere usati su altre ossa di piccoli animali da esperimento e in altre regioni di ossificazione endochondral.
TMJ è un unico giunto portante che si trova nella regione craniofacial ed è costituito di fibrocartilagine. Il MCC del TMJ è essenziale per la funzione articolare, compreso movimento della mascella senza ostacoli mentre parlando e masticare, ma esso è influenzato dalle malattie degeneranti, compreso l'osteoartrite1. L'ATM ha la capacità di adattarsi a stimoli esterni e le alterazioni di carico, portando a cambiamenti strutturali e cellulari ai componenti del MCC2,3,4,5. Le proprietà portanti di MCC possono essere spiegate dalle interazioni tra i suoi costituenti, compresa l'acqua, la rete di collagene e densamente proteoglicani. Il MCC ha quattro distinte zone cellulari che esprimono diversi tipi di proteine di collagene e non-collagene: 1) l'area superficiale o articolare; 2) la zona proliferativa, composta di cellule mesenchimali indifferenziate e che risponde al carico di richieste; 3) la zona di prehypertrophic, composto da condrociti maturi esprimendo il collagene di tipo 2; e 4) l'ipertrofica di zona, la regione dove i condrociti ipertrofici esprimendo collagene tipo 10 die e sottoposti a calcificazione. La regione non mineralizzato è ricca di proteoglicani che offrono resistenza alle forze di compressione6.
C'è la mineralizzazione continua alla zona ipertrofica del MCC, dove si verifica la transizione da Condrogenesi ad osteogenesi, garantendo la robusta struttura minerale dell'osso subcondrale del condilo mandibolare7. Cambiamenti cellulari nelle regioni unmineralized e mineralizzate in ultima analisi, portano a cambiamenti morfologici e strutturali nel condilo mandibolare e mandibola. Mantenimento dell'omeostasi cellulare tutte le regioni di MCC e la mineralizzazione della porzione subchondral sono essenziali per la salute, capacità di carico e l'integrità dell'ATM.
Il modello di topo transgenico collagene multipli (come descritto da Utreja et al.) 8 è un ottimo strumento da utilizzare per comprendere i cambiamenti nell'espressione di collagene poiché tutti i transgeni sono espressi in MCC. Per un'approfondita valutazione istologica, macchie istologiche sono utilizzate per studiare la deposizione di matrice, mineralizzazione, proliferazione delle cellule e apoptosi, come pure l'espressione della proteina presso gli strati differenti delle cellule del MCC.
In questo manoscritto, istologico e le analisi morfometriche vengono utilizzate per valutare i cambiamenti strutturali e cellulari nell'osso MCC e subcondrale del condilo mandibola di topi. Inoltre, un metodo di quantificazione delle cellule, per analizzare le immagini istologiche fluorescente e per il mapping di vetrini da microscopio chiaro, è descritto. Compressione statica TMJ caricamento metodo che causa cambiamenti cellulari e morfologiche al MCC e subchondral dell'osso9, è illustrata anche per convalidare i nostri metodi.
I metodi descritti qui possono essere utilizzati per determinare morfometriche e cambiamenti istologici nel condilo mandibolare e mandibola di roditori o di analizzare altre regioni di ossificazione endochondral e la morfologia dei tessuti mineralizzati aggiuntive.
Il Comitato istituzionale cura degli animali del University of Connecticut Health Center ha approvato tutte le procedure di animale.
1. carico compressione statica TMJ: Bocca forzata
Nota: A topi transgenici che harboring reporter fluorescenti per il collagene (Col2a1XCol10a1), gentilmente fornito da Dr. David Rowe (Università del Connecticut), quattro-settimana-vecchi sono stati utilizzati per gli esperimenti descritti in questo manoscritto (n = 8; 4 maschi e 4 femmine). Transgene Col2a1 ciano (blu) è espresso in cellule nella zona prehypertrophic di MCC, mentre il Col10a1 ciliegie (rosse) cellule sono presenti nella regione ipertrofica8 (Figura 1). Topi sono stati divisi ugualmente in due gruppi: 1) il gruppo caricato, dove i topi sono stati sottoposti a compressione statica TMJ caricamento (descritta nel passaggio 2) e 2) il gruppo di controllo, dove i topi hanno ricevuto alcun intervento.
Figura 1. Rappresentante sagittale del condilo di un topo reporter fluorescenti doppio-collagene (Col2a1XCol10a1). Barra della scala = 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 2. Carico di TMJ compressione statica: bocca costretto modello aperto. (A) primavera fabbricato di 0,017 x 0,025 beta titanio lega archwire. (B) il mouse caricato con molla. (C) radiografia di caricato e topi di controllo che mostrano differenze nel posizionamento della mandibola. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
2. fissazione e sezionamento mandibola
3. x-ray Imaging e le misure morfometriche
Figura 3 . Rappresentazione di misure morfometriche della mandibola. (A) utilizzare la barra della scala della radiografia per determinare l'unità (cerchiato in rosso, barra della scala: 10 mm). (B) selezionare i punti anatomici utilizzando lo "stile indicatore 2" (cerchiato in rosso). 1) Condylion; 2) processo incisivo; 3) punto più profondo alla tacca sigmoidea; 4) punto più profondo nella concavità del ramus mandibular; 5) punto più anteriore della superficie articolare condylar; 6) la maggior parte punto posteriore della superficie articolare condylar. Barra della scala: 10mm(C) eseguire misurazioni con la "lunghezza" e "perpendicolare" strumenti (cerchiati in rosso). Misure dal punto 1 al 2: lunghezza mandibola; dal punto 5 e 6: condylar larghezza; perpendicolare dal punto 1 al 4 - 3: lunghezza della testa condylar. Salva misure dalla "lista di misura". Barra della scala = 10 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
4. condilo incorporamento
Nota: Dopo aver preso le immagini radiografiche, le mandibole possono essere incorporate e sezionate per l'analisi istologica.
5. condilo sagittale sezionamento e preparazione del vetrino
6. istologico macchiatura e formazione immagine microscopica
Nota: la maggior parte della colorazione istologica viene eseguita come descritto nella sezione istologica della carta da Dyment et al10.
7. fluorescente quantificazione istologica
Figura 4 . Rappresentazione del transgene Col10a1 quantificazione. (A) selezionare l'area di interesse con lo strumento"lazo" (L). Per cellule Col10a1-positive, selezionare la cartilagine intero mandibular. Salvare il numero di pixel dalla casella "istogramma". (B) selezionare il pixel di interesse, in questo caso, il rosso fluorescente Col10a1 pixel. Si noti che verranno selezionati solo i pixel rossi all'interno dell'area di interesse. Salvare il numero di pixel rossi dalla casella "istogramma". Barra della scala = 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Rappresentazione di quantificazione trappola fluorescente. (A) selezionare l'area di interesse (mandibular dell'osso subcondrale e della cartilagine) e salvare il numero di pixel di questa regione. (B) selezionare i pixel gialli fluorescenti, che rappresenta attività di trappola. Si noti che solo i pixel del TRAP-positivo sarà selezionare. Salvare il numero di pixel selezionati. Barra della scala = 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 . Rappresentazione di quantificazione di EdU. (A) selezionare la regione proliferativa di MCC (lo strato esterno della cartilagine). Selezionare pixel DAPI-positivo e salvare il numero di pixel. (B) selezionare pixel EdU-positiva (giallo fluorescente) e salvare il numero di pixel. Barra della scala = 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
8. quantificazione dello spessore della cartilagine e Proteoglycan distribuzione
Figura 7 : Rappresentazione del proteoglicano quantificazione di distribuzione. (A) utilizzare la barra della scala dell'immagine istologica per determinare l'unità facendo clic sul pulsante "unità" (cerchiato in rosso, unità di misura selezionata: 500 µm). (B) misurare lo spessore della cartilagine in posizioni diverse utilizzando lo strumento di "lunghezza" (cerchiato in rosso). Salvare le misurazioni dalla "lista di misura" nel riquadro in alto a destra. Il software fornisce anche "statistiche" nel pannello destro inferiore, quindi la media e la deviazione standard delle misurazioni possono essere ottenuti direttamente. (C) misurare l'area di tinto blu di toluidina utilizzando lo strumento di "area" (cerchiato in rosso). L'area di interesse del cerchio e salvare la misurazione dalla "lista di misura". Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Statistiche descrittive sono state effettuate per esaminare la distribuzione delle misure morfometriche (lunghezza mandibular, condylar lunghezza, larghezza condylar) e le analisi istologiche. I risultati sono stati confrontati fra il gruppo caricato (cioè, i topi sottoposti a carico di compressione con la molla in titanio beta) e il gruppo di controllo (cioè, i topi di controllo che non hanno ricevuto alcuna procedura di corrispondenza). Differenze statisticamente sig...
Questo manoscritto descritto metodi per la misurazione di morfometrica e analisi cellulare del murini condili mandibolari e mandibole. Le misure morfometriche radiografica è utilizzabile anche per analizzare altre ossa da piccoli animali da esperimento. Inoltre, l'analisi cellulare (cellule quantificazione e mappatura di distanza di cartilagine) non sono limitati al condilo mandibola roditore, ma può essere utilizzato per quantificare le sezioni istologiche di numerosi tessuti.
Modelli di to...
Gli autori non hanno nessun concorrenti interessi finanziari.
Gli autori vorrei ringraziare il Dr. David Rowe per gentilmente fornire i topi transgenici e Li Chen per l'assistenza istologico.
La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Institute of Dental & Craniofacial Research del National Institutes of Health, sotto Premio numero K08DE025914 e dalla associazione americana di Fondazione ortodontico per Sumit Yadav.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
MX20 Radiography System | Faxitron X-Ray LLC | ||
Digimizer Image software | MedCalc Software | ||
Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
Manual microscope Axio Imager Z1 | Carl Zeiss | 208562 | |
yellow fluorescent protein filter - EYFP | Chroma Technology Corp | 49003 | |
cyan fluorescent protein filter - ECFP | Chroma Technology Corp | 49001 | |
red fluoresecent protein filter - Cy5 | Chroma Technology Corp | 49009 | |
sodium acetate anhydrous | Sigma-Aldrich | S2889 | |
sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729 | |
sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
ELF97 substrate | Thermo Fisher Scientific | E6600 | |
ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit | Life Technologies | C10339 | includes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Scientific | D1306 | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S3264 | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71505 | |
Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
Adobe Photoshop | Adobe Systems Incorporated | ||
Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Research Products International | P32080-100T | |
CNA Beta III Nickel-Free Archwire | Ortho Organizers, Inc. | ||
GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. |
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